成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137

藥物研究

藏藥訶子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究

鄧星茍立平溫倩雯羅莉婭萬麗*

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137

目的提高訶子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法以沒食子酸、訶子對照藥材為對照，新增薄層色譜-生物自顯影鑒別；建立HPLC測定沒食子酸含量的方法，采用Phenomenex luna C18 色譜柱(250mm × 4.6mm，5μm)；流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液(5:95)；流速1.0 mL / min；柱溫30 ℃；檢測波長 271 nm；進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果薄層色譜-生物自顯影法鑒別斑點清晰，分離度好，不僅能對訶子進(jìn)行定性鑒別，還能體現(xiàn)其抗氧化活性；在以上HPLC條件下，沒食子酸在10.72～85.76 μg呈良好線性關(guān)系，線性回歸方程為Y= 31.248X+ 9.037(r=0.9997)，平均回收率96.1%(RSD2.54)。結(jié)論新增的方法簡單易行，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，可用于訶子的質(zhì)量控制。

訶子；薄層色譜-生物自顯影鑒別；含量測定；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

訶子是習(xí)用藏、蒙藥之一，被稱為“藥中之王”，為使君子科植物訶子TerminaliachebulaRetz. 或絨毛訶子TerminaliachebulaRetz, var. tomentella Kurt. 的干燥成熟果實，具有良好的澀腸止瀉，斂肺止咳，降火利咽功效[1]。始載于《新修本草》。訶子主要成分為鞣質(zhì)類、多元酚類、黃酮類、三萜類[2]，鞣質(zhì)類中的沒食子酸為其活性成分，具有抗菌、收斂、止血等功用[3]。2015年版《中國藥典》一部只收載了性狀鑒別、顯微鑒別和薄層色譜鑒別，且操作繁瑣，費時費力，雖然有學(xué)者已對訶子進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[4]，建立了訶子水解產(chǎn)物沒食子酸高效液相色譜含量測定法，但是該方法并不適用于控制目前大多數(shù)含訶子的成方制劑的質(zhì)量，與成方制劑測定的沒食子酸不一致，如三果湯散、三果湯膠囊、潔白丸、西青果顆粒等含訶子的制劑是測定沒食子酸含量并非是水解鞣質(zhì)后得到的總沒食子酸。因此，訶子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有必要進(jìn)一步修訂及提高，本實驗采用HPLC對訶子藥材中沒食子酸進(jìn)行含量測定，以保證含訶子制劑投料的安全、有效。

薄層色譜-生物自顯影是一種將薄層色譜分離和生物活性測定相結(jié)合的藥物篩選方法，具有操作簡單、耗費低、靈敏度高和專屬性強(qiáng)等優(yōu)點是一種快速測定生物活性的方法[5]。DPPH法薄層色譜-生物自顯影技術(shù)中，DPPH 與具有抗氧化活性的物質(zhì)結(jié)合，生成DPPH-H 而呈現(xiàn)白色或淡黃色，薄層板本身顯紫色，從而篩選出抗氧化活性組分[6]。本實驗對不同來源的訶子藥材進(jìn)行薄層色譜一生物自顯影研究，結(jié)合常規(guī)薄層色譜檢識方法，能對抗氧化活性成分沒食子酸進(jìn)行快速鑒別，達(dá)到定性和抗氧化活性檢測的雙重目的。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1200 series 高效液相色譜儀、DAD 紫外檢測器(G1315D)、Agilent Technologies 色譜工作站(美國 Agilent 公司)；KQ3200E型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器公司)；UPT-II-10T優(yōu)普系列超純水器(成都超純科技有限公司)；HX-200型高速中藥粉碎機(jī)(浙江省安康市溪岸五金藥具廠)； 101c-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海實驗儀器廠有限公司)；雙槽展開缸 ( 20cm×10cm) ；BSA-124S(萬分之一)、BT125D(十萬分之一)電子天平(德國 Sartorius 公司)；定量毛細(xì)管。

1.2 材料 10批不同來源訶子藥材，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)盧先明教授鑒定為使君子科植物訶子TerminaliachebulaRetz. 或絨毛訶子TerminaliachebulaRetz,var.TomentellaKurt. 的干燥成熟果實，不同來源訶子藥材見表1。訶子對照藥材(批號：121015-201302，中國食品藥品檢定研究院)；沒食子酸(批號：110831-201605，質(zhì)量分?jǐn)?shù)90.8%，中國食品藥品檢定研究院)；1,1-二苯基苦基苯肼( 1,1 -diphenyl -2- picrylhydrazyl，DPPH ) (CAS：1898-66-4，Sigma 公司)；5 %三氯化鐵乙醇溶液；聚酰胺薄膜(浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠)；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

表1 訶子各樣品來源

續(xù)表

表1 訶子各樣品來源

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜-生物自顯影鑒別

2.1.1 DPPH顯色劑溶液 取DPPH 0.04 g,溶于50 mL無水乙醇溶液中,即得0.08 %DPPH無水乙醇溶液,避光冷藏保存。

2.1.2 對照品溶液的制備 取訶子對照藥材3g,加入乙醇10mL,超聲30min,取上清液，即得；稱取沒食子對照品適量，加乙醇配成0.5mg/mL的對照品溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取不用來源的訶子粉末 3 g,加入乙醇10mL,超聲30 min,取上清液，即得。

2.1.4 點樣量考察 分別對照品及供試品溶液1、2、3μL進(jìn)行考察。以乙酸乙酯-甲酸(3：1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以0.08 %DPPH無水乙醇溶液，置于40 ℃烘箱內(nèi)顯色30 min，于日光下檢視。結(jié)果表明沒食子酸對照品溶液點樣量為以1 μL，供試品溶液點樣量為1μL較好，斑點圓整，清晰。故確定為對照品點樣量1μL，供試品點樣量1μL。

2.1.5 溫度考察 將薄層鑒別實驗在不同的環(huán)境溫度下展開，考察溫度變化對薄層鑒別實驗的影響。分別取對照品溶液、供試品溶液點于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-甲酸(3:1)為展開劑,分別在8℃、25 ℃、35 ℃條件下展開，取出，晾干，噴以0.08 %DPPH無水乙醇溶液，置于40 ℃烘箱內(nèi)顯色30 min，于日光下檢視，結(jié)果表明在不同溫度條件下，對訶子供試品均能起到很好的分離效果。

2.1.6 濕度考察 將薄層鑒別實驗在不同的環(huán)境濕度下展開，考察濕度變化對薄層鑒別實驗的影響。分別取對照品溶液、供試品溶液點于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-甲酸(3:1)為展開劑，分別在為32 %、72 %條件下展開，取出，晾干，噴以0.08 %DPPH無水乙醇溶液，置于40 ℃烘箱內(nèi)顯色30min，于日光下檢視，結(jié)果表明在不同濕度條件下，對訶子供試品均能起到很好的分離效果，表明該鑒別方法耐用性良好。

2.1.7 不同批次訶子薄層色譜-生物自顯影鑒別 對10批不同來源訶子進(jìn)行薄層色譜-生物自顯影鑒別，點于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-甲酸(3:1)為展開劑[7]，展開，取出，晾干，噴以0.08 %DPPH無水乙醇溶液，置于40 ℃烘箱內(nèi)顯色30 min，于日光下檢視，薄層色譜-生物自顯影圖譜，如圖1所示。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Phenomenex luna C18(250mm×4.6mm，5μm)；流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液(5:95)；檢測波長271nm；流速 1. 0mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10μL。對照品和供試品HPLC圖如圖2所示。

2.2.2 對照品溶液、供試品溶液的制備 取沒食子酸對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含25 μg的溶液，即得。

取本品粉末(過三號篩)0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇80 mL，稱定重量，70 ℃加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用 50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 線性關(guān)系考察 精密量取上述對照品溶液1、2、4、6、8 mL分別置于10 mL量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，搖勻，配制成系列濃度的對照品溶液。分別吸取各個濃度的對照品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，按“2.2.1”色譜條件測定峰面積。以質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y= 31.248X+ 9.037，r=0.9997。結(jié)果表明，沒食子酸在10.72～85.76 μg/mL成良好的線性關(guān)系。

2.2.4 精密度試驗 精密吸取沒食子酸對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，計算沒食子酸峰面積的RSD值。結(jié)果顯示，RSD為0.02，表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件，在0、2、4、6、8、12、24 h 進(jìn)樣測定含量，結(jié)果顯示，RSD為1.60，表明沒食子酸在24 h 之內(nèi)含量穩(wěn)定。

2.2.6 重復(fù)性試驗 按“2.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，沒食子酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)9.75 mg/g，RSD為2.3，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 耐用性試驗 以三種不同品牌色譜柱Dikma Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)，Phenomenex Luna C18(250mm×4.6mm，5μm) 和 Inertsil ODS-3(250mm×4. 6mm，5μm)按“2.2.1”色譜條件測定，沒食子酸百分含量結(jié)果分別為0.95%，0.97%，0.98%；28 ℃、30 ℃和32 ℃不同溫度條件下測定結(jié)果分別為0.96%，0.97%，0.97%；0.9mL/min，1.0mL/min，1.1mL/min不同流速條件下測定結(jié)果分別為0.95%，0.98%，0.97%。結(jié)果表明，在測定條件有小的變動時，測定結(jié)果不受影響且滿足系統(tǒng)適用性試驗要求，可認(rèn)為該方法具有可靠性。

2.2.8 加樣回收率試驗 取上述樣品粉末6份，各0.1 g，精密稱定。另取沒食子酸對照品用50%甲醇制成每1 mL含1.001 mg的溶液。分別準(zhǔn)確加入沒食子酸對照品溶液1 mL，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測進(jìn)行定，計算沒食子酸平均加樣回收率為96.1%，RSD為2.54 。結(jié)果見表2。

2.2.9 樣品測定 取不同來源的訶子粉末( 過3 號篩) 0.2 g，精密測定，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，結(jié)果顯示平均含量為1.02 %。擬定本品按干燥品計算，含沒食子酸不得少于0.8% 。結(jié)果見表3。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

表3 10批訶子藥材中沒食子酸含量測定結(jié)果( 按干燥品計)

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別項優(yōu)化 研究發(fā)現(xiàn),硅膠G板對于訶子藥材的分離效果較差,拖尾較為嚴(yán)重。聚酰胺色譜的分配原理為氫鍵吸附,訶子主要含有多羥基的有機(jī)酸類化合物。采用聚酰胺薄膜能較好的對毛訶子藥材進(jìn)行分離,且斑點較為清晰。本實驗采用溶劑作空白對照，無任何斑點干擾。薄層色譜-生物自顯影圖既反映了訶子藥材中沒食子酸成分的有無，實現(xiàn)了傳統(tǒng)薄層鑒別目的，又通過斑點的大小體現(xiàn)出這種成分的活性強(qiáng)弱，并且能發(fā)現(xiàn)訶子中還存在其他活性成分。在鑒別訶子藥材真?zhèn)蔚耐瑫r還能評價其相關(guān)活性成分，以達(dá)到質(zhì)量控制與活性篩選兩個目的。該技術(shù)將訶子中化學(xué)成分的分離與活性評價有機(jī)結(jié)合，它不僅是只針對單一成分，所以能更多的反映出訶子的內(nèi)在質(zhì)量，在對訶子進(jìn)行鑒別時可以將薄層-生物自顯影鑒別和傳統(tǒng)薄層鑒別相結(jié)合，進(jìn)一步豐富訶子的薄層鑒別方法，為訶子的質(zhì)量控制提供更加科學(xué)的依據(jù)。

3.2 含量測定項 沒食酸在(215±1) nm和(271±1)nm波長處都有最大吸收，215nm接近末端吸收，故選擇271nm為測定波長。采用“2.2.1”項下色譜條件可以使分離度大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05之間，具有良好的分離效果。共收集10批不用來源的訶子，擬定本品按干燥品計算，含沒食子酸不得少于1.02 %。本實驗建立的HPLC測定訶子沒食子酸含量方法既可以實現(xiàn)控制訶子藥材的質(zhì)量，又適用于控制當(dāng)前測定非鞣質(zhì)水解總沒食子酸含量的訶子成方制劑的質(zhì)量，因此，表明該質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有可行性。

[1]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(一部)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2015:187.

[2]劉芳，秦紅飛，劉松青．訶子化學(xué)成分與藥理活性研究進(jìn)展[J].中國藥房，2012，23(7) : 670．

[3]丁岡，劉延澤，韓全斌．訶子屬植物化學(xué)成分與生物活性研究進(jìn)展[J]．現(xiàn)代藥物與臨床，1996，11(6) : 255．

[4]盧平華，顏玉貞. 訶子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2002, 13(6): 385-388.

[5]李紹平，趙靜，錢正明，等.色譜技術(shù)在中藥有效成分辨識中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國科學(xué),2010,40(6):651-667.

[6]Corrado M, Rodrigues K F. Antmiicrobial evaluation of fungal extracts produced by entophytic strains of Phomopsis sp.[J].J Basic Microbiol, 2004(44):157.

[7]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典中藥材薄層色譜彩色圖集(一部)[M].北京: 人民衛(wèi)生出版社,2009:399.

ResearchontheImprovementofQualityStandardsofTerminaliachebulaRetz.

DENG Xing WEN Qianwen LUO Liya GOU Liping WAN Li*

School of Pharmacy, Chengdu University of TCM, Chengdu 611137, China

ObjectiveTo improve the quality standards ofTerminaliachebulaRetz.MethodsNew additions to TLC-Bioautography method is based on gallic acid and control herbs as contrast, and combined with traditional TLC identification method for rapid qualitative identification ofTerminaliachebulaRetz. The contents of gallic acid was determined by HPLC.Gallic acid were separated on a phenomenex luna C18 column(250mm×4.6mm,5μm ),using methanol-0.1% phosphoric acid (5:95) as the mobile Phase at a flow rate of 1.0 mL/ min.The column temperature was 30 ℃ and the detection wavelength was 271 nm.The injection volume is 10 μL.ResultsThe spots in TLC were clear and well-separated.Not only on theTerminaliachebulaRetz for qualitative identification, but also reflect its antioxidant activity.The methodology validation for the assay of gallic acid presented that it was in good linear correlation in the ranges of 10.72～85.76 μg with the regression equations ofY= 31.248X+ 9.037(r=0.9997),and the average recoveries were 96.1%(RSD2.54%).ConclusionThese methods are simple, easy,strongly specific and good repeatability,which can be used for the quality control ofTerminaliachebulaRetz.

TerminaliachebulaRetz.;TLC-Bioautography;HPLC;Quality Standard

R284.1

A

1007-8517(2017)18-0012-04

2017-07-11： 編輯：梁志慶)

國家自然科學(xué)基金資助項目(81673653)。

鄧星(1993-)，女，漢族，碩士研究生，研究方向為中藥有效成分分析。E-mail：602079822@qq.com

萬麗(1965-)女，漢族，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為中藥分析研究。E-mail：wanli8801@163.com