李冰冰，趙振利，鄧敏捷，曹亞兵，董焱鵬，范國(guó)強(qiáng)

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)泡桐研究所，河南 鄭州 450002)

鹽脅迫對(duì)南方泡桐基因表達(dá)的影響

李冰冰，趙振利，鄧敏捷，曹亞兵，董焱鵬，范國(guó)強(qiáng)

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)泡桐研究所，河南 鄭州 450002)

為闡明泡桐多倍體的耐鹽分子機(jī)制，以南方泡桐二倍體及對(duì)應(yīng)的四倍體為試驗(yàn)材料，以白花泡桐基因組為參考序列，利用RNA-Seq測(cè)序技術(shù)，研究了鹽處理前后南方泡桐四倍體和對(duì)應(yīng)二倍體的基因表達(dá)變化。通過(guò)比對(duì)分析，共鑒定出與鹽脅迫相關(guān)的差異表達(dá)基因2 940個(gè)。對(duì)這些差異基因進(jìn)行GO功能分類(lèi)，結(jié)果顯示差異基因共參與了39個(gè)分類(lèi)，集中在細(xì)胞、結(jié)合、催化等分類(lèi)功能區(qū)的數(shù)量最多。KEGG代謝通路分析發(fā)現(xiàn)，這些差異表達(dá)基因主要參與了Plant hormone signal transduction, Carbon metabolism, Biosynthesis of amino acid等，其中編碼MYB、WRKY、bZIP、ATPase等的基因差異表達(dá)顯著。表明這些基因可能是潛在的鹽脅迫響應(yīng)基因。采用qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證了隨機(jī)挑選的9個(gè)差異表達(dá)基因，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)趨勢(shì)一致。

南方泡桐；鹽脅迫；差異表達(dá)基因；轉(zhuǎn)錄組

鹽脅迫作為重要的非生物脅迫之一，是限制農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)的一個(gè)重要因素[1]。目前，干旱和半干旱地區(qū)約7%的土地(10億hm2)受到鹽分的脅迫影響，并且面積呈現(xiàn)出不斷增加的趨勢(shì)[2-3]。土壤中的鹽分含量過(guò)高將造成植物離子失衡和高滲脅迫，導(dǎo)致作物生長(zhǎng)緩慢、產(chǎn)量下降，甚至萎蔫死亡。Na+、Cl-是造成植物滲透失衡和離子特異性損害的關(guān)鍵離子[4]。研究表明，多類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子基因參與植物非生物脅迫進(jìn)程，其中也包括鹽脅迫適應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制，如改變植物形態(tài)，改變代謝物，合成抗氧化酶和激素等相關(guān)抗逆因子，有利于植物適應(yīng)鹽脅迫或其他非生物脅迫的不利環(huán)境[5]。與鹽脅迫相關(guān)的基因及轉(zhuǎn)錄因子有WRKY、MYB和HSP等。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，新一代高通量測(cè)序技術(shù)可以準(zhǔn)確的反映出基因在各種非生物脅迫環(huán)境下的應(yīng)答機(jī)制。因此，使用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)研究植物的耐鹽機(jī)制具有重要意義[6-7]。泡桐(Paulowniaspp.)為落葉喬木，現(xiàn)有9個(gè)種2個(gè)變種，是中國(guó)本土重要的速生用材樹(shù)種，木材廣泛應(yīng)用于建筑、家具、樂(lè)器和各種工藝品的制作，大量種植泡桐對(duì)提高中國(guó)的經(jīng)濟(jì)水平和改善生態(tài)環(huán)境具有極其重要的意義[8]。但是，土壤鹽漬化嚴(yán)重危害了泡桐的正常生長(zhǎng)發(fā)育，所造成的巨大的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)問(wèn)題亟待解決。近年來(lái)，雖然對(duì)不同倍性泡桐在鹽脅迫下進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組、miRNA、蛋白質(zhì)組等組學(xué)研究，并鑒定到了一些與響應(yīng)鹽脅迫相關(guān)的基因、miRNA以及蛋白質(zhì)[9-11]。然而，泡桐的耐鹽分子機(jī)制仍不清楚。以基因組為背景的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，能降低計(jì)算強(qiáng)度并提高基因注釋的準(zhǔn)確性。因此，本研究以白花泡桐基因組為背景，利用RNA-Seq技術(shù)對(duì)鹽處理下二倍體及四倍體南方泡桐進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析鹽脅迫下不同倍性南方泡桐的基因表達(dá)變化，以期為闡明泡桐多倍體的耐鹽分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林木生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的南方泡桐(Paulowniaaustralis)二倍體(N2)及其四倍體(N4)的組培苗為材料。材料在溫度為(25±2)℃，光照強(qiáng)度為130 μmol·m-2·s-1，光照周期為16 h/8 h(光/暗)下培育30 d，而后移植到室外培養(yǎng) 30 d后選擇生長(zhǎng)一致植株單株栽植于裝有等量普通園土的營(yíng)養(yǎng)缽中，正常生長(zhǎng)50 d進(jìn)行70 mmol·L-1NaCl處理，每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。具體處理步驟如下：(1)稱取3份等質(zhì)量的NaCl；(2)取1份完全溶解于水中后完全溶于水后施入園土中，缽底墊有托盤(pán)，將滲水重新倒入缽中，避免鹽分損失，每3 d進(jìn)行1次，共計(jì) 3 次;(3)在每次NaCl處理時(shí)，N2，N42個(gè)對(duì)照組只加入等量的水；(4)NaCl處理后，每2 d加1次水，在土壤含水量維持在75%下繼續(xù)培養(yǎng)20 d；(5)分別在0、15 d時(shí)對(duì)處理的幼苗頂端完全展開(kāi)的第二對(duì)葉片進(jìn)行取樣，將鹽處理15 d后的樣品分別命名為N2-0.4、N4-0.4，然后用液氮迅速冷凍保存與-80 ℃冰箱中備用。

1.2 總RNA的提取

本試驗(yàn)采用TRLzol試劑進(jìn)行總RNA提取,具體步驟如下：

取50 mg處理的南方泡桐組培苗放入冷凍的研缽中研磨成粉末狀；待液氮完全揮發(fā)后，將研磨好的粉末狀樣品轉(zhuǎn)至離心管中，加1 mL預(yù)冷(4 ℃)的TRLzol試劑，使用渦旋振蕩器充分混勻，室溫放置5 min；用12 000 r·min-1的離心機(jī)離心5 min，棄沉淀；在離心管中加入200 μL氯仿混勻，室溫靜置15 min，12 000 r·min-1離心15 min(4 ℃條件下)，使液相分離；將步驟(4)中的上清液轉(zhuǎn)到1個(gè)新離心管中，加入0.5 mL的異丙醇，充分混勻放置于室溫下5～10 min，4 ℃條件下用12 000 r·min-1離心機(jī)離心10 min；棄上清液后，在離心管中加入1 mL的75%乙醇，在4 ℃下8 000 r·min-1離心5 min；再次棄去上清液，真空干燥5～10 min或室溫條件下晾干，加入30 μL RNA-free H2O后，可以得到水溶解RNA；把得到的總RNA放置于-80 ℃超低溫冰箱進(jìn)行儲(chǔ)存?zhèn)溆谩？俁NA使用Agilent 2100生物分析儀和NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。

1.3 南方泡桐cDNA文庫(kù)構(gòu)建以及高通量測(cè)序

提取樣品總RNA并使用DNase I消化DNA后，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA，在適溫下將mRNA打斷成短片段，以打斷后的mRNA為模板合成一鏈cDNA，然后配制二鏈合成反應(yīng)體系合成二鏈cDNA，并使用試劑盒純化回收、粘性末端修復(fù)、cDNA的3末端加上堿基“A”并連接接頭，然后進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；構(gòu)建好的文庫(kù)用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System質(zhì)檢合格后，使用 Illumina HiSeqTM 2000測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序流程圖如圖1所示。

圖1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序流程圖Fig.1 Transcriptome sequencing process

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

由Illumina HiSeqTM2000測(cè)序所得的數(shù)據(jù)稱為raw reads或raw data，去除含adapter、含N和低質(zhì)量reads，得到clean reads。使用Bowtie將clean reads比對(duì)到參考基因序列，進(jìn)行差異基因分析，并對(duì)篩選出的樣品間差異表達(dá)基因，進(jìn)行GO功能富集分析、KEGG pathway富集分析。本研究中，將P≤0.05且差異倍數(shù)(fold-change)在2倍以上的基因定義為差異表達(dá)基因。P值越小，差異倍數(shù)越大，則表明表達(dá)差異越顯著。

1.5 差異表達(dá)基因qRT-PCR驗(yàn)證

對(duì)70 mmol·L-1NaCl處理的N2和N4差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，總RNA提取方法參照1.2提取的方法。首先需要將所驗(yàn)證的差異表達(dá)基因利用Beacon Designer version 7.7 (Premier Biosoft International，Ltd. Palo Alto，CA，USA)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(表 1)，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈，整個(gè)反應(yīng)體系為: 反應(yīng)體系總體積為20 μL，每20 μL中含有1 μL的模板，正向和反向引物各0.4 μM，cDNA 1 μL，7.0 μL ddH2O。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃，1 min；95 ℃，15 s；然后57 ℃，15 s；40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3次重復(fù)。以18S rRNA作為內(nèi)參進(jìn)行校正，數(shù)據(jù)處理使用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 QRT-PCR驗(yàn)證的9個(gè)差異表達(dá)基因的引物序列 Table 1 Primers of quantitative RT-PCR analysis of co-regulated differentially expressed genes

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序結(jié)果分析

利用高通量測(cè)序，對(duì)南方泡桐二倍體(N2、)、四倍體(N4)、二倍體鹽處理(N2-0.4)和四倍體鹽處理(N4-0.4)進(jìn)行Illumina測(cè)序，分別得到了raw reads 44 966 742條、66 115 272條、38 601 906條和 39 625 810條，總堿基長(zhǎng)度分別為4 271 027 400 bp、6 207 579 584 bp、3 734 143 114 bp、3 821 414 790 bp。去除低質(zhì)量、包含N的reads后，4個(gè)文庫(kù)共得到clean reads數(shù)量分別為：42 287 400條、61 461 184條、36 971 714條、37 835 790條，clean reads占total reads總數(shù)的比例為94.04%、92.96%、95.78%、95.48%。經(jīng)過(guò)高通量測(cè)序得到的4個(gè)文庫(kù)clean reads，可用于下一步分析。

2.2 比對(duì)統(tǒng)計(jì)

將上述測(cè)序得到的南方泡桐4個(gè)文庫(kù)中的clean reads比對(duì)到泡桐參考基因組上，可以匹配到白花泡桐基因組上的clean reads占total reads的比例分別為69.66%(N2)、67.81%(N4)、69.77%(N2-0.4)、71.25%(N4-0.4)(表2)。比對(duì)比例未能達(dá)到100%，也說(shuō)明了不同種樣品間是有一定差異的。

2.3 測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)

由南方泡桐4個(gè)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的reads在基因上的分布情況(圖2)可以看出，各個(gè)庫(kù)reads在基因上的分布是均勻的，證明了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量較高。對(duì)下一步深入挖掘分析奠定基礎(chǔ)。

2.4 南方泡桐差異表達(dá)基因(DEGs)分析

根據(jù)方法1.4中差異表達(dá)基因篩選標(biāo)準(zhǔn)，在N2與N4中鑒定出8 055個(gè)DEGs，4 706個(gè)為上調(diào)基因，3 349個(gè)為下調(diào)基因。為進(jìn)一步了解這些差異基因的功能，對(duì)8 055個(gè)DEGs進(jìn)行Nr注釋?zhuān)筮M(jìn)行GO(Gene Ontology)功能分類(lèi)。結(jié)果表明8 055個(gè)差異基因參與了50個(gè)GO分類(lèi)(圖3A)，其中代謝過(guò)程、細(xì)胞組分、催化活性等條目所包含的差異基因數(shù)量最多，為進(jìn)一步了解這些差異基因所參與的生物學(xué)功能，對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG pathway分析(表 3)，結(jié)果顯示5 086個(gè)DEGs參與了132條代謝通路，其中顯著性富集的pathway(P≤0.05)有19條，如Carbon metabolism、Biosynthesis of amino acids等通路。在N4-0.4與N4中(圖 3B)鑒定出7 467個(gè)DEGs，其中1 644個(gè)上調(diào)基因，5 823個(gè)為下調(diào)基因。對(duì)這些DEGs進(jìn)行Nr注釋?zhuān)筮M(jìn)行了GO功能分類(lèi)，表明7 464個(gè)差異基因參與了49個(gè)分類(lèi)，其中細(xì)胞組分、代謝過(guò)程、細(xì)胞、催化活性等差異基因數(shù)量最多。KEGG pathway分析表明這些DEGs共參與19個(gè)KEGG代謝通路并顯著性差異，其中Ribosome biogenesis in eukaryotes、Circadian rhythm-plant和ABC transporters等高度富集。在N2-0.4與N4(圖3C)，對(duì)5 630個(gè)(上調(diào)基因2 509個(gè)，下調(diào)基因3 121個(gè))差異表達(dá)基因進(jìn)行Nr注釋和GO功能分類(lèi)。結(jié)果表明，差異基因參與了48個(gè)GO分類(lèi)，其中細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程、結(jié)合、催化活性等基因數(shù)量最多。利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行富集分析， 3 523個(gè)DEGs共參與23個(gè)代謝通路， 其中Biosynthesis of secondary metabolites、Zeatin biosynthesis等代謝通路高度富集。

表2 Clean reads與參考基因及基因組比對(duì)統(tǒng)計(jì) Table 2 The statistics of clean reads mapped to reference gene and genome

圖2 read在基因位置分布情況(A: N2；B: N2-0.4; C: N4；D: N4-0.4)Fig.2 The distribution of reads in gene (A: N2；B: N2-0.4; C: N4；D: N4-0.4)

同樣對(duì)N2-0.4與N2(圖3D)的數(shù)據(jù)進(jìn)行Nr注釋和GO功能分類(lèi)，結(jié)果表明，差異基因共參與47個(gè)GO分類(lèi)，代謝過(guò)程、細(xì)胞組分、結(jié)合、催化活性等基因數(shù)量最多。對(duì)這些差異基因進(jìn)行 KEGG富集分析，共有3246個(gè)DEFGs參與33個(gè)代謝通路。其中，Plant hormone signal transduction、Biosynthesis of secondary metabolites、Metabolic pathways等高度富集。

表3 南方泡桐4個(gè)文庫(kù)差異表達(dá)基因KEGG Pathway富集分析Table 3 KEGG Pathway enrichment analyses of different expression genes between four libraries in Paulownia australis

續(xù)表 Continuing table

注：比率為差異表達(dá)基因數(shù)量與總基因數(shù)量的比。

Notes：Ratio represents the ratio of the number of differentially expressed genes to the total number of genes.

圖3 差異表達(dá)基因的GO 分類(lèi) Fig.3 Go classification of differentially expressed genes

2.5 與鹽脅迫相關(guān)的差異表達(dá)基因(DEGs)分析

為找出N2與N4鹽脅迫密切相關(guān)的的差異表達(dá)基因，本研究對(duì)N2與N4、N4-0.4與N4、N4-0.4與N2-0.4、N2-0.4與N2對(duì)比組進(jìn)行進(jìn)一步分析(圖4)。在N2-0.4與N2和N4-0.4與N4共鑒定出10 127個(gè)差異表達(dá)基因可能是與鹽脅迫響應(yīng)有關(guān)的，其中2 506個(gè)是共有的DEGs，特有的DEGs分別為2 660、4 961個(gè)，并對(duì)10 127個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行Nr注釋?zhuān)筮M(jìn)行GO功能分類(lèi)(圖4A)，結(jié)果表明，10 127個(gè)與鹽脅迫相關(guān)的差異基因參與41個(gè)GO分類(lèi)，其中參與細(xì)胞組分分類(lèi)中，細(xì)胞和細(xì)胞組分差異基因數(shù)量最多，胞外區(qū)基因數(shù)量最少；參與分子功能的差異基因分類(lèi)，結(jié)合、催化活性基因數(shù)量最多，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑最少；生物學(xué)過(guò)程中，細(xì)胞過(guò)程、刺激響應(yīng)、代謝過(guò)程、生物調(diào)節(jié)差異基因數(shù)量最多，細(xì)胞自噬數(shù)量最少。在N4-0.4與N2-0.4和N2與N44個(gè)文庫(kù)中，共鑒定出3 555個(gè)共有的差異表達(dá)基因。(圖4B)并對(duì)其進(jìn)行Nr注釋和GO功能分類(lèi)，表明差異基因共參加40個(gè)分類(lèi)，其中細(xì)胞組分的分類(lèi)中，細(xì)胞和細(xì)胞組分基因數(shù)量最多，胞外區(qū)的最少；結(jié)合、催化在分子功能分類(lèi)中的基因數(shù)量最多；在生物學(xué)過(guò)程功能分類(lèi)中，細(xì)胞過(guò)程和代謝過(guò)程差異基因數(shù)量最多，細(xì)胞自噬基因數(shù)量最少。

細(xì)胞組分: 1：細(xì)胞；2：細(xì)胞部分；3：胞膜；4：胞外區(qū)；5：胞外區(qū)部分；6：大分子復(fù)合體；7：膜封閉腔；8：細(xì)胞器；9：細(xì)胞器部分。分子功能： 1：抗氧化性；2：結(jié)合；3：催化；4：電子傳遞；5：酶調(diào)節(jié)；6：金屬離子；7：分子轉(zhuǎn)導(dǎo)；8：結(jié)構(gòu)分子；9：轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)；10：翻譯調(diào)節(jié)；11：轉(zhuǎn)運(yùn)。生物學(xué)過(guò)程：1：解剖結(jié)構(gòu)形成；2：生物附著；3：生物調(diào)節(jié)；4：細(xì)胞自噬；5：細(xì)胞組分生物合成；6：細(xì)胞組分組織；7： 細(xì)胞過(guò)程；8：細(xì)胞死亡；9：發(fā)育過(guò)程；10：胞內(nèi)定位的建立；11：生長(zhǎng)；12：免疫系統(tǒng)過(guò)程；13:細(xì)胞內(nèi)定位；14:代謝過(guò)程；15：涉及多個(gè)有機(jī)體的過(guò)程；16: 涉及多細(xì)胞有機(jī)體的過(guò)程；17：色素沉積；18：生殖；19:生殖過(guò)程； 20: 對(duì)刺激的反應(yīng)；21:節(jié)律性過(guò)程。

Cellular componen：1:Cell；2:Cell part；3:Envelope；4:Extracellular region；5:Extracellular region part； 6:Macromolecular complex； 7:Membrane-enclosed lumen； 8:Organelle ；9:Organelle part . Molecular function：1:Antioxidant； 2:Binding； 3:Catalytic；4:Electron carrier； 5:Enzyme regulator； 6:Metallochaperone； 7:Molecular； 8:Structural molecule； 9:Transcription regulator； 10:Translation regulator； 11:Transporter.Biological process:1:Anatomical structure formation；2:Biological adhension；3:Biological regulation；4:Cell killing；5:Cellular component biogenesis；6:Cellular component organization；7:Cellular process； 8:Death；9:Developmental process；10:Establishment of localization；11:Growth；12:Immune system process；13:Localization；14:Metabolic process；15:Multi-organism process；16:Multicellular organismal process；17:Pigmentation；18:Reproduction；19:Reproductive process；20:Response of stimulus；21:Rhythmic process.

細(xì)胞組分: 1：細(xì)胞；2：細(xì)胞部分；3：胞膜；4：胞外區(qū)；5：胞外區(qū)部分；6：大分子復(fù)合體；7：膜封閉腔；8：細(xì)胞器；9：細(xì)胞器部分。分子功能： 1：抗氧化性；2：結(jié)合；3：催化；4：電子傳遞；5：酶調(diào)節(jié)；6：分子轉(zhuǎn)導(dǎo)；7：結(jié)構(gòu)分子；8：轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)；9：翻譯調(diào)節(jié)；10：轉(zhuǎn)運(yùn)。生物學(xué)過(guò)程：1：解剖結(jié)構(gòu)形成；2：生物附著；3：生物調(diào)節(jié)；4：細(xì)胞自噬；5：細(xì)胞組分生物合成；6：細(xì)胞組分組織；7： 細(xì)胞過(guò)程；8：細(xì)胞死亡；9：發(fā)育過(guò)程；10：胞內(nèi)定位的建立；11：生長(zhǎng)；12：免疫系統(tǒng)過(guò)程；13:細(xì)胞內(nèi)定位；14:代謝過(guò)程；15：涉及多個(gè)有機(jī)體的過(guò)程；16: 涉及多細(xì)胞有機(jī)體的過(guò)程；17：色素沉積；18：生殖；19:生殖過(guò)程； 20: 對(duì)刺激的反應(yīng)；21:節(jié)律性過(guò)程。

Cellular componen： 1:Cell ；2:Cell part； 3:Envelope；4:Extracellular region；5:Extracellular region part； 6:Macromolecular complex； 7:Membrane-enclosed lumen； 8:Organelle； 9:Organelle part. Molecular function：1:Antioxidant； 2:Binding；3:Catalytic；4:Electron carrier；5:Enzyme regulator； 6:Molecular transducer； 7:Structural molecule； 8:Transcription regulator； 9:Translation regulator； 10:Transporter Biological process：1:Anatomical structure formation；2:Biological adhension；3:Biological regulation； 4:Cell killing；5:Cellular component biogenesis；6:Cellular component organization； 7:Cellular process；8:Death；9:Developmental process；10:Establishment of localization； 11:Growth； 12:Immune system process； 13:Localization； 14:Metabolic process；15:Multi-organism process；16:Multicellular organismal process； 17:Pigmentation； 18:Reproduction； 19:Reproductive process； 20:Response of stimulus；21:Rhythmic process.

圖4鹽脅迫相關(guān)的差異表達(dá)基因GO分類(lèi)
Fig.4GocategoryofDEGsrelatedtosaltstress

在N2與N4和N4-0.4與N2-0.4兩對(duì)比組中，鑒定出共有差異表達(dá)基因3 555個(gè)，在排除不同倍性引起的差異后，得到2 940個(gè)DEGs，這些DEGs反映了南方泡桐二倍體及四倍體對(duì)鹽脅迫的不同響應(yīng)。為進(jìn)一步了解差異基因的功能，對(duì)這些差異基因進(jìn)行Nr注釋?zhuān)筮M(jìn)行GO功能分類(lèi)(圖5)。結(jié)果表明，這些差異基因共涉及39個(gè)功能分類(lèi)，其中細(xì)胞組分的分類(lèi)中，細(xì)胞和細(xì)胞組分基因數(shù)量最多，胞外區(qū)的最少；結(jié)合、催化在分子功能分類(lèi)中的基因數(shù)量最多；在生物學(xué)過(guò)程功能分類(lèi)中，細(xì)胞過(guò)程和代謝過(guò)程差異基因數(shù)量最多。此外，在4個(gè)比較組中共鑒定出來(lái)615個(gè)差異表達(dá)基因。

細(xì)胞組分： 1：細(xì)胞；2：細(xì)胞部分；3：胞膜；4：胞外區(qū)；5：胞外區(qū)部分；6：大分子復(fù)合體；7：膜封閉腔；8：細(xì)胞器；9：細(xì)胞器部分。分子功能： 1：抗氧化性；2：結(jié)合；3：催化；4：電子傳遞；5：酶調(diào)節(jié)；6：分子轉(zhuǎn)導(dǎo)；7：結(jié)構(gòu)分子；8：轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)；9：翻譯調(diào)節(jié)；10：轉(zhuǎn)運(yùn)。生物學(xué)過(guò)程：1：解剖結(jié)構(gòu)形成；2：生物附著；3：生物調(diào)節(jié)；4：細(xì)胞組分生物合成；5：細(xì)胞組分組織；6：細(xì)胞過(guò)程；7：細(xì)胞死亡；8：發(fā)育過(guò)程；9：胞內(nèi)定位的建立；10：生長(zhǎng)；11：免疫系統(tǒng)過(guò)程；12:細(xì)胞內(nèi)定位；13:代謝過(guò)程；14：涉及多個(gè)有機(jī)體的過(guò)程；15:涉及多細(xì)胞有機(jī)體的過(guò)程；16：色素沉積；17：生殖18:生殖過(guò)程； 19:對(duì)刺激的反應(yīng)；20:節(jié)律性過(guò)程。

Cellular componen： 1:Cell；2:Cell part；3: Envelope；4:Extracellular region；5: Extracellular region part；6:Macromolecular complex；7:Membrane-enclosed lumen； 8:Organelle；9:Organelle part .Molecular function： 1:Antioxidant； 2:Binding； 3:Catalytic；4:Electron carrier； 5:Enzyme regulator；6:Molecular transducer；7:Structural molecule；8:Transcription regulator； 9:Translation regulator； 10:Transporter. Biological process：1:Anatomical structure formation； 2:Biological adhension； 3:Biological regulation； 4:Cellular component biogenesis； 5:Cellular component organization； 6:Cellular process； 7:Death； 8:Developmental process； 9:Establishment of localization； 10:Growth； 11:Immune system process； 12:Localization；13:Metabolic process；14:Multi-organism process；15:Multicellular organismal process；16:Pigmentation； 17:Reproduction；18:Reproductive process；19：Response of stimulus；20:Rhythmic process.

圖5在N2與N4和N4-0.4與N2-0.4中鹽脅迫相關(guān)的差異表達(dá)基因GO分類(lèi)
Fig.5GocategoryofDEGsrelatedtosaltstressinN2vsN4andN4-0.4vsN2-0.4

2.6 差異基因qRT-PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證高通量測(cè)序結(jié)果的可靠性，本試驗(yàn)隨機(jī)挑選了9個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，具體包括protein phosphatase 2C、fructose 1,6 bisphosphate aldolase、transcription factor bHLH87-like、MYB transcription factor、WRKY-liketranscription factor、plasma membrane H+-ATPase、26S proteasome ATPase regulatory subunit 、DNA-binding protein NtWRKY3、protein FD-like。qRT-PCR結(jié)果顯示除轉(zhuǎn)錄因子bHLH87-like外，MYB等轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量情況與高通量測(cè)序結(jié)果保持一致，說(shuō)明測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確可靠(圖6)。

圖6 差異表達(dá)基因的qRT-PCR 驗(yàn)證(S-0: 對(duì)照；S-15: 鹽處理15 d)Fig.6 Validation of differentially expressed genes with quantitative RT-PCR(S-0: control；S-15: salt treatment for 15 d)

3 討論

隨著全球鹽漬化面積的不斷擴(kuò)大，植物遭受鹽脅迫的危害也日益嚴(yán)重，鹽脅迫作為非生物脅迫之一，嚴(yán)重地限制了植物的生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)可持續(xù)農(nóng)業(yè)和林業(yè)的發(fā)展造成不可逆的經(jīng)濟(jì)損失，并且對(duì)良好生態(tài)環(huán)境的發(fā)展也造成了一定的影響[12-13]。本研究利用Illumina/Solexa測(cè)序技術(shù)，通過(guò)比較不同倍性南方泡桐對(duì)照組和處理組，篩選出了2 940個(gè)可能與鹽脅迫下相關(guān)的DEGs。對(duì)這些DEGs進(jìn)行GO功能分類(lèi)，結(jié)果表明差異基因共參與了39個(gè)分類(lèi)，基因數(shù)量主要集中在細(xì)胞、結(jié)合、催化等分類(lèi)功能區(qū)。進(jìn)一步分析表明這些差異基因參與了ABC transporters(ko02010)、Carbon metabolism(ko01200)、Plant hormone signal transduction(ko04075)、Biosynthesis of amino acid(ko01230)等代謝通路，這些通路將有助于我們更好的深入了解鹽脅迫下植物復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

在鹽脅迫下，植物依賴于許多關(guān)鍵代謝物的產(chǎn)生和運(yùn)輸來(lái)保持細(xì)胞質(zhì)中離子的平衡，通常在在這個(gè)過(guò)程中需要細(xì)胞快速合成滲透物質(zhì)，在高效的離子運(yùn)輸機(jī)制下進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，以維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)的電化學(xué)勢(shì)。植物在鹽脅迫下為了應(yīng)對(duì)滲透失衡和離子毒害，當(dāng)Na+進(jìn)入細(xì)胞后，ATPase將會(huì)通過(guò)驅(qū)動(dòng)Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)生驅(qū)動(dòng)力來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)Na+，減少由于Na+的積累而對(duì)細(xì)胞所造成的損害，將有利于植物重建細(xì)胞離子平衡和維持電化學(xué)勢(shì)平衡[14]。本研究中南方泡桐二倍體及四倍體鹽處理的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明，包括ATP binding cassttte (ABC)transporter, ATPase(PAU009856.1，PAU004974.1，PAU023141.1), ion transporter等編碼膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的DEGs在四倍體鹽脅迫響應(yīng)下是顯著上調(diào)的，表明N4在鹽脅迫下更能維持細(xì)胞的離子平衡。

Transcription Factors (TFs) 在植物生長(zhǎng)和脅迫處理下起著至關(guān)重要的作用[15]。MYB和WRKY家族被認(rèn)為參與了非生物脅迫，在玉米中，與木質(zhì)素合成相關(guān)的基因的表達(dá)受到MYB31和MYB42的過(guò)表達(dá)的抑制，其表現(xiàn)為木質(zhì)素含量降低高達(dá)45%，此時(shí)植物葉、莖和根生長(zhǎng)趨勢(shì)明顯增強(qiáng)[16-17]。有研究表明，StMYB1R-1的表達(dá)增強(qiáng)了干旱相關(guān)基因RD28、AtHB-7等的表達(dá)，這表明了StMYB1R-1作為轉(zhuǎn)錄因子參與了干旱相關(guān)基因的活化。對(duì)其進(jìn)行northern-blot的深入分析表明，除了響應(yīng)干旱脅迫以外，StMYB1R-1在響應(yīng)幾種不同的脅迫時(shí)轉(zhuǎn)錄水平明顯增加，尤其是在鹽脅迫早期StMYB1R-1表達(dá)量明顯增加，這表明MYB基因可能通過(guò)影響木質(zhì)素合成或者與耐鹽相關(guān)基因特異性結(jié)合來(lái)參與高鹽脅迫[18]。在本研究中，編碼MYB家族轉(zhuǎn)錄因子的基因(PAU010915.1，PAU001021.1，PAU026979.1，PAU017920.1)在四倍體鹽處理中是差異表達(dá)的，且表達(dá)倍數(shù)顯著高于鹽處理的二倍體泡桐。說(shuō)明四倍體南方泡桐在鹽脅迫下比二倍體耐受性更強(qiáng)。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子被認(rèn)為是抑制赤霉素(GA)信號(hào)通路，激活脫落酸(ABA)信號(hào)通路并可以調(diào)節(jié)植物中的其他信號(hào)通路，GA和ABA是鹽脅迫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子[19-20]。在本研究中，編碼WRKY轉(zhuǎn)錄因子的基因(PAU011504.1 、PAU005872.1)參與了GA和ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，表明GA和ABA可能通過(guò)參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)影響植物對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)，并且這些轉(zhuǎn)錄因子編碼的差異基因在N4-0.4文庫(kù)中是差異表達(dá)的，在與(N2-0.4)庫(kù)相比差異倍數(shù)較高。這些結(jié)果說(shuō)明在鹽脅迫下，N4與N2文庫(kù)相比，四倍體會(huì)編碼更多的轉(zhuǎn)錄因子來(lái)響應(yīng)鹽脅迫，對(duì)植物的生長(zhǎng)進(jìn)行一系列調(diào)節(jié)。

bZIP轉(zhuǎn)錄因子含有與特異DNA結(jié)合的堿性結(jié)構(gòu)域，其C末端序列高度保守，N末端序列與反式活化活性相關(guān)，可以與DNA直接結(jié)合。在擬南芥中，bZIP14和bZIP37亞族分類(lèi)為Group A，Group A通過(guò)順式元件參與ABA或者脅迫信號(hào)響應(yīng)[21]。此外,bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族的活化可以引起ABA依賴性磷酸化，進(jìn)而引發(fā)植物對(duì)各種脅迫的應(yīng)答[22]。本研究中，在N4-0.4與N2-0.4文庫(kù)中鑒定出來(lái)編碼bZIP基因的DEGs(PAU010522.2)，并在四倍體中的表達(dá)量顯著高于二倍體。說(shuō)明四倍體泡桐對(duì)鹽脅迫的調(diào)控機(jī)制比二倍體更有優(yōu)勢(shì)。

總之，本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)南方泡桐二倍體及對(duì)應(yīng)的四倍體，在鹽脅迫下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組變化研究，鑒定出了與鹽脅迫相關(guān)的差異表達(dá)基因及代謝通路，通過(guò)進(jìn)一步的分析，將為抗逆性品種的培育奠定一定的理論基礎(chǔ)。

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EffectofsaltstressongeneexpressionsofdifferentgenotypesofPaulowniaaustralis

LI Bingbing, ZHAO Zhenli， DENG Minjie， CAO Yabing， DONG Yanpeng， FAN Guoqiang

(Institute of Paulownia, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002,China)

To elucidate the molecular mechanism of polyploidyPaulowniaresponse to salt stress, RNA-Seq technology was used to research changes of genes in response to salinity tolerance in tetraploidPaulowniaaustralisand its diploid withPaulowniareference genome sequences. A total of 2 940 differentially expressed genes related to salt stress were identified in four libraries. GO function classification showed that the differentially expressed genes were involved in 39 categories, and most of them involved in cells, binding, catalysis and other classifications. KEGG pathway analysis indicated that these differentially expressed genes were mainly involved in the synthesis of plant hormone signal transduction,carbon metabolism,and biosynthesis of amino acid.Among these differentially expressed genes, MYB,WRKY,and bZIP,ATPase were differentially expressered,suggesting that these genes may be potential genes of salt response. In addition,quantitative real-time PCR(qRT-PCR)technology was used to validate the expression data measured by RNA-seq for nine randomly selected differentially genes.These results suggested that the RNA-seq dataset was dependable.

Paulowniaaustralis; salt stress; differentially expressed genes; transcriptome

2017-03-12

國(guó)家公益性林業(yè)行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201004002)

李冰冰(1993-)，女，河南禹州人，碩士研究生，主要從事泡桐生物技術(shù)研究工作。

范國(guó)強(qiáng)(1964-)，男，河南禹州人，教授，博士，博士生導(dǎo)師。

1000-2340(2017)04-0471-10

S792.43

A

(責(zé)任編輯：蔣國(guó)良)