代建寧，鄧彩霞，景調(diào)平，姥偉，楊海旭

解放軍第五醫(yī)院 a.骨科中心；b.高壓氧；c.麻醉手術(shù)科；寧夏 銀川 750004

Runx2真核表達載體的構(gòu)建及其對骨肉瘤細胞增殖的影響

代建寧a，鄧彩霞b，景調(diào)平c，姥偉a，楊海旭a

解放軍第五醫(yī)院 a.骨科中心；b.高壓氧；c.麻醉手術(shù)科；寧夏 銀川 750004

目的：構(gòu)建人源Runx2過表達重組載體，探討Runx2對骨肉瘤細胞增殖能力的影響。方法：以HEK293細胞總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過PCR技術(shù)擴增Runx2全長基因并連接至真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1，篩選陽性克隆進行序列測定后，轉(zhuǎn)染至骨肉瘤細胞Saos-2和U2-OS，通過MTT實驗驗證Runx2調(diào)節(jié)細胞增殖的能力。結(jié)果：構(gòu)建了pcDNA3.1-Runx2真核表達載體，并在骨肉瘤細胞Saos-2和U2-OS中高表達Runx2蛋白；Runx2高表達后，骨肉瘤細胞增殖能力顯著增加。結(jié)論：構(gòu)建了Runx2基因高效真核表達載體，并證明Runx2可以促進骨肉瘤細胞的增殖。

Runx2；真核表達載體；骨肉瘤細胞；細胞增殖

骨肉瘤嚴重威脅著人們健康，高發(fā)于青少年人群，位列青少年腫瘤第三位，僅次于淋巴瘤和腦腫瘤[1]。根據(jù)其組織成分，可將骨肉瘤的亞型分為成骨細胞型、成軟骨細胞型、成纖維細胞型、成韌帶型和小細胞型。深入探討其發(fā)生機制，對于骨肉瘤的診斷和治療均具有重要意義。Runx2（Runt-related transcription factor 2）是 Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子家族成員。前期研究表明，Runx2在成骨分化的信號途徑中發(fā)揮重要作用，能誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞向成骨細胞定向分化和成熟，促進骨組織的發(fā)育和傷口愈合[2-3]。本研究中，我們構(gòu)建了Runx2的高效真核表達載體，并驗證了其對骨肉瘤細胞增殖能力的影響，為后續(xù)研究Runx2在骨肉瘤細胞發(fā)生發(fā)展中的作用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK293細胞、骨肉瘤細胞系Saos-2和U2-OS購自中國科學(xué)院細胞庫；大腸桿菌TOP10、限制性內(nèi)切酶及連接酶購自TaKaRa公司；pcDNA3.1真核表達質(zhì)粒和脂質(zhì)體2000購自Invitrogen公司；抗體 Runx2購自 Cell Signaling Technology（CST）公司；β-actin購自博士德公司。

1.2 pcDNA3.1-Runx2真核表達載體的構(gòu)建

提取HEK293細胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)Runx2的編碼序列設(shè)計引物，通過反轉(zhuǎn)錄PCR擴增Runx2的mRNA。上游引物序列為5'-GATATCATGGTGGCCGGGACCCGC-3'，酶 切 位 點為EcoRⅤ；下游引物序列為5'-CTCGAGTCAATA TGGTCGCCAAAC-3'，酶切位點為XhoⅠ。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸90 s，重復(fù)35個循環(huán)；72℃充分延伸30 min。經(jīng)DNA電泳證明序列位置正確后，回收PCR產(chǎn)物，用EcoRⅤ和XhoⅠ對pcDNA3.1和Runx2擴增產(chǎn)物雙酶切，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化實驗后，挑取陽性克隆進行酶切鑒定和DNA測序。

1.3 pcDNA3.1-Runx2轉(zhuǎn)染骨肉瘤細胞

分別將5×105骨肉瘤細胞Saos-2和U2-OS接種至6孔板，待細胞密度長至約60%時進行轉(zhuǎn)染。將pcDNA3.1（陰性對照）或pcDNA3.1-Runx2質(zhì)粒4 μg、脂質(zhì)體2000 10 μL在400 μL無血清培養(yǎng)液中混勻，轉(zhuǎn)染至細胞。轉(zhuǎn)染一定時間后進行后續(xù)實驗。

1.4 Western印跡實驗

轉(zhuǎn)染48 h后分別收取陰性對照pcDNA3.1、過表達pcDNA3.1-Runx2的骨肉瘤細胞Saos-2和U2-OS，用預(yù)冷的PBS溶液洗滌3次，加入RIPA蛋白裂解液，超聲波裂解細胞提取蛋白；離心后，收取蛋白上清，通過BCA定量法對各組蛋白進行定量；按照一定體積加入5×上樣緩沖液，于沸水中10 min，保證蛋白充分變性；取30 μg蛋白樣品進行蛋白電泳實驗（SDS-PAGE），濃縮膠電壓為120 V，分離膠電壓為160 V；電泳畢，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上，用5%脫脂奶粉封閉1 h；分別用Runx2抗體（1∶5000稀釋）和β-actin抗體（1∶500稀釋）與NC膜于4℃孵育過夜，次日用含0.5%Tween-20的TBST洗3次，5 min/次，再加入相應(yīng)結(jié)合的二抗后，與ECL發(fā)光檢測劑結(jié)合顯示結(jié)果。

1.5 MTT法檢測細胞活力

陰性對照pcDNA3.1、過表達pcDNA3.1-Runx2的骨肉瘤細胞Saos-2和U2-OS轉(zhuǎn)染24 h后，將各組細胞用含10%血清的培養(yǎng)液制成單個細胞懸液，以104/孔接種到96孔板，每孔體積200 μL；分別在培養(yǎng)0、24、48、72 h后進行MTT實驗（每孔加入5 mg/mL的MTT溶液，孵育4 h后終止培養(yǎng)，小心吸棄上清液，每孔加入100 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解）；在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔的D490nm值，以時間為橫坐標(biāo)、D490nm值為縱坐標(biāo)繪制細胞生長曲線。

2 結(jié)果

2.1 pcDNA3.1-Runx2重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

以HEK293細胞的cDNA作為模板，經(jīng)PCR反應(yīng)擴增出Runx2編碼區(qū)域，條帶位置為1000～2000 bp，與Runx2全長（1566 bp）相符（圖1）。將Runx2和pcDNA3.1分別用EcoRⅤ和XhoⅠ雙酶切后連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)TOP10，挑取克隆提取質(zhì)粒并進行酶切鑒定。經(jīng)EcoRⅤ和XhoⅠ雙酶切鑒定，發(fā)現(xiàn)1～4號克隆均可在1000～2000 bp位置切得條帶，經(jīng)測序鑒定正確后進行后續(xù)實驗（圖2）。

2.2 pcDNA3.1-Runx2轉(zhuǎn)染骨肉瘤細胞后高表達Runx2蛋白

為了驗證Runx2是否能在真核細胞中正確轉(zhuǎn)錄和翻譯，將pcDNA3.1-Runx2質(zhì)粒和陰性對照pcDNA3.1空載體瞬時轉(zhuǎn)染骨肉瘤細胞Saos-2和U2-OS。Western印跡實驗發(fā)現(xiàn)，與陰性對照相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Runx2質(zhì)粒的細胞中Runx2蛋白水平顯著升高，這表明pcDNA3.1-Runx2質(zhì)粒能在真核細胞中表達（圖3）。

圖1 Runx2基因PCR產(chǎn)物電泳圖譜

圖2 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Runx2的EcoRⅤ/XhoⅠ雙酶切電泳圖譜

圖3 Western印跡檢測Runx2在各細胞中的蛋白表達

2.3 Runx2促進了骨肉瘤細胞的增殖能力

我們分析了Runx2是否對骨肉瘤細胞Saos-2和U2-OS的增殖具有調(diào)控作用。分別選擇不同時間點（0、24、48、72 h）進行MTT實驗，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Runx2質(zhì)粒的細胞增殖能力顯著高于陰性對照細胞，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）（圖4）。這一結(jié)果說明，Runx2可以在骨肉瘤細胞Saos-2和U2-OS中促進細胞的增殖。

圖4 MTT法檢測骨肉瘤細胞生長曲線

3 討論

Runx2是細胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，屬于Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子家族，包含Runt DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。以往研究顯示，Runx2對成骨細胞的分化和骨骼形態(tài)發(fā)生至關(guān)重要，是間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)控骨骼發(fā)育相關(guān)基因的表達發(fā)揮功能[4-5]。高表達的Runx2是成骨細胞初始分化的標(biāo)志，它也是骨形成過程中最早和最具特異性的標(biāo)志基因。在生物進化過程中，Runx2基因高度保守，當(dāng)Runx2基因表達缺失時將導(dǎo)致骨發(fā)育不良或終止[6]。此外，Runx2還參與了多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可以受到骨形態(tài)發(fā)生蛋白、胰島素樣生長因子、甲狀腺激素、成纖維細胞生長因子等多種因素的影響，對成骨細胞和破骨細胞均有效應(yīng)，在骨代謝過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[7-9]。

Runx2與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在乳腺癌中，Runx2高表達可以促進MMP-13、MMP-9、VEGF等轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達，促進細胞的侵襲和遷移能力[10-11]；在前列腺癌中，Runx2的過表達會上調(diào)Sox9、Snail2等轉(zhuǎn)錄因子的表達，誘導(dǎo)細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transi?tion，EMT）過程的發(fā)生[12-13]；在肝癌中，Runx2通過直接結(jié)合長鏈非編碼RNA MT1DP啟動子，抑制其表達并促進肝癌細胞的增殖[14]；在結(jié)腸癌中，Runx2可以與ETS-1結(jié)合，促進遷移相關(guān)基因的表達，促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程[15]。

本研究中，我們以骨肉瘤細胞系作為研究模型，通過重組DNA技術(shù)構(gòu)建了pcDNA3.1-Runx2真核表達載體，并發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1-Runx2可以在Saos-2和U2-OS細胞中誘發(fā)Runx2蛋白的高表達，功能實驗進一步證實Runx2的高表達會顯著促進骨肉瘤細胞的增殖能力。這一研究為后續(xù)探討Runx2在骨肉瘤細胞中促增殖的功能及相關(guān)機制打下了基礎(chǔ)。

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Construction of RunX2 Expression Plasmid and its Promo?tive Role on Osteosarcoma Cell Proliferation

DAI Jian-Ninga,DENG Cai-Xiab,JING Diao-Pingc,LAO Weia*,YANG Hai-Xua*
a.Department of Orthopedics;b.Department of Hyperbaric Oxygen;c.Department of Anesthesiology;the 5th Hos?pital of PLA,Yinchuan 750004,China

Objective:To investigate the effect of Runx2 on the osteosarcoma cells proliferation.Methods:The total RNA was extracted from HEK293 cells,from which the Runx2 full length cDNA was amplified through RTPCR,and itwas cloned into pcDNA3.1 vector.The positive plasmid wasselected and transfected into osteosarcoma cells Saos-2 and U2-OS,and biological function of Runx2 was examined through MTT assay.Results:We constructed Runx2 expression plasmid,and confirmed the highly expression ofRunx2 after transfection of pcDNA3.1-Runx2 in Saos-2 and U2-OS cells.Runx2 over-expression induced cell proliferation.Conclusion:Runx2 can accelerate osteosarcoma cell proliferation.

Runx2;mammal expression vector;osteosarcoma cells;cell proliferation

Q78;Q25

A

1009-0002（2017）05-0643-04

10.3969/j.issn.1009-

*Co-corresponding authors,LAO Wei,E-mail:mulaowei@126.com;YANG Hai-Xu,E-mail:bioyhx@126.com

2017-01-12

代建寧（1978- ），男，本科學(xué)歷，主治醫(yī)師

姥偉，（E-mail）mulaowei@126.com；楊海旭，（E-mail）bioyhx@126.com