張崢嶸，鄭幽，阮班展，王嫚娜，梁劍青，李世崇，黃紅艷，閆敏，陳昭烈，劉真真，孫強(qiáng)

1.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 乳腺科，河南 鄭州 450008；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，腫瘤治療性疫苗北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100038

RRAGD-EGFP融合蛋白在MDA-MB-436細(xì)胞中的表達(dá)定位

張崢嶸1，2，鄭幽2，阮班展2，王嫚娜2，梁劍青2，李世崇2，黃紅艷3，閆敏1，陳昭烈2，劉真真1，孫強(qiáng)2

1.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 乳腺科，河南 鄭州 450008；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，腫瘤治療性疫苗北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100038

目的：構(gòu)建RRAGD-EGFP融合基因表達(dá)載體pQCXIP-RRAGD-EGFP，并檢測(cè)RRAGD-EGFP融合蛋白在MDA-MB-436細(xì)胞中的表達(dá)定位。方法：提取HEK293細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA并擴(kuò)增RRAGD基因，克隆入逆轉(zhuǎn)錄載體pQCXIP-EGFP-N1，病毒包裝后感染人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-436，活細(xì)胞觀察其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)定位。結(jié)果：構(gòu)建獲得逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pQCXIP-RRAGD-EGFP，融合蛋白R(shí)RAGD-EGFP定位于胞漿囊泡和細(xì)胞核。結(jié)論：RRAGD-EGFP融合蛋白在MDA-MB-436細(xì)胞中表達(dá)定位于胞漿囊泡，與其參與溶酶體調(diào)節(jié)功能一致，為后續(xù)分析RRAGD在cell-in-cell中的作用奠定了基礎(chǔ)。

Ras相關(guān)GTP結(jié)合蛋白D（RRAGD）；基因克隆；cell-in-cell

Ras相關(guān)GTP結(jié)合蛋白D（Ras-related GTP binding protein D，RRAGD）由400個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量為45 588。RRAGD基因位于染色體6q15，編碼區(qū)長(zhǎng)1200 bp[1]。

RRAGD是GTR/RAG GTP結(jié)合蛋白家族的一員，哺乳動(dòng)物體內(nèi)的該家族成員還包括RRAGA、RRAGB、RRAGC[2-3]。這4種蛋白在結(jié)構(gòu)上均有能與GTP/GDP結(jié)合的Loop環(huán)和異二聚化結(jié)構(gòu)域，從而決定了其在功能上具有小G蛋白活性和異二聚化的能力。因此，它們作為一個(gè)分子開關(guān)參與生物過程[4]。另外，它們兩兩結(jié)合，形成了RRAG A/B-C/D異二聚體（其中RRAGA和RRAGB、RRAGC與RRAGD是同源類似物），又稱Rag復(fù)合體（Rag complex）[3,5-8]。該復(fù)合體可與溶酶體上的Ragulator結(jié)合并被氨基酸激活，促進(jìn)mTORC1（mTOR complex 1）從胞漿轉(zhuǎn)移到溶酶體膜表面，并被溶酶體膜上重要的小G蛋白R(shí)heb（Ras ho?molog enriched in brain）激活[9-11]。

為了在活細(xì)胞中研究RRAGD的定位分布，我們擬構(gòu)建RRAGD與綠色熒光蛋白的融合表達(dá)載體。為此，我們提取了HEK293細(xì)胞中的RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA后擴(kuò)增RRAGD基因，連入逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體pQCXIP-EGFP-N1得到pQCXIPRRAGD-EGFP，進(jìn)一步在MDA-MB-436細(xì)胞中檢查了融合蛋白的亞細(xì)胞定位。

1 材料和方法

1.1 材料

MDA-MB-436細(xì)胞系來自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫，293FT細(xì)胞和HEK293細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存（均采用Macgene公司的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)）；大腸桿菌Trans10和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；載體pQCXIP-EGFP-N1由本實(shí)驗(yàn)保存；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖泻唾|(zhì)粒無內(nèi)毒素提取試劑盒均購自天根公司；TRIzol購自Ambion公司；T載體購自Pro?mega公司；Q5高保真DNA聚合酶，限制性內(nèi)切酶BglⅡ、AgeⅠ、XhoⅠ，T4DNA 連接酶購自NEB 公司；LipofectAMINE 2000、嘌呤霉素均購自Invitro?gen公司；玻璃底30 mm培養(yǎng)皿購自NEST公司。

1.2 HEK293總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄PCR

收獲2×107HEK293細(xì)胞，加入1 mL TRIzol，吹打數(shù)次后吸入離心管，室溫靜止5 min使其充分裂解；加入0.2 mL氯仿，振蕩混勻后室溫靜置10 min，4℃、12 000 r/min離心15 min；取上清至另一離心管中，加入等量的異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清；加入1 mL 75%乙醇，輕輕懸浮沉淀，4℃、7500 r/min離心 5 min，棄上清；晾干，加入 20 μL DEPC 水溶解（65℃，促溶 10～15 min）；定量RNA。取1 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（反轉(zhuǎn)錄體系：1 μg RNA，1 μL Primer，10 μL Re?action Mix，1 μL Enzyme Mix，1 μL Remover，DHPC水補(bǔ)齊至20 μL），將上述體系混勻，42℃、30 min反轉(zhuǎn)錄，85℃、5 min使反轉(zhuǎn)錄酶失活。

1.3 RRAGD基因擴(kuò)增和RRAGD-EGFP融合基因表達(dá)載體構(gòu)建

以得到的cDNA為模板擴(kuò)增RRAGD基因，引物 為 F1（5'-CGCTCGAGATGAGCCAGGTGCTGGG GAAGC-3'）和 R1（5'-CGACCGGTCGCAGCAGCA CTCTAGGGGTCCCAT-3'）。PCR 擴(kuò) 增 條 件 ：95℃10 s，62℃ 15 s，72℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)。PCR使用Q5高保真聚合酶。膠回收擴(kuò)增產(chǎn)物，用Taq酶加A后連入pGEM-T載體，經(jīng)XhoⅠ/AgeⅠ酶切鑒定正確后測(cè)序，測(cè)序正確后回收目的片段，連入pQCXIP-EGFP-N1載體的XhoⅠ/AgeⅠ位點(diǎn)，得到逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體pQCXIP-RRAGD-EGFP（圖1）。

1.4 病毒包裝、感染

293FT細(xì)胞按 1×106/孔接種于6孔板，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜。將目的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體與包裝質(zhì)粒Gag/Pol、VSVG-R用脂質(zhì)體Lipo?fectAMINE 2000共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，6 h后換液，于24、48、72 h收取上清，用4.5 μm濾器過濾。將MDA-MB-436細(xì)胞按2×105/孔的密度接種于6孔板，每孔加入1 mL DMEM培養(yǎng)基、1 mL病毒上清和1.5 μL Polybrene，48 h后用嘌呤霉素（1 μg/mL）篩選4～5 d，獲得穩(wěn)定目的細(xì)胞株。

圖1 pQCXIP-RRAGD-EGFP表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖

1.5 活細(xì)胞觀察RRAGD-EGFP融合蛋白在MDAMB-436細(xì)胞中的分布

分別取目的細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染的普通MDA-MB-436細(xì)胞2×105個(gè)，種于30 mm玻璃底培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜，12 h后在寬場(chǎng)活細(xì)胞熒光顯微鏡下，在FITC和明場(chǎng)下對(duì)RRAGDEGFP陽性細(xì)胞拍攝照片。

2 結(jié)果

2.1 pQCXIP-RRAGD-EGFP表達(dá)載體的構(gòu)建

用引物F1和R1擴(kuò)增所得產(chǎn)物約為1200 bp，與預(yù)期大小相符，提示擴(kuò)增成功（圖2A）。將擴(kuò)增所得片段連入T載體，用XhoⅠ/AgeⅠ酶切鑒定，電泳顯示片段大小正常（圖2B），同時(shí)測(cè)序顯示序列無突變（序列未示）。膠回收目的片段，連入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pQCXIP-EGFP-N1，轉(zhuǎn)化后挑2個(gè)克?。–1、C2），分別用XhoⅠ/AgeⅠ、BglⅡ/AgeⅠ雙酶切鑒定，DNA電泳片段和模式與預(yù)期相符（圖2C），測(cè)序顯示插入序列正確無誤（序列未示），證明pQCXIP-RRAGD-EGFP表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖2 RRAGD基因的PCR擴(kuò)增和表達(dá)載體酶切鑒定

2.2 RRAGD-EGFP融合基因的表達(dá)定位分析

已知RRAGD蛋白主要分布于細(xì)胞的胞漿、胞核和溶酶體，可能依賴于與其相關(guān)的核苷酸結(jié)合狀態(tài)而進(jìn)出胞核。與此一致，我們發(fā)現(xiàn)MDAMB-436細(xì)胞中的RRAGD-EGFP蛋白表達(dá)分布在胞漿和胞核中，同時(shí)在胞漿囊泡中有特異性分布（圖3）。研究表明，在entosis（細(xì)胞侵入性死亡）的后期，mTORC1所調(diào)節(jié)的液泡分裂參與內(nèi)部死亡細(xì)胞的代謝[12]，而RRAGD作為募集mTORC1的關(guān)鍵分子，其在cell-in-cell結(jié)構(gòu)中的表達(dá)分布仍未見報(bào)道，因此我們利用活細(xì)胞工作站觀察RRAGD-EGFP在cell-in-cell結(jié)構(gòu)中的表達(dá)分布變化。結(jié)果顯示當(dāng)內(nèi)部細(xì)胞進(jìn)入死亡狀態(tài)時(shí)，外部細(xì)胞的RRAGD-EGFP會(huì)聚集在內(nèi)部細(xì)胞周圍，有明顯的聚集效應(yīng)；而內(nèi)部細(xì)胞處于活的狀態(tài)時(shí)，無此聚集效應(yīng)（圖3）。提示RRAGD可能參與了cell-in-cell結(jié)構(gòu)中內(nèi)部細(xì)胞的死亡及代謝過程。

圖3 Cell-in-cell結(jié)構(gòu)中外部細(xì)胞的RRAGD-EGFP融合蛋白定位

3 討論

通過建立表達(dá)RRAGD-EGFP融合蛋白的細(xì)胞系，為我們?cè)诨罴?xì)胞水平研究RRAGD的表達(dá)及功能提供了便利：一方面，EGFP是無毒的，對(duì)細(xì)胞的生存狀態(tài)沒有影響，因此便于在熒光顯微鏡下長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行活細(xì)胞觀察，明確其表達(dá)分布的變化；另一方面，可以省去復(fù)雜的免疫熒光染色，同時(shí)簡(jiǎn)化Western印跡實(shí)驗(yàn)的抗體選擇。

RRAGD在多種組織，如皮膚、心臟、脊髓、睪丸和視網(wǎng)膜等中均有表達(dá)。RRAGD可以參與多種信號(hào)通路，尤其是其異二聚體復(fù)合物調(diào)節(jié)mTORC1活性的功能，具有很重要的生理意義[7]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)RRADG在乳腺癌細(xì)胞系的不同單克隆細(xì)胞株中表達(dá)差異很大，同時(shí)與乳腺癌細(xì)胞的cell-in-cell形成率具有一定的相關(guān)性，因此，通過構(gòu)建表達(dá)RRAGD-EGFP融合蛋白的細(xì)胞系，為探討RRAGD對(duì)cell-in-cell形成能力的作用及機(jī)制研究提供了合適的研究模型。

此外，在cell-in-cell結(jié)構(gòu)中，內(nèi)部細(xì)胞是被外部細(xì)胞所形成的液泡包裹的，部分液泡的命運(yùn)與吞噬小體類似——液泡在外部細(xì)胞內(nèi)經(jīng)歷一定的事件后達(dá)到成熟，其成熟末期的標(biāo)志即液泡的分解，液泡分裂后其內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)和遺傳物質(zhì)進(jìn)入外部細(xì)胞并被利用[12]。在我們的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)部細(xì)胞處于死亡狀態(tài)時(shí)，外部細(xì)胞的RRAGD-EGFP有明顯的聚集效應(yīng)，這一過程是否是通過募集mTORC1參與調(diào)節(jié)液泡的成熟,進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)部細(xì)胞的死亡還有待研究。同時(shí)，RRAGD及其形成的異二聚體復(fù)合物的活化是否能決定cell-in-cell結(jié)構(gòu)中內(nèi)部細(xì)胞的命運(yùn)，也值得深入探索。

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Expression and Subcellular Localization of RRAGD-EGFP Fusion Protein in MDA-MB-436 Cells

ZHANG Zheng-Rong1,2,ZHENG You2,RUAN Ban-Zhan2,WANG Man-Na2,LIANG Jian-Qing2,LI Shi-Chong2,HUANG Hong-Yan3,YAN Min1,CHEN Zhao-Lie2,LIU Zhen-Zhen1*,SUN Qiang2*
1.Department of Breast,Cancer Hospital,Zhengzhou University,Zhengzhou 450008;2.Beijing Institute of Biotech?nology,Beijing 100071;3.Beijing Key Laboratory of Oncology and Oncology Vaccine,Beijing Shijitan Hospital,Capital University of Medical Sciences,Beijing 100038;China

Objective:To construct the retroviral expression vector for RRAGD-EGFP fusion protein,and exam?ine its subcellular localization in MDA-MB-436 cells.Methods:Total RNA was extracted from HEK293 cells and reverse transcribed into cDNA.RRAGD（Ras-related GTP binding protein D）gene was amplified by PCR and cloned into the retroviral expression vector pQCXIP-EGFP-N1 to construct pQCXIP-RRAGD-EGFP,followed by retrovirus was made and infected MDA-MB-436,a cell line of breast cancer.Afterwards,time lapse imaging was performed.Results:The retroviral expression vector for RRAGD-EGFP fusion protein was successfully constructed.RRAGD-EGFP fusion protein was found in cytoplasmic vesicles and nucleus.Conclusion:Localization of RRAGDEGFP fusion protein in cytoplasmic vesicles is consistent with its role in lysosomal biogenesis,which has laid foun?dation for the further study on the role of RRAGD in cell-in-cell.

Ras-related GTP binding protein D（RRAGD）;gene cloning;cell-in-cell

Q78

A

1009-0002（2017）05-0639-04

10.3969/j.issn.1009-

*Co-corresponding authors,LIU Zhen-Zhen,E-mail:Liuzhenzhen73@163.com;SUN Qiang,E-mail:sunq@bmi.ac.cn

2017-04-05

國(guó)家自然科學(xué)基金（81572799，31671432）；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFC1303303）；北京市自然科學(xué)基金（7162091）

張崢嶸（1991- ），男，碩士研究生，（E-mail）18703605958@163.com；鄭幽（1989- ），女，助理研究員；二者為共同第一作者

劉真真，（E-mail）Liuzhenzhen73@163.com；孫強(qiáng)，（E-mail）sunq@bmi.ac.cn