白 優(yōu) ,張 勇 *,陳 祥 ,2,張 雄 ,李 俊 ,3,何 琦 ,楊 紅 ,陸 靜

（1.貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025；2.貴州省生豬健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，貴州貴陽550025；3.貴州省種畜禽種質(zhì)測定中心，貴州貴陽 550025）

3個(gè)品種豬MEF2D基因啟動(dòng)子多態(tài)及其生物信息學(xué)分析

白 優(yōu)1,張 勇1*,陳 祥1,2,張 雄 ,李 俊1,3,何 琦1,楊 紅1,陸 靜1

（1.貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025；2.貴州省生豬健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，貴州貴陽550025；3.貴州省種畜禽種質(zhì)測定中心，貴州貴陽 550025）

研究以從江香豬、杜×長×大外三元雜交豬及貴州宗地花豬為研究對象，采用混合DNA池結(jié)合直接測序技術(shù)篩選豬MEF2D基因5'UTR及第1外顯子區(qū)SNPs位點(diǎn)；同時(shí)利用生物信息學(xué)軟件分析SNPs位點(diǎn)對核心啟動(dòng)子區(qū)、CpG島和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的影響。結(jié)果表明：在豬MEF2D基因5'UTR區(qū)共篩查到4個(gè)SNPs位點(diǎn)，分別為A-511G、T-453A、T-242G和T-180A；生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)T-453A和T-242G位點(diǎn)附近有重要轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)消失和新位點(diǎn)生成，據(jù)此推測豬MEF2D基因5'UTR區(qū)的T-453A和T-242G位點(diǎn)對調(diào)控啟動(dòng)子功能元件可能存在重要影響。

從江香豬；MEF2D基因；SNP；啟動(dòng)子；生物信息學(xué)

肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2 （Myocyte Enhancerfactor 2，MEF2）是廣泛存在于肌肉細(xì)胞的DNA結(jié)合活性因子，可與大多數(shù)肌肉發(fā)育相關(guān)基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子結(jié)合，激活其活性。MEF2基因家族的4個(gè)成員（MEF2A、MEF2B、MEF2C、MEF2D）即使是同一物種中也位于不同染色體上。Larsen等[1]將豬MEF2A、MEF2C和MEF2D基因分別定位于1、2號和4號染色體。Wagenknecht等[2]在豬MEF2D基因第4內(nèi)含子發(fā)現(xiàn)一處C-T突變，且該基因被定位于4q，該區(qū)域已定位多個(gè)QTL與胴體性狀和生長速度相關(guān)[3]。陳磊[4]對幾種豬MEF2D基因第4內(nèi)含子Aci I位點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)瘦肉率、眼肌面積較高的個(gè)體h等位基因占優(yōu)勢，但h等位基因?qū)θ馍偷嗡畵p失不利。MEF2D基因主要調(diào)控肌肉和神經(jīng)細(xì)胞的分化與存活[5]。研究表明，果蠅體中幾乎全部的成肌細(xì)胞在MEF2D基因發(fā)生突變時(shí)停止分化[6]。祁艷霞等[7]發(fā)現(xiàn)，南陽黃牛3月齡到24月齡背最長肌組織中MEF2D 基因表達(dá)趨勢為先升高后降低，且18月齡和24月齡表達(dá)量顯著高于3月齡階段。Neely等[8]發(fā)現(xiàn)，由于MEF2D基因mRNA選擇性剪切，出生后的老鼠比出生前多了b外顯子；含b外顯子的MEF2D剪切體在出生后的老鼠心肌中起主導(dǎo)作用并隨心肌的發(fā)育成熟表達(dá)量逐漸上調(diào)。程波[9]對山羊的MEF2D基因進(jìn)行mRNA表達(dá)水平研究發(fā)現(xiàn)，該基因僅心肌和骨骼肌隨年齡增加表達(dá)量逐漸上升。

啟動(dòng)子DNA 序列主要位于結(jié)構(gòu)基因 5'-端上游，轉(zhuǎn)錄起始的特異性在于能活化RNA聚合酶并準(zhǔn)確與模板 DNA結(jié)合。基因表達(dá)調(diào)控可以在復(fù)制、擴(kuò)增、基因激活、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯和翻譯后等多級水平上進(jìn)行，最重要的調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄起始階段。因此，啟動(dòng)子是基因表達(dá)所必需的重要序列信息。所以，真核生物啟動(dòng)子預(yù)測在基因分析中有重要研究意義。目前，鮮見關(guān)于豬MEF2D基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性研究報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)以3個(gè)不同品種豬為研究對象，篩選豬MEF2D基因啟動(dòng)子區(qū)SNPs位點(diǎn)，且結(jié)合生物軟件預(yù)測分析，以期為從江香豬MEF2D基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)調(diào)控及其突變位點(diǎn)與從江香豬產(chǎn)肉性狀等方面研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 貴陽市烏當(dāng)區(qū)綠生源香豬養(yǎng)殖場采集從江香豬52個(gè)血樣，貴陽市臺(tái)農(nóng)種豬養(yǎng)殖基地采集杜×長×大外三元豬46個(gè)血樣，貴州紫云縣宗地鄉(xiāng)養(yǎng)豬場采集貴州宗地花豬36個(gè)血樣。豬前腔靜脈采集血液， EDTA-K2抗凝，標(biāo)記后放入冰盒，每個(gè)樣品約1 mL，帶回實(shí)驗(yàn)室提取DNA。

1.1.2 主要試劑 DL 2000 DNA Marker、Goldview染料、Mixture溶液、上海生工Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒等；TAE緩沖液等由貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自備。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 構(gòu)建DNA混池 上海生工Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，紫外分光光度計(jì)測DNA濃度3次，取平均值，然后均稀釋到100 ng/μL濃度。同一豬種樣品各取5 μL構(gòu)建DNA混池。

1.2.2 設(shè)計(jì)引物 根據(jù)GenBank公布的豬MEF2D基因（登錄號: NC_010446.4），搜索豬MEF2D 基因啟動(dòng)子序列。Primer 5. 0設(shè)計(jì)擴(kuò)增 MEF2D 基因5'UTR區(qū)及第1外顯子區(qū)1對引物，引物信息詳見表1。引物由上海生工進(jìn)行合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 將構(gòu)建好的DNA混池進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系10 μL：基因組DNA 1 μL，上、下游引物（10 pmol/μL）各 1 μL，2×Taq PCR Master Mix 試劑 5 μL，雙蒸水 2 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，61℃退火30 s；72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，72℃終延伸2 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。

1.2.4 SNPs篩選及等位基因頻率估算 擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行雙向測序。利用BLAST篩選確定SNPs位點(diǎn)；運(yùn)用MWSnap.3軟件中的標(biāo)尺測量各SNPs位點(diǎn)等位基因的相應(yīng)峰高，根據(jù)fi=hi/（h1+h2）（i=1,2）估算等位基因頻率。公式fi=hi/（h1+h2）（i=1,2）中，fi表示 SNP位點(diǎn)某等位基因頻率，h1與h2分別表示測序峰圖上該等位基因1、2峰的高度[10]。

1.2.5 生物信息學(xué)預(yù)測 采用生物信息學(xué)軟件分析豬MEF2D基因啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控元件（轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、核心啟動(dòng)子區(qū)及CpG島范圍），并將結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因擴(kuò)增結(jié)果 在凝膠成像系統(tǒng)中觀察可知，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物條帶特異性良好、清晰整齊、無雜帶，與目的片段大小相符，可進(jìn)行直接測序（圖1）。2.2 序列分析 利用Seqman程序?qū)y序結(jié)果進(jìn)行BLAST篩選，確定SNPs位點(diǎn)。圖2結(jié)果表明，在MEF2D基因的5'UTR區(qū)發(fā)現(xiàn)4個(gè)SNPs位點(diǎn)，分別為A-511G、T-453A、T-242G、T-180A。

表 1 引物序列、片段長度、擴(kuò)增區(qū)域及退火溫度

圖1 電泳檢測MEF2D基因啟動(dòng)子區(qū)PCR產(chǎn)物

圖2 3個(gè)品種豬的SNPs位點(diǎn)測序峰圖

2.3 估算等位基因頻率 利用MWSnap.3軟件標(biāo)尺測量3個(gè)群體豬SNPs位點(diǎn)等位基因峰值，并對各位點(diǎn)等位基因頻率進(jìn)行估算（表3）。4個(gè)SNPs位點(diǎn)分析得出，3個(gè)品種豬中從江香豬與貴州宗地花豬等位基因頻率大致相同，但與外三元（杜×長×大）雜交豬存在明顯差異，尤其T-242G位點(diǎn)。

2.4 MEF2D基因核心啟動(dòng)子范圍預(yù)測 利用3種軟件分別預(yù)測MEF2D基因核心啟動(dòng)子區(qū)域（表4）。3個(gè)軟件對核心啟動(dòng)子區(qū)的預(yù)測評分均不是很高，說明突變前后序列對MEF2D基因核心啟動(dòng)子區(qū)影響不大。

2.5 MEF2D基因CpG島預(yù)測 以CpG島范圍大于200 bp、GC含量大于50.0%、Obs/Exp比值大于0.6為標(biāo)準(zhǔn)，EMBOSS cpgplot等3種生物信息學(xué)軟件預(yù)測序列CpG島。如表5顯示，CpG Island searcher、Webgene 2個(gè)軟件均發(fā)現(xiàn)CpG島，且CpG島的預(yù)測范圍和大小基本相同，但突變前后CpG島數(shù)目和CpG島大小均未發(fā)生改變。

表4 核心啟動(dòng)子區(qū)分析結(jié)果

2.6 MEF2D基因SNPs對轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)影響 軟件預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)對 MEF2D 基因表達(dá)起重要調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，如PPAR、MCP-1、TFⅡ、EIF-1等，且變化明顯（表6）。分析TFsitescan 軟件預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T-453A 突變位點(diǎn)導(dǎo)致 iNOS-ISRE 結(jié)合位點(diǎn)消失，T-242G 導(dǎo)致 AP-2 轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)消失和 NeuroD1-fp5 轉(zhuǎn)錄因子生成（圖3）。Gene-regulation軟件預(yù)測得到T-242G 突變位點(diǎn)導(dǎo)致 Pax-4 生成（評分為8.635）。JASPAR軟件預(yù)測結(jié)果表明，T-242G突變位點(diǎn)導(dǎo)致NFIC轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)消失，突變前主要結(jié)合 TTGGC序列（圖4），突變后序列變?yōu)?GTGGC以致沒有轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)。

3 討 論

表3 3個(gè)群體豬種MEF2D基因SNPs等位基因頻率估算結(jié)果

表5 不同軟件預(yù)測MEF2D基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島結(jié)果

表6 不同軟件對MEF2D基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測結(jié)果

圖3 TFsitescan 軟件預(yù)測突變前和突變后的差異

圖4 JASPAR軟件預(yù)測T-242G突變前結(jié)合序列

啟動(dòng)子通過應(yīng)答一種或多種基因轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因的表達(dá)。臨床腫瘤靶向治療中，啟動(dòng)子應(yīng)用前景廣泛。進(jìn)化過程中，啟動(dòng)子在穩(wěn)定的調(diào)控功能前提下能夠快速地沿不同的方向進(jìn)化，由此可以確定各物種間親緣關(guān)系遠(yuǎn)近。此外，如果生物在進(jìn)化中產(chǎn)生新的序列元件可以與啟動(dòng)子相互作用但不干擾生物原有的表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，且使物種在進(jìn)化上保持優(yōu)勢，那么新產(chǎn)生的元件可在物種中保持下來，并且和其他元件相互協(xié)同優(yōu)化基因的表達(dá)，讓該物質(zhì)具有較大的選擇優(yōu)勢。王鸞鸞[11]RT-PCR結(jié)果顯示，DYRK1A與MEF2D的表達(dá)存在協(xié)同性，MEF2D磷酸化被DYRK1A激活同時(shí)其轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，DYRK1A與MEF2D互相調(diào)節(jié)形成正反饋循環(huán)，共同作用機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。另外，對啟動(dòng)子序列詳盡研究，有助于深入了解其結(jié)構(gòu)，為啟動(dòng)子人工合成及進(jìn)一步研究和利用奠定基礎(chǔ)[12]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，地方豬種與外三元（杜×長×大）雜交豬在T-242G位點(diǎn)存在明顯差異。Lilly等[13]研究發(fā)現(xiàn)，如果敲除MEF2D基因，生物體的骨骼肌及其他肌肉組織的肌細(xì)胞分化會(huì)受到阻礙或停滯。因此，T-242G位點(diǎn)的突變所導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)的改變，可能影響MEF2D基因在肌肉發(fā)生過程中的作用機(jī)制。T-242G位點(diǎn)可能是影響豬肉品質(zhì)的重要突變位點(diǎn)，是控制豬肉質(zhì)性狀的重要標(biāo)記。

MEF2D 基因由于啟動(dòng)子的選擇及 mRNA 選擇性拼接產(chǎn)生多種不同的 MEF2D 蛋白，在神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育和肉質(zhì)性狀中發(fā)揮重要作用[14]。本實(shí)驗(yàn)預(yù)測突變前后的核心啟動(dòng)子區(qū)未發(fā)生差異，原因在核心啟動(dòng)子區(qū)基本位于翻譯起始位點(diǎn)之后，而4個(gè)SNPs位于翻譯起始位點(diǎn)前。對比突變前后序列，CPG島于-150～+53附近。CpG 島多位于基因的啟動(dòng)子區(qū)和第1外顯子區(qū)，長約1 kb[15]。DNA甲基化主要發(fā)生在CpG島，哺乳動(dòng)物CpG位點(diǎn)約 60%～90%呈甲基化狀態(tài)。因此，基因啟動(dòng)子區(qū)CPG島預(yù)測可為研究甲基化奠定理論基礎(chǔ)。3種生物學(xué)軟件預(yù)測分析MEF2D 基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)均有變化，研究發(fā)現(xiàn)很多肌肉特異性基因都由TEF1、SRF、MEF2等轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行調(diào)控[16]。TFsitescan軟件結(jié)果表明，T-453A 突變位點(diǎn)導(dǎo)致 iNOS-ISRE 結(jié)合位點(diǎn)消失，T-242G導(dǎo)致AP-2轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)消失和生成NeuroD1轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)。NeuroD1結(jié)合靶基因的特異序列，激活或阻遏了靶基因的轉(zhuǎn)錄，也可以相同的方式作用其他轉(zhuǎn)錄因子，如PDX1、Neurogenin3等協(xié)同調(diào)節(jié)靶基因的最終活性狀態(tài)[17]。Generegulation軟件得到T-242G突變位點(diǎn)導(dǎo)致Pax-4生成，而抑制作為胰腺發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子Pax-4，在胰腺β細(xì)胞的發(fā)育分化中具有重要作用。JASPAR軟件預(yù)測表明，T-242G突變位點(diǎn)導(dǎo)致NFIC轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)消失。NFIC通過與組蛋白競爭DNA的結(jié)合位點(diǎn)或者通過 NFI-C/CTF1中C 末端的反式激活區(qū)和組蛋白 H3 相互作用，移位抑制性組蛋白，行使轉(zhuǎn)錄活性作用[18]。 NFIC/CTF1 富含脯氨酸區(qū)的C末端在體內(nèi)還可與TAFⅡ、P300 等多種輔激活蛋白發(fā)生協(xié)同作用。同樣，NFIC可競爭性結(jié)合與其他有激活作用的反式作用因子結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄。雖然3個(gè)軟件預(yù)測得到的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)不一致，但均由突變位點(diǎn)T-453A和T-242G造成。除了上述轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)差異外，MEF2D基因啟動(dòng)子序列中含有PPAR、MCP-1、TFⅡ等轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)，這些位點(diǎn)與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控也有著密切的聯(lián)系，因此，推測豬MEF2D基因5'UTR區(qū)域的T-453A和T-242G位點(diǎn)對調(diào)控啟動(dòng)子功能元件有重要影響。

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the Polymorphisms and bioinformatics of Promoter Region of MEF2D Gene in Congjiang Xiang Pig

BAI You1, ZHANG Yong1*, CHEN Xiang1,2, ZHANG Xiong1, LI Jun1,3,HE Qi1, YANG Hong1, LU Jing1

(1. Key Laboratory mountain Plateau Animal Genetics and Breeding, Ministry of Education; Key Laboratory of Animal Genetics, Breeding and Reproduction in Guizhou; College of Animal Science, Guizhou University, Guizhou Guiyang 550025, China; 2.Healthy Breeding Pigs Engineering Technology Research Center of Guizhou Province, Guizhou Guiyang 550025, China; 3. Guizhou Germplasm Determination Center of Livestock and Poultry, Guizhou Guiyang 550025, China)

The Congjiang Xiangpigs, the commercial crossbred pigs as well as the Guizhou Zongdi Huapigs as research animals. were used to screen the gene MEF2D of 5ˊUTR and the SNPs sites in part first exon region by using DNA pool and PCR direct sequencing. Variety bioinformatics softwares were used to analyse the SNPs sites how to affect the core region of the promoter, transcription factors binding sites and CpG island. The results showed there were four SNPs sites in the 5ˊUTR regions of MEF2D, including A-511G, T-453A, T-242G and T-180A. It was identified that various new transcription factors binding sites emerged and some significant transcription factors binding sites disappeared nearby the region at T-453A and T-242G site. So we speculated that T-453A and T-242G site locating MEF2D ˊ 5ˊ UTR have a deep effect on regulating the functional element of promoter.

Congjiang Xiang Pig; MEF2D gene; SNP; Promoter; Bioinformatics

S828.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-10-034

2017-03-06；

2017-08-10

貴州大學(xué)引進(jìn)人才科研項(xiàng)目[貴大人基合字2013（21）號]；貴州省工程中心建設(shè)項(xiàng)目（黔科合農(nóng)C字[201 1]4022號）

白優(yōu)（1992-），女，山東人，碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種與種質(zhì)資源創(chuàng)新，Email：zzycbaiyou@163.com

*通訊作者：張勇（1975-），男，博士，副教授，主要從事動(dòng)物遺傳育種教學(xué)與科研工作，Email：as.yzhang@gzu.edu.cn