馮麗麗，陳海燕，劉毓俠，郭彥，周國利，任銀玲

1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟與信息研究所，河南 鄭州 450002；2.聊城大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 聊城 252059

可溶性泛素樣特異性蛋白酶1的表達及活性鑒定

馮麗麗1，陳海燕1，劉毓俠1，郭彥2，周國利2，任銀玲1

1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟與信息研究所，河南 鄭州 450002；2.聊城大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 聊城 252059

目的：高效可溶性表達泛素樣特異性蛋白酶1（ULP1）。方法：根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性優(yōu)化合成編碼ULP1的基因片段序列，將其克隆到原核表達載體pGEX-6P-1中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），用0.5 mmol/L IPTG于37℃誘導(dǎo)表達8 h，觀察重組蛋白ULP1的表達情況；優(yōu)化誘導(dǎo)時間及IPTG濃度，并鑒定重組蛋白ULP1的生物學(xué)活性。結(jié)果：重組蛋白ULP1表達的最佳條件為37℃、0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達5 h，目的蛋白以可溶性表達為主；Western印跡結(jié)果表明，重組蛋白ULP1能夠被His單克隆抗體識別，重組蛋白ULP1能夠特異性酶切SUMO-GFP。結(jié)論：表達了具有生物學(xué)活性的SUMO蛋白酶ULP1。

泛素樣特異性蛋白酶1（ULP1）；SUMO蛋白酶；表達；純化；生物學(xué)活性

泛素樣特異性蛋白酶（ubiquitin-like specific protease，ULP）為半胱氨酸蛋白酶超家族成員，在真核生物體內(nèi)可將小分子泛素樣修飾物（small ubiquitin-related modifier，SUMO）底物蛋白偶合物水解成SUMO和底物，此過程稱為去SUMO化（de?sumoylation）[1-4]。釀酒酵母中含有2種SUMO蛋白酶，即ULP1和ULP2。ULP1位于核孔復(fù)合體中，ULP2則主要位于細胞核內(nèi)。目前對ULP1的研究較多。ULP1由621個氨基酸殘基組成，至少含有2個結(jié)構(gòu)域，C端蛋白酶折疊區(qū)域（432～621 aa）保守性高，N端結(jié)構(gòu)域（1～432 aa）保守性弱，其中第403～621 aa片段具有全長ULP1的酶切活性，且可水解以α氨基連接的SUMO蛋白[5-6]。

SUMO蛋白廣泛存在于真核細胞中，具有重要的生物學(xué)功能，參與多種生命過程[7]。SUMO標簽?zāi)茱@著增加重組蛋白的表達量、促進靶蛋白的正確折疊及防止蛋白酶水解，被廣泛應(yīng)用于重組蛋白表達的融合標簽[8]。利用SUMO表達系統(tǒng)體外表達重組蛋白，須以SUMO蛋白酶為切割工具分離靶蛋白[9-10]。ULP1能夠識別含SUMO標簽蛋白的蛋白質(zhì)序列，且可高效地將SUMO標簽蛋白與融合蛋白切割開。ULP1的酶切反應(yīng)特異性高，可在較寬范圍的反應(yīng)體系中保持較高的活力，如pH值（5.5～9.5）、溫度（4～30℃）等。因此，表達活力高和特異性強的SUMO蛋白酶具有十分重要的經(jīng)濟價值。在本研究中，我們根據(jù)GenBank公布的ULP1（Q02724）氨基酸序列，結(jié)合大腸桿菌密碼子偏好性優(yōu)化合成ULP1基因序列，并設(shè)計相應(yīng)的表達引物，PCR擴增編碼ULP1第403～621 aa活性片段的基因序列，將其克隆到原核表達載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，以期表達出高活力和高特異性的重組ULP1，為帶SU?MO標簽融合蛋白的高效純化奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌BL21（DE3）及JM109感受態(tài)細胞購自大連寶生物工程有限公司；pGEX-6P-1表達載體購自Amersham公司。根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性優(yōu)化編碼ULP1的基因片段，由生工生物（上海）股份有限公司合成。

His標簽單克隆抗體、HRP標記的羊抗鼠IgG購自Abcam公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ及T4DNA連接酶購自Promega公司；IPTG誘導(dǎo)劑購自INALCO公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司；蛋白質(zhì)marker、DNA聚合酶、DNA凝膠回收試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；AEC顯色試劑盒購自中杉金橋公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 ULP1基因及表達引物的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank公布的ULP1蛋白序列（Q02724），按照大腸桿菌密碼子偏好性優(yōu)化ULP1基因序列，并設(shè)計表達引物ULP1-F（5'-TG GGATCCATGCTTGTTCCTGAATTAAA-3'，下 劃 線部分為BamHⅠ酶切位點）和ULP1-R（5'-AATCT CGAGTTAGTGATGATGATGATGATG-3'，下劃線部分為XhoⅠ酶切位點）。ULP1基因片段及引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 重組表達載體構(gòu)建

應(yīng)用引物ULP1-F/R，以合成的ULP1基因片段為模板進行PCR擴增，獲得ULP1基因片段；用BamHⅠ、XhoⅠ分別雙酶切目的基因片段和pGEX-6P-1載體，用T4DNA連接酶按3∶1的比例連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)菌液PCR鑒定，對陽性結(jié)果的質(zhì)粒進行測序，將測序正確的陽性菌株命名為pGEX-ULP1；將提取的陽性菌株質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），用于重組蛋白表達。

1.4 重組蛋白ULP1的表達與可溶性分析

將pGEX-ULP1菌液按1∶1000的比例接種至5 mL含50 μg/mL氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基中，過夜37℃培養(yǎng)；按1∶100的比例接種到50 mL LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至D450nm約為0.6時，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h；收集細菌培養(yǎng)液，4℃、12 000 r/min離心10 min后棄上清，向沉淀中加入2 mL PBS緩沖液，將重懸的菌體進行超聲波破碎，4℃、12 000 r/min離心10 min，SDSPAGE檢測；在15 V、1 h條件下，用電轉(zhuǎn)儀將目的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜），用5%的脫脂奶于4℃封閉過夜，以His單克隆抗體（1∶5000稀釋）為一抗孵育60 min，以HRP標記的羊抗鼠IgG（1∶5000稀釋）為二抗孵育30 min，AEC顯色，觀察目的蛋白的表達。

1.5 重組蛋白ULP1的表達條件優(yōu)化

分別對IPTG誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)時間進行優(yōu)化。在IPTG濃度為0.5 mmol/L、溫度為37℃條件下，誘導(dǎo)時間分別選擇 2、4、5、6、7、8、9 h；在溫度37℃、誘導(dǎo)5 h條件下，分別選擇0.1、0.3、0.6、0.9、1 mmol/L的IPTG濃度。將以上條件下的表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE檢測，以確定重組蛋白的最佳誘導(dǎo)條件。

1.6 重組蛋白ULP1的純化

采用Ni親和柱純化，先用結(jié)合緩沖液（含10 mmol/L咪唑）平衡Ni親和柱，將裂解液緩慢流過Ni親和柱，用含20 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液洗滌Ni親和柱，最后用含250 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液洗脫表達的目的蛋白。

1.7 重組蛋白ULP1的酶切活性鑒定

分別選用本研究純化獲得的ULP1及商品化的ULP1對SUMO-GFP蛋白進行酶切反應(yīng)。商品化酶反應(yīng)體系：40 μL SUMO-GFP融合蛋白，2 μL（10 U/μL）SUMO 蛋白酶，10 μL 10×SUMO 蛋白酶緩沖液，加ddH2O至總體積為80 μL；重組ULP1反應(yīng)體系：40 μL SUMO-GFP融合蛋白，10 μL SUMO蛋白酶，8 μL 10×SUMO蛋白酶緩沖液，加ddH2O至總體積為80 μL。上述反應(yīng)體系在30℃反應(yīng)4 h，反應(yīng)產(chǎn)物進行SDS-PAGE檢測，以確定純化后重組蛋白的酶切活性。

2 結(jié)果

2.1 ULP1基因的PCR擴增及pGEX-ULP1重組表達質(zhì)粒的鑒定

用引物ULP1-F/R進行PCR擴增，在約700 bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期ULP1基因片段大小一致（圖1）；將擴增的ULP1基因片段克隆至pGEX-6P-1載體，菌液PCR鑒定結(jié)果顯示為陽性（圖2）；提取陽性菌株的質(zhì)粒并進行雙酶切鑒定，在約700 bp處有預(yù)期目的條帶（圖3）。將陽性質(zhì)粒送樣測序，結(jié)果表明重組表達質(zhì)粒pGEX-ULP1構(gòu)建成功。

圖1 ULP1片段PCR擴增結(jié)果

圖2 pGEX-ULP1菌液PCR鑒定結(jié)果

圖3 pGEX-ULP1雙酶切鑒定結(jié)果

2.2 重組蛋白ULP1的誘導(dǎo)表達及可溶性分析

超聲波破碎處理的樣品上清及沉淀分別進行SDS-PAGE及Western印跡鑒定，結(jié)果表明，在相對分子質(zhì)量48 000處有特異的蛋白質(zhì)條帶，與預(yù)測的ULP1重組蛋白大小一致，目的蛋白大部分以可溶性形式存在，且能與抗His標簽單克隆抗體特異性結(jié)合（圖4）。

2.3 重組蛋白ULP1的表達條件優(yōu)化

分別對誘導(dǎo)表達重組蛋白ULP1的誘導(dǎo)時間、IPTG濃度進行優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)5 h時表達量達到最高，故選擇5 h作為最佳誘導(dǎo)表達時間（圖5）。當IPTG濃度為0.1 mmol/L時，目的蛋白的表達量明顯高于0.3 mmol/L；而IPTG濃度高于0.3 mmol/L時的表達變化不很明顯，故選擇0.1 mmol/L作為最佳IPTG誘導(dǎo)濃度（圖6）。

圖5 0.5 mol/L IPTG誘導(dǎo)不同時間的重組蛋白ULP1的表達

圖6 不同IPTG濃度誘導(dǎo)5 h的重組蛋白ULP1的表達

2.4 重組蛋白ULP1的純化

分別采用Ni-NTA親和樹脂及陽離子交換層析純化目的蛋白。圖7為Ni柱親和層析純化結(jié)果，重組蛋白與Ni柱結(jié)合良好，特異性強，經(jīng)親和純化后目的蛋白純度較高，可達95%。

圖7 重組蛋白ULP1的Ni柱親和層析純化

2.5 重組蛋白ULP1的酶切活性鑒定

從圖8可以看出，純化的重組蛋白ULP1可將SUMO-GFP完全切開，出現(xiàn)相對分子質(zhì)量分別約為26 000和18 000的2條帶?？梢?，表達的重組蛋白ULP1具有SUMO蛋白酶活性。

圖8 重組蛋白ULP1的活性鑒定

3 討論

我們構(gòu)建并高效表達了可溶性ULP1活性片段，利用重組蛋白ULP1的6×His標簽進行Ni-NTA純化后,其純度達95%以上。重組蛋白ULP1與商品化SUMO蛋白酶對SUMO-GFP的切割結(jié)果一致，表明本研究表達的重組蛋白具有天然ULP1的酶切活性。

ULP1專一性強，識別蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，且其可從SUMO末端將目的蛋白切割下來，切割后不存在任何氨基酸殘留。此外，SUMO融合標簽分子較小，可促進蛋白可溶性表達、正確折疊，防止蛋白降解[11-13]。鑒于以上優(yōu)點，SUMO表達系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用，其切割酶ULP1的需求量也隨之增加。但ULP1在正常真核細胞中的表達量非常低,故本研究按照大腸桿菌密碼子的偏好性來優(yōu)化合成SUMO蛋白酶活性片段ULP1基因,使得ULP1能夠高水平表達，經(jīng)純化得到活性較強的SUMO蛋白酶ULP1。

[1]Eckhoff J,Dohmen R J.In vitro characterization of chain depolymerization activities of SUMO-specific pro?teases[J].Methods Mol Biol,2016,1475:123-135.

[2]Guerrero F,Ciragan A,Iwa? H.Tandem SUMO fusion vectors for improving soluble protein expression and purification[J].Protein Expr Purif,2015,116:42-49.

[3]Malakhov M P,Mattern M R,Malakhova O A,et al.SUMO fusions and SUMO-specific protease for effi?cient expression and purification of proteins[J].J Struct Funct Genomics,2004,5(1/2):75-86.

[4]Kuo D,Nie M,Courey A J.SUMO as a solubility tag and in vivo cleavage of SUMO fusion proteins with Ulp1[J].Methods Mol Biol,2014,1177:71-80.

[5]Reverter D,Lima C D.Preparation of SUMO proteas?es and kinetic analysis using endogenous substrates[J].Methods Mol Biol,2009,497:225-239.

[6]Hay R T.SUMO-specific proteases:a twist in the tail[J].Trends Cell Biol,2007,17(8):370-376.

[7]Wang Z,Li N,Wang Y,et al.Ubiquitin-intein and SUMO2-intein fusion systems forenhanced protein production and purification[J]. Protein Expr Purif,2012,82(1):174-178.

[8]Panavas T,Sanders C,Butt T R.SUMO fusion tech?nology for enhanced protein production in prokaryotic and eukaryotic expression systems[J].Methods Mol Bi?ol,2009,497:303-317.

[9]HayR T.Protein modification by SUMO[J].Annu Rev Biochem,2004,73(1):355-382.

[10]Dohmen R J.SUMO protein modification[J].Biochim Biophys Acta Mol Cell Res,2004,1695(3):113.

[11]姜媛媛,尹成凱,李晉南,等.利用SUMO融合系統(tǒng)高效表達可溶性重組蛋白的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2008,39(10):57-62.

[12]曲栗,尹杰超,李寧,等.利用SUMO表達系統(tǒng)高效可溶性表達雞傳染性法氏囊病病毒VP3基因[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2011,33(3):199-202.

[13]Guo H C,Sun S Q,Jin Y,et al.Foot-and-mouth dis?ease virus-like particles produced by a SUMO fusion protein system in Escherichia coli,induce potent pro?tective immune responses in guinea pigs,swine and cat?tle[J].Vet Res,2013,44(1):48.

Souble Expression and Biological Activity Identification of Ubiquitin-Like Specific Protease 1

FENG Li-Li1,CHEN Hai-Yan1,LIU Yu-Xia1,GUO Yan2,ZHOU Guo-Li2,REN Yin-Ling1*
1.Institute of Agricultural Economics and Information,Henan Academy of Agriculture Sciences,Zhengzhou 450002;2.College of Life Science,Liaocheng University,Liaocheng 252059;China

Obective:To obtain souble expressive ubiquitin-like specific protease 1（ULP1）.Methods:ULP1 gene was optimized according to the preference codon usage ofE.coli.ULP1 gene was synthesized and then cloned into pGEX-6P-1 vector,and transformed intoE.coliBL21（DE3） competent cells.Inducing time and con?centration of IPTG were optimized,and ULP1 was induced by 0.5 mmol/L IPTG at 37℃for 5 h.Results:The best inducing conditions of was in 0.1 mmol/L IPTG,and expressed as a souble fusion protein.The catalytic reac?tion of ULP1 to SUMO-GFP showed high specificity and activity.Conclusion:The souble fusion ULP1 with bio?logical activity was successful expressed.

ubiquitin-like specific protease 1（ULP1）;SUMO protease;expression;purification;biological activity

Q786

A

1009-0002（2017）05-0629-05

10.3969/j.issn.1009-

*Corresponding author,E-mail:916797076@qq.com

2017-03-01

國家自然科學(xué)基金（31571274）；山東省自然科學(xué)基金（ZR2015CM025）；河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高層次人才科研啟動項目

馮麗麗（1983- ），女，博士，助理研究員，（E-mail）707642217@qq.com

任銀玲，（E-mail）916797076@qq.com