唐躍輝，劉 坤，趙君葦，徐克東，張 菊，包欣欣，張 怡，李曉麗，齊 靜，于德水，王 健，李成偉*

(1.周口師范學(xué)院 植物遺傳與分子育種重點實驗室，河南 周口 466000；2.河南省作物分子育種與生物反應(yīng)器重點實驗室，河南 周口 466000)

麻瘋樹JcWRI1基因啟動子克隆及功能分析

唐躍輝1,2，劉 坤1,2，趙君葦1,2，徐克東1,2，張 菊1,2，包欣欣1,2，張 怡1,2，李曉麗1,2，齊 靜1,2，于德水1,2，王 健1,2，李成偉1,2*

(1.周口師范學(xué)院 植物遺傳與分子育種重點實驗室，河南 周口 466000；2.河南省作物分子育種與生物反應(yīng)器重點實驗室，河南 周口 466000)

WRI1基因在控制從碳水化合物到脂類的轉(zhuǎn)化過程中起著重要的作用。通過qRT-PCR方法分析了JcWRI1在麻瘋樹不同組織中的表達(dá)特性，結(jié)果表明：JcWRI1主要在種子中表達(dá)。同時克隆了麻瘋樹JcWRI1基因起始密碼子上游2 000 bp序列。序列分析表明，該序列不僅包含有TATA-box和CAAT-box基本元件,而且含有胚乳表達(dá)所需的順式調(diào)控元件、脫落酸應(yīng)答相關(guān)順式作用元件、光響應(yīng)元件及各種脅迫響應(yīng)元件。將該啟動子與GUS報告基因連接構(gòu)建表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化水稻。GUS組織化學(xué)染色分析結(jié)果表明，JcWRI1啟動子驅(qū)動GUS基因在根、莖、葉中有很低的表達(dá)，然而在種子中具有較高的表達(dá)活性。表明該啟動子主要在種子中表達(dá)，并受多種因子的調(diào)控。

麻瘋樹； 啟動子； 轉(zhuǎn)錄因子；JcWRI1基因

脂類既是植物細(xì)胞重要的貯藏物質(zhì)，也是人類的重要能源物質(zhì)，闡明植物脂類的生物合成和分子調(diào)控機制是培育高含油量作物的重要基礎(chǔ)。近年來，影響脂類合成的轉(zhuǎn)錄因子已引起廣泛的關(guān)注[1-4]。1998年，F(xiàn)ocks等[5]發(fā)現(xiàn)一個影響擬南芥種子儲藏物質(zhì)積累的突變體，因其種皮表面皺褶而命名為wrinkled1(wri1)，該突變體在種子發(fā)育的過程中不能正常地將葡萄糖和蔗糖轉(zhuǎn)化為脂肪酸合成的前體物質(zhì)并且降低了糖酵解途徑一些酶的活性，如質(zhì)體丙酮酸激酶、己糖激酶等的活性，種子的含油量較野生型減少了80%。2004年，Cernac等[6]克隆了AtWRI1基因，該基因編碼1個AP2/ERF家族的轉(zhuǎn)錄因子，包含2個保守的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，其中一個AP2/ERF結(jié)構(gòu)域相當(dāng)保守，另一個保守性稍差，在角果中表達(dá)水平最高，在其他組織如葉、莖、根和花中也均有表達(dá)，過表達(dá)該基因不僅能增加種子的含油量，還能引起幼苗積累三酰甘油。2007年，Baud等[7]研究發(fā)現(xiàn)，WRI1基因受上游因子LEC2的直接調(diào)控。2009年，Maeo等[8]研究表明，過表達(dá)WRI1使脂肪酸代謝途徑的一些基因如編碼乙酰輔酶A羧化酶、酰基載體蛋白、酮脂酰基ACP合酶的基因表達(dá)上調(diào),然而在wri1突變體中，這些基因下調(diào)。目前，在玉米、油菜、蓖麻中也發(fā)現(xiàn)了WRI1基因，并且超表達(dá)該基因增加了種子含油量[9-11]。最近，Li 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，油菜BnWRI1在維持三酰甘油、膜脂和糖在植物體內(nèi)平衡中起重要的作用，并且在油菜中過表達(dá)BnWRI1基因還可以促進油菜提前開花、提高種子油的積累。

麻瘋樹(JatrophacurcasL.)又名小桐子，是大戟科多年生落葉灌木/小喬木。麻瘋樹種子含油量高，種仁含油率在40%～60%，富含18碳脂肪酸，尤其是油酸和亞油酸[13]。前期研究發(fā)現(xiàn)，麻瘋樹JcWRI1基因在種子發(fā)育后期表達(dá)[14]，說明該基因在種子貯藏物質(zhì)的合成中可能起著重要的作用。本研究從麻瘋樹基因組中分離到了長度為2 000 bp的JcWRI1基因啟動子，詳細(xì)分析了該啟動子的序列特征，并在水稻中研究該基因的表達(dá)模式，對進一步研究該基因在將糖轉(zhuǎn)化為脂類過程中的作用具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1試驗材料

麻瘋樹引種于貴州黔西，種植在周口師范學(xué)院試驗田。分別選取麻瘋樹的根、莖、葉、花及授粉后35 d的種子用于組織特異性表達(dá)分析，錫箔紙包裹并立即放液氮速凍，然后放于-80 ℃保存待用。

供試水稻材料為粳稻中花11(ZH11)，種植于周口師范學(xué)院試驗田。取14 d水稻幼苗根、葉片，抽穗后5 d的莖及蠟熟期的水稻種子(全部為上位強勢粒)進行GUS染色。用于GUS檢測的樣品取樣處理后直接放37 ℃反應(yīng)。

供試試劑pMD18-T載體、限制性內(nèi)切酶、Taq酶及相關(guān)試劑盒和試劑購自大連寶生物工程有限公司，T4連接酶購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。供試大腸桿菌DH5α、pCAMBIA1391Z表達(dá)載體由河南省作物分子育種與生物反應(yīng)器重點實驗室保存。

1.2試驗方法

1.2.1 麻瘋樹DNA的提取 待麻瘋樹生長3周后，取地上部分葉片用液氮速凍，采用CTAB法[15]提取麻瘋樹DNA。

1.2.2 麻瘋樹RNA的提取 麻瘋樹根、莖、葉、花、授粉后35 d的種子RNA提取使用Magen公司的植物RNA提取試劑盒，參考方法為較難提取植物組織RNA小量提取法。取2 μg 提取RNA作為模板，參照Magen公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行第一鏈cDNA合成。

1.2.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)已經(jīng)建立的麻瘋樹基因組數(shù)據(jù)庫的JcWRI1基因相關(guān)信息設(shè)計引物，引物合成委托北京奧克鼎盛生物科技有限公司進行。

1.2.4 基因表達(dá)分析 以引物JcActionF:5′-TAATGGTCCCTCTGGATGTG-3′;R:5′-AGAAAAGAAAAGAAAAAAGCAGC-3′為內(nèi)參引物，JcWRI1 F:5′-GGAAGAACCAACCGCAGATAG-3′; R: 5′-ACACTTTGCTGTACCATGAAAACAC-3′為定量PCR引物，通過qRT-PCR方法檢測JcWRI1基因在麻瘋樹不同組織中表達(dá)情況，每個試驗設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)設(shè)2個技術(shù)性重復(fù)。

1.2.5JcWRI1啟動子的克隆、檢測及測序 以麻瘋樹葉DNA為模板，以F：5′-TCCCAAAGGCTAAACATAATCTCT-3′; R:5′-TTGTGCCTCGCCTTCTGTTATG-3′為引物，通過PCR擴增JcWRI1啟動子序列。PCR的反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，33個循環(huán)；72 ℃總延伸7 min，16 ℃保溫。取10 μL反應(yīng)液，加入1 μL DNA上樣緩沖液，進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產(chǎn)物分別連接到pMD18-T載體上，通過PCR檢測獲得陽性克隆。陽性克隆送到北京奧克鼎盛生物科技有限公司測序。

1.2.6 序列的生物信息學(xué)分析 經(jīng)Softberry(http://www.Softberry.com)的tssp分析，尋找序列中可能的轉(zhuǎn)錄起始位點和TATA-box。利用在線植物轉(zhuǎn)錄元件工具plantCARE[16]對克隆到的啟動子序列進行分析，尋找可能的植物順式作用元件。

1.2.7 表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)JcWRI1基因啟動子序列設(shè)計引物F：5′-GCTGCTGTCTCATAAACAACAAACT-3′，R:5′-TTTCTGTCTTTCTTTCTTTCTGTGG-3′。以麻瘋樹葉DNA為模板擴增JcWRI1啟動子序列。隨后將該片段連接到pCAMBIA1391Z上的PstⅠ和EcoR Ⅰ位點間，陽性克隆酶切檢測后，將構(gòu)建好的載體送北京奧克鼎盛生物科技有限公司測序。

1.2.8 水稻轉(zhuǎn)基因 水稻愈傷組織的誘導(dǎo)及轉(zhuǎn)基因采用Tang等[17]的方法。

1.2.9GUS基因表達(dá)檢測 取野生型和轉(zhuǎn)基因陽性水稻根、莖、葉和種子進行GUS檢測，組織化學(xué)染色按Jefferson等[18]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1麻瘋樹JcWRI1基因表達(dá)模式分析

以JcWRI1基因(NCBI登錄號：JCGZ_09727)cDNA序列設(shè)計引物，通過qRT-PCR (實時熒光定量PCR) 技術(shù)檢測了JcWRI1基因在水稻不同發(fā)育時期的表達(dá)模式。結(jié)果表明，JcWRI1主要在授粉后35 d種子中表達(dá)，在花中有微弱的表達(dá)，然而在根、莖和葉中表達(dá)更弱或者幾乎檢測不到表達(dá)(圖 1)。

圖1 JcWRI1基因在麻瘋樹根、莖、葉、花和授粉后35 d種子中的定量PCR分析

研究發(fā)現(xiàn)，授粉后29～41 d(種仁灌漿后期)是麻瘋樹種子中貯藏物質(zhì)積累轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵時期[14]。以上結(jié)果表明，JcWRI1可能在麻瘋樹貯藏物質(zhì)積累轉(zhuǎn)化的過程中起關(guān)鍵的調(diào)控作用。

2.2JcWRI1基因啟動子的克隆

根據(jù)麻瘋樹全基因組測序結(jié)果[19]設(shè)計引物，通過PCR擴增獲得了目的條帶(圖2)，回收并連接到pMD18-T載體后送公司測序。測序結(jié)果表明：PCR擴增得到的序列長度為2 042 bp，其3′有部分序列與JcWRI1基因CDS 5′相同，證明該序列是JcWRI1基因起始密碼子ATG的上游區(qū)域。去掉與JcWRI1基因CDS 5′相同的序列，該啟動子DNA片段長2 000 bp。

M：DNA Marker DL2000; 1—2：JcWRI1啟動子目的片段圖2 PCR擴增JcWRI1啟動子電泳圖譜

2.3JcWRI1基因啟動子序列分析

生物信息學(xué)分析顯示(圖3)，該片段包含了翻譯起始密碼子ATG(將翻譯起始密碼子ATG的A定義為+1位)上游2 000 bp序列，獲得的啟動子片段經(jīng)在線軟件tssp分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，-61處的A可能為轉(zhuǎn)錄起始的核心位置。該啟動子除含有TATA-box和CAAT-box基本元件外，還含有脫落酸應(yīng)答相關(guān)順式作用元件(TACGGTC)、胚乳表達(dá)所需的順式調(diào)控元件(GTCAT)、光響應(yīng)元件(TTTCAAA)、與光脅迫相關(guān)的MBS(CGGTCA)和MYB結(jié)合位點(AACCTAA)，說明JcWRI1基因可能在胚乳中表達(dá)并受光和各種脅迫等因素的調(diào)控(表 1)。

2.4JcWRI1基因啟動子植物表達(dá)載體的構(gòu)建

JcWRI1基因啟動子驅(qū)動GUS的植物表達(dá)載體(JcWRI1 pro::GUS)見圖 4。設(shè)計帶PstⅠ和EcoR Ⅰ酶切位點的特異引物，以麻瘋樹葉DNA為模板，通過PCR擴增獲得長2 000 bp的啟動子序列，然后將該序列連接到pCAMBIA1391Z植物表達(dá)載體上，并通過PstⅠ和EcoR Ⅰ對構(gòu)建好的載體進行酶切檢測(圖5)，表明該載體是含有JcWRI1基因啟動子的植物表達(dá)載體，測序結(jié)果也表明連接完全正確。

JcWRI1基因翻譯起始位點ATG和預(yù)測的轉(zhuǎn)錄起始位點A使用雙下劃線表示，JcWRI1基因保守的順式調(diào)控元件使用單下劃線表示圖3 麻瘋樹JcWRI1基因啟動子序列分析結(jié)果

表1 JcWRI1基因啟動子主要順式作用元件

JcWRI1 pro:JcWRI1啟動子；GUS：β-葡萄糖醛酸報告基因；35S polyA:花椰菜花葉病毒基因終止轉(zhuǎn)錄區(qū)； Nos polyA：胭脂氨酸合成酶基因終止轉(zhuǎn)錄區(qū)；Hph：潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因；35S：花椰菜花葉病毒啟動子圖4 JcWRI1 pro::GUS植物表達(dá)載體

M：DNA Marker DL2000; 1—2：酶切 pCAMBIA1391Z-JcWRI1-GUS結(jié)果圖5 JcWRI1基因啟動子植物表達(dá)載體酶切鑒定

2.5JcWRI1基因啟動子在水稻中的表達(dá)特性

以水稻愈傷組織為受體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將構(gòu)建好的JcWRI1啟動子驅(qū)動GUS植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織中，通過潮霉素抗性篩選和PCR技術(shù)鑒定陽性轉(zhuǎn)基因株系，通過T2代分離比，挑選單拷貝插入轉(zhuǎn)基因株系(分離比為3︰1)進行進一步的分析。取野生型和轉(zhuǎn)基因陽性植株的不同組織部位進行GUS染色，結(jié)果表明：野生型的所有組織中都不能檢測到GUS活性(圖6)，轉(zhuǎn)JcWRI1 pro::GUS植株中的根、莖和葉在反應(yīng)體系中反應(yīng)2 h很難檢測到GUS活性，反應(yīng)8 h后才有藍(lán)色產(chǎn)物，而授粉后15 d種子反應(yīng)15 min就可以檢測到GUS活性，然而在胚中沒有檢測到GUS活性(圖 6中箭頭指示方向)。說明JcWRI1基因啟動子的活性表現(xiàn)為水稻種子中明顯高于根、莖和葉中。這種表達(dá)模式與JcWRI1在麻瘋樹不同組織的表達(dá)模式分析結(jié)果相一致。

圖6 JcWRI1轉(zhuǎn)基因水稻和野生型水稻植株的GUS基因表達(dá)檢測

3 結(jié)論與討論

Cernac等[6]的研究表明，AtWRI1基因在豆莢中高表達(dá)，在葉、莖、根和花中也有表達(dá)，功能缺失或過表達(dá)該基因分別致使擬南芥種子含油量降低80%或提高20%。試驗還證明，該基因在35S啟動子操縱下的異位表達(dá)可同時增加種子和幼苗中的含油量[7]。WRI1是AP2/ERF家族中的一員，有關(guān)其他植物WRI1的研究發(fā)現(xiàn)，它對種子油脂積累及相關(guān)代謝活動具有調(diào)控作用[9-11]，所以WRI1基因有可能成為一種新的改良種子含油量的目標(biāo)基因。

本研究對JcWRI1啟動子序列的分析發(fā)現(xiàn)，其包含轉(zhuǎn)錄起始位點上游2 000 bp，除了含有基本的順式作用元件TATA-box、CAAT-box外，還包含多個光響應(yīng)元件、胚乳表達(dá)必需的順式調(diào)控元件、脅迫相關(guān)的元件，這表明JcWRI1基因可能在種子中表達(dá)，并且該基因的表達(dá)也可能受光照、激素以及各種脅迫的調(diào)控。本研究結(jié)果表明，JcWRI1主要在授粉后35 d麻瘋樹的種子中表達(dá)，推測該基因可能與麻瘋樹種子貯藏物質(zhì)的合成積累有關(guān)。通過GUS活性進一步對該基因在水稻中的表達(dá)特性進行分析，也發(fā)現(xiàn)該基因在水稻種子中具有較高的GUS活性，而在其他組織中有微弱的GUS活性。組織特異性表達(dá)啟動子是研究基因功能和改變植物特異性狀的重要工具，通過分子生物學(xué)手段改變稻米品質(zhì)或者改變麻瘋樹種子含油量(因為麻瘋樹含油量主要在種仁或者種子中[13])，需要導(dǎo)入的基因只有在種子專一表達(dá)而在其他組織微弱或者不表達(dá)，才會對植物的生長發(fā)育沒有明顯的影響。因此，本研究將為該啟動子應(yīng)用于麻瘋樹、水稻或其他植物的種質(zhì)改良提供新的資源和依據(jù)。

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Cloning and Functional Analysis ofJcWRI1 Promoter ofJatrophacurcasL.

TANG Yuehui1,2,LIU Kun1,2,ZHAO Junwei1,2,XU Kedong1,2,ZHANG Ju1,2,BAO Xinxin1,2, ZHANG Yi1,2,LI Xiaoli1,2,QI Jing1,2,YU Deshui1,2,WANG Jian1,2,LI Chengwei1,2*

(1.Key Laboratory of Plant Genetics and Molecular Breeding,Zhoukou Normal University,Zhoukou 466000,China; 2.Henan Key Laboratory of Crop Molecular Breeding and Bioreactor,Zhoukou 466000,China)

WRI1 plays an important role in controlling the conversion course from carbohydrates to lipids.We analyzed the expression pattern of theJcWRI1 in different tissues inJatrophacurcasL.by qRT-PCR.The result showed thatJcWRI1 transcripts were predominantly expressed in seeds.On the other hand,the promoter ofJcWRI1 was obtained fromJatrophacurcasL.in this paper.Sequence analysis indicated that the promoter included TATA-box,CAAT-box,and a number of cis-acting elements involved in abscisic acid response,light response,stress response,endosperm-specific expression,respectively.TheJcWRI1 promoter was fused withGUSreporter gene and transferred intoOryzasativaL..Histochemical staining of different organs of the transgenic plants showed that a very lowlyGUSreporter gene expression in root,stem,leaf and higher expression in seed.The results indicated that the promoter functioned in the seed and regulated by multiple factors.

JatrophacurcasL.; promoter; transcription factor;JcWRI1 gene

Q78

A

1004-3268(2017)10-0110-06

2017-05-10

河南省科技開放合作項目(132106000077)；河南省科學(xué)技術(shù)廳科技攻關(guān)項目(152102410074)；2018年度河南省高等學(xué)校重點科研項目(18A180035)；周口師范學(xué)院高層次引進人才科研基金啟動項目(ZKNUC2016030)；周口師范學(xué)院2017年大學(xué)生科研創(chuàng)新基金項目(ZKNUD201701)

唐躍輝(1985-)，男，河南許昌人，講師，博士，主要從事水稻基因克隆與功能研究。E-mail:yhtang2005@163.com

*通訊作者：李成偉(1972-)，男，河南商丘人，教授，博士，主要從事植物與病原菌互作研究。E-mail:lichengweiwau@hotmail.com