茹廣欣，周霜晴，朱秀紅，劉小囡，王鋆瑞

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河南 鄭州 450002)

白花泡桐莖和葉差異表達(dá)的cDNA-SRAP分析

茹廣欣，周霜晴，朱秀紅，劉小囡，王鋆瑞

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河南 鄭州 450002)

以白花泡桐莖和葉為材料，利用cDNA-SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)其進(jìn)行基因表達(dá)的差異分析。從64對(duì)引物中篩選出25對(duì)擴(kuò)增效果較好的引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)得到36個(gè)差異片段，2次PCR擴(kuò)增重復(fù)率為66.8%。經(jīng)挑選回收、克隆和測(cè)序，最終測(cè)得23條差異片段序列，長(zhǎng)度主要在400～1 700bp之間。經(jīng)BLASTX進(jìn)行比對(duì)和功能分析，16條與已知功能基因有較高同源性，包含能量與代謝(34.78%)、蛋白質(zhì)合成(8.70%)、細(xì)胞壁相關(guān)(4.35%)、信號(hào)傳導(dǎo)與脅迫響應(yīng)(8.70%)及復(fù)合影響(13.04%)等多個(gè)方面；7條與未知功能基因序列有較高同源性。

cDNA-SRAP；白花泡桐；差異片段；功能分析

泡桐是一種重要的速生經(jīng)濟(jì)林木，原產(chǎn)于中國(guó)，在林業(yè)經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。研究其木材形成過程中的各項(xiàng)生長(zhǎng)機(jī)制、生理變化、以及基因分子層面探索等，可以為泡桐林木生長(zhǎng)發(fā)育探索提供有效數(shù)據(jù)。張?jiān)茙X等[1]通過在不同種源泡桐試材中對(duì)全干密度進(jìn)行測(cè)定、對(duì)比及分析，得到其差異顯著的結(jié)果。茹廣欣等[2]對(duì)泡桐不同無性系木材的木材干縮性、纖維長(zhǎng)、纖維寬、木材顏色等性狀進(jìn)行了研究，表明其間也存在顯著差異。鄧敏捷等[3]在不同鹽濃度下研究不同泡桐間生理生態(tài)的響應(yīng)特征，并比較其耐鹽性。此外，近年來，也有學(xué)者以轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方式對(duì)泡桐進(jìn)行比對(duì)研究[4-5]。但這些研究多偏重于不同泡桐間生理或分子的表達(dá)情況，對(duì)泡桐器官組織間基因表達(dá)量差異的研究尚未見報(bào)導(dǎo)，探究植物器官組織間差異表達(dá)基因，可以更有效地探索植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中器官生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控作用基因及特異表達(dá)的機(jī)理。cDNA-SRAP分子標(biāo)記技術(shù)是一種以cDNA為模板條件下，進(jìn)行SRAP擴(kuò)增的轉(zhuǎn)錄基因組學(xué)的研究方法。自此方法出現(xiàn)以來，已多次應(yīng)用在植物上。喬燕春等[6]按照其在枇杷屬植物上建立的SRAP反應(yīng)體系，對(duì)山楂的果肉、種核和種子進(jìn)行基因表達(dá)差異分析，獲得了較為清晰的差異條帶。劉娟等[7]對(duì)不同類型大黃進(jìn)行差異分析，得到這些差異基因主要與植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及抗逆性有關(guān)。郭丹丹等[8]用60對(duì)引物篩選出與紅花苞葉刺相關(guān)的基因片段，證實(shí)其可能參與了紅花刺性狀的形成，為紅花無刺品種的選育工作提供了重要方向。近期在動(dòng)物研究上也證實(shí)此分子標(biāo)記行之有效[9-10]。作為一個(gè)研究差異表達(dá)基因的重要手段，其簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、試驗(yàn)成本低，已被廣泛應(yīng)用[11]。但該技術(shù)在泡桐基因差異表達(dá)上尚未見實(shí)施，本試驗(yàn)采用cDNA-SRAP技術(shù)嘗試對(duì)白花泡桐莖和葉進(jìn)行差異分析，以期在分子層面上了解泡桐組織器官生長(zhǎng)發(fā)育過程中的基因表達(dá)情況，為泡桐分子機(jī)理研究提供參數(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料取自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)三區(qū)試驗(yàn)田，所選材料為白花泡桐幼莖和幼葉，于液氮條件下取材速凍，并帶回實(shí)驗(yàn)室保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

將組織樣品分別在液氮中充分研磨后，按照Total RNA Exractor(Trizol)試劑盒SK1312(生工生物工程(上海)股份有限公司)說明書步驟進(jìn)行RNA抽提，利用分光光度計(jì)分析所提取的RNA濃度，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，觀察28S rRNA和18S rRNA的比值及RNA的完整性。采用AMV反轉(zhuǎn)錄酶，Oligo dT和隨機(jī)引物(生工生物工程(上海)股份有限公司)混合反轉(zhuǎn)錄引物，按照SK2445試劑盒操作說明進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。

1.3 PCR擴(kuò)增及反應(yīng)檢測(cè)

PCR反應(yīng)體系為10×Buffer(含Mg2+)2.5 μL，cDNA模板0.5 μL，dNTP 2.5 mmol·L-11 μL，Taq DNA polymerase 5 U·μL-10.2 μL，F(xiàn)orward primer 10 nmol·L-10.5 μL，Reverse primer 10 nmol·L-10.5 μL，加雙蒸H2O至25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，36 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃修復(fù)延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)保存。將PCR產(chǎn)物(10 μL)加在2%瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔，在110 V電壓、196 mA電流下進(jìn)行電泳約1.5 h。電泳液為TAE緩沖液。

1.4 差異片斷的回收、克隆、測(cè)序

在瓊脂糖凝膠上找到兩次PCR擴(kuò)增重復(fù)性、特異性較好的差異條帶，參照SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)進(jìn)行切膠回收，以此回收片斷為模板，使用相同的SRAP引物，在相同體系程序條件下進(jìn)行2次PCR擴(kuò)增，并將此次所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)回收片斷是否為目的條帶，進(jìn)而將回收產(chǎn)物與pMD18-T載體(寶生物工程(大連)有限公司)連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過藍(lán)白斑篩選，挑選陽性克隆測(cè)序。

1.5 測(cè)序結(jié)果同源性比對(duì)分析

測(cè)序結(jié)果序列通過NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白花泡桐莖和葉RNA的提取

提取的RNA經(jīng)分光光度計(jì)檢測(cè)，OD260/OD280的值為1.9～2.0。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳圖(圖1)顯示，28S rRNA和18S rRNA兩條條帶清晰完整，無拖尾現(xiàn)象，且28S rRNA條帶亮度約為18S rRNA條帶亮度的2倍，說明提取的RNA可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

M:DNA marker;1，莖;2，葉。M:DNA marker;1，Stems;2，Leaves.

2.2 白花泡桐莖和葉的cDNA-SRAP差異顯示

通過對(duì)預(yù)試驗(yàn)64對(duì)引物的檢驗(yàn)，篩選出25對(duì)擴(kuò)增效果較好、條帶清晰的引物進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)(表1)。以白花泡桐莖和葉不同組織類型的逆轉(zhuǎn)錄第一條鏈為模板，通過進(jìn)行2次SRAP擴(kuò)增分析，從中篩選出23條有明顯差異表達(dá)的條帶，擴(kuò)增長(zhǎng)度主要在400～1 700 bp(圖2)，2次PCR擴(kuò)增重復(fù)率為66.8%。得到的差異片段有只在其中1個(gè)模板上單獨(dú)表達(dá)的片段，也有兩模板之間較為明顯表達(dá)量差異條帶，其中葉特異表達(dá)序列6個(gè)，莖特異表達(dá)2個(gè)，2者之間表達(dá)量差異序列15個(gè)，推測(cè)其可能與莖和葉生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控基因相關(guān)。

M:DNA marker; 1～7分別表示引物組合:F1R3、F1R4、F3R1、F3R2、F3R3、F4R3、F4R4。M:DNA marker; 1～7 show the primer combinations :F1R3、F1R4、F3R1、F3R2、F3R3、F4R3、F4R4.

編號(hào)Primercode正向引物(5’-3’)Forwardprimers(5’-3’)反向引物(5’-3’)Reverseprimers(5’-3’)F1R3TGAGTCCAAACCGGAGCGACTGCGTACGAATTGGTF1R4TGAGTCCAAACCGGAGCGACTGCGTACGAATTGTGF2R1TGAGTCCAAACCGGACGGACTGCGTACGAATTGCAF2R2TGAGTCCAAACCGGACGGACTGCGTACGAATTGACF2R3TGAGTCCAAACCGGACGGACTGCGTACGAATTGGTF3R1TGAGTCCAAACCGGATAGACTGCGTACGAATTGCAF3R2TGAGTCCAAACCGGATAGACTGCGTACGAATTGACF3R3TGAGTCCAAACCGGATAGACTGCGTACGAATTGGTF4R3TGAGTCCAAACCGGAATGACTGCGTACGAATTGGTF4R4TGAGTCCAAACCGGAATGACTGCGTACGAATTGTGF5R2TGAGTCCAAACCGGGAGGACTGCGTACGAATTGACF6R2TGAGTCCAAACCGGGGAGACTGCGTACGAATTGACF6R3TGAGTCCAAACCGGGGAGACTGCGTACGAATTGGTF7R2TGAGTCCAAACCGGGCTGACTGCGTACGAATTGACF7R3TGAGTCCAAACCGGGCTGACTGCGTACGAATTGGTF7R4TGAGTCCAAACCGGGCTGACTGCGTACGAATTGTGF8R3TGAGTCCAAACCGGGTCGACTGCGTACGAATTGGTF9R2TGAGTCCAAACCGGTACGACTGCGTACGAATTGACF10R3TGAGTCCAAACCGGTCAGACTGCGTACGAATTGGTF11R4TGAGTCCAAACCGGTGTGACTGCGTACGAATTGTGF12R3TGAGTCCAAACCGGTTGGACTGCGTACGAATTGGTF13R3TGAGTCCAAACCGGCGGGACTGCGTACGAATTGGTF13R4TGAGTCCAAACCGGCGGGACTGCGTACGAATTGTGF15R4TGAGTCCAAACCGGCAAGACTGCGTACGAATTGTGF16R1TGAGTCCAAACCGGCTTGACTGCGTACGAATTGCA

2.3 差異條帶的回收、測(cè)序及序列分析

將重復(fù)性穩(wěn)定性好的差異條帶進(jìn)行切膠回收，進(jìn)行2次PCR擴(kuò)增后，結(jié)果顯示所回收條帶為目的差異片斷(圖3)，通過產(chǎn)物與載體連接轉(zhuǎn)化之后，挑選陽性克隆測(cè)序，所得測(cè)序結(jié)果通過BLAST比對(duì)分析序列(表2)，結(jié)果顯示23條片段序列分為6類：蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因、細(xì)胞壁生物合成與修飾相關(guān)基因、信號(hào)傳導(dǎo)與脅迫響應(yīng)相關(guān)基因、能量與代謝相關(guān)基因、部分多重功能相關(guān)基因及未知功能基因[12-17](表3)。其中，1個(gè)是雙組分系統(tǒng)(F3R1J1000)，在植物應(yīng)對(duì)外界環(huán)境刺激和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用；2個(gè)是關(guān)于細(xì)胞壁水解酶(F3R3Y700、F6R3Y1100)；1個(gè)是鈣離子依賴的蛋白激酶(F5R2Y400)調(diào)控信號(hào)通路；1個(gè)是氨酰tRNA合成酶(F6R3J600)；1個(gè)是光系統(tǒng)反應(yīng)中心Ⅱ D2蛋白(F3R3Y1100)；1個(gè)是葉綠體AtpA(F7R4Y800)；1個(gè)是光反應(yīng)中心A1脫輔基蛋白(F8R3Y600)；1個(gè)是半胱氨酸脫硫酶(F15R4Y1700)可能參與植物莖和葉的衰老過程。

M:DNA marker;A、B、C、D分別代表引物F1R3、F3R1、F3R3擴(kuò)增出的部分差異片斷。M:DNA marker; A、B、C、D repectively represent partial differential fragments amplified by primers F1R3, F3R1, and F3R3.

編號(hào)Code序列長(zhǎng)度/bpLengthofsequencesGenBank登錄號(hào)GenBank accessionNO. 相似序列 Similarsequence 物種 Species E值 Evalue F1R3Y11001196AAU10479.1PsbC,partial(chloroplast)Ipomopsisaggregata1e-49F3R1J10001038SDW06046.1Two-componentsystem,OmpRfamily,phosphateregulonsensorhistidinekinasePhoRHydrobacterpenzbergensis2e-133F3R3Y700752AGV54820.1Cellwall-associatedhydrolasePhaseolusvulgaris7e-77F3R3Y11001204ALN96514.1photosystemIIproteinD2(chloroplast)Castanopsisconcinna0.0F4R4J600684XP_013442963.1Senescence-associatedprotein,putativeMedicagotruncatula1e-110F5R2Y400397AHA61365.1Calcium-dependentproteinkinaseArachishypogaea7e-22F6R3J600628SDW23636.1Tryptophanyl-tRNAsynthetaseHydrobacterpenzbergensis9e-107F6R3Y11001253SDW74997.1AlphagalactosidaseAHydrobacterpenzbergensis0.0F7R2Y1000963YP_173415.1HypotheticalproteinNitaMp073Nicotianatabacum2e-36F7R2J550539XP_013442963.1Senescence-associatedprotein,putativeMedicagotruncatula1e-102F7R3Y11001211AAU10479.1PsbC,partial(chloroplast)Ipomopsisaggregata1e-49F7R4Y800780YP_009270897.1AtpA(chloroplast)Perillasetoyensis2e-163F8R3J800791AGC78890.1Hypotheticalprotein(mitochondrion)Viciafaba1e-103F8R3Y600593CCQ48570.2PhotosystemIP700chlorophyllaapoproteinA1Dicentraeximia1e-124F2R2J800773SDX40875.1RibonucleaseBN,tRNAprocessingenzymeHydrobacterpenzbergensis0.0F2R2J10001010WP_026769529.1HypotheticalproteinAsinibacteriumsp.OR530.0F2R3Y12001196AAU10479.1PsbC,partial(chloroplast)Ipomopsisaggregata1e-49F9R2J10001014WP_026769529.1HypotheticalproteinAsinibacteriumsp.OR530.0F10R3Y700678YP_001109497.1HypotheticalproteinPoptr_cp018Populustrichocarpa2e-40F12R3Y12001210AAU10479.1PsbC,partial(chloroplast)Ipomopsisaggregata1e-49F13R3J700694XP_013442971.1Senescence-associatedprotein,putative,partialMedicagotruncatula2e-104F13R4J800830XP_017630340.1UncharacterizedproteinGossypiumarboreum4e-153F15R4Y17001167SDX53024.1CysteinedesulfuraseHydrobacterpenzbergensis6e-148

表3 泡桐莖和葉差異表達(dá)基因的功能分類Table 3 Functional classification of genes expression in stems and leaves of Paulownia

3 結(jié)論與討論

對(duì)于他類可用于差異基因篩選的分子技術(shù)而言，cDNA-SRAP分子標(biāo)記技術(shù)在同樣保持穩(wěn)定性好、條帶豐富的前提下，操作程序更為簡(jiǎn)便，相對(duì)來說對(duì)儀器設(shè)施等要求亦不高，試驗(yàn)成本更少；且試驗(yàn)操作不僅適用于同種之間差異表達(dá)分析，同樣適用于不同種之間或者同一植株、不同組織之間等多個(gè)樣本同時(shí)差異分析，近年來已廣泛應(yīng)用于基因差異表達(dá)研究上[18-20]。在本試驗(yàn)過程中，為避免假陽性結(jié)果的過多出現(xiàn)，在嚴(yán)謹(jǐn)操作步驟、操作手法的同時(shí)，采取重復(fù)操作試驗(yàn)措施，另外，由于試驗(yàn)采用瓊脂糖凝膠電泳成像系統(tǒng)，以肉眼觀測(cè)來評(píng)判和篩選所得到的差異結(jié)果，存在一定主觀性，不能完整完善地獲取所有有效信息，這些皆是分子試驗(yàn)中可能存在的弊端，在試驗(yàn)操作中，可以與其他分子標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的方式進(jìn)行生物學(xué)信息探索。

本試驗(yàn)以白花泡桐幼莖和幼葉為研究材料，采用cDNA-SRAP分子技術(shù)方法，來探究泡桐生長(zhǎng)初期組織器官間的差異表達(dá)，最終獲得在白花泡桐莖和葉間的差異表達(dá)片段中16條與已知功能基因同源性比較高的序列和7條未知功能基因的序列，包含能量與代謝、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞壁相關(guān)、信號(hào)傳導(dǎo)與脅迫響應(yīng)及復(fù)合影響等多個(gè)方面，推測(cè)這些基因可能參與泡桐莖和葉生長(zhǎng)發(fā)育及調(diào)控過程，且部分基因在莖和葉組織器官間有明顯表達(dá)量差異，表明了cDNA-SRAP技術(shù)在對(duì)白花泡桐差異分析試驗(yàn)上的可行性，從中獲得的生長(zhǎng)調(diào)控相關(guān)基因可進(jìn)一步用于生長(zhǎng)機(jī)制分子機(jī)理研究，同時(shí)可擴(kuò)大差異分析體系以檢測(cè)更多有效片段序列，為確定所得差異表達(dá)基因的準(zhǔn)確相關(guān)性，使用Quantitative Real-time PCR或其他功能驗(yàn)證進(jìn)一步檢測(cè)確定結(jié)果。

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DifferentialexpressionanalysisofstemandleafinPaulowniafortuneibycDNA-SRAP

RU Guangxin，ZHOU Shuangqing，ZHU Xiuhong，LIU Xiaonan，WANG Yunrui

(College of Forestry，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China)

The stem and leaf ofPaulowniafortuneito analyze the differential gene expression with the method of cDNA-SRAP. Among the 64 pairs of primers, 25 pairs of primers were screened with good amplification effect, and 36 differential fragments were detected. The repetition rate of the two times PCR amplification was about 66.8%. After being selected, cloned, and sequenced, 23 fragments of the differential sequence were measured, and the length was between 400 and 1 700bp.According to the genomic database, sequence analysis showed that 16 fragments have significant homologous nucleotide sequence and 7 fragments with unknown function gene sequence has high homology.

cDNA-SRAP;Paulowniafortunei; differential fragments; functional analysis

2017-03-13

國(guó)家科技支撐計(jì)劃專題(2013BAD01B06)；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(1402103020)

茹廣欣(1963-)，男，河南洛陽人，教授，博士，主要從事為林木遺傳育種方面的研究。

朱秀紅(1966-)，女，河南信陽人，教授。

1000-2340(2017)04-0481-06

S 722

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(責(zé)任編輯：李 瑩)