高愛梅+程曉莉

[摘要] 目的 探討芹菜素（APG）對(duì)裸鼠肝癌皮下移植瘤的抑制作用及其相關(guān)機(jī)制。 方法 建立人肝癌阿霉素（ADM）耐藥細(xì)胞BEL-7402/ADM裸鼠皮下移植瘤模型，24只移植成功的裸鼠隨機(jī)分為三組：對(duì)照組（ADM 3 mg/kg）、APG組（APG 50 mg/kg+ADM 3 mg/kg）和miR-101 mimics組（miR-101 mimics 5 mg/kg+ADM 3 mg/kg），每組8只。上述藥物每3天注射l次，共7次。給藥結(jié)束后處死裸鼠，切取移植瘤組織。免疫組化法檢測(cè)Ki-67蛋白表達(dá)評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞增殖，免疫蛋白印跡法檢測(cè)腫瘤組織核轉(zhuǎn)錄因子紅細(xì)胞系相關(guān)因子-2（Nrf2）蛋白的表達(dá)，qRT-PCR法測(cè)定移植瘤組織miR-101水平。 結(jié)果 與對(duì)照組相比，APG和miR-101 mimics能顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)（P < 0.05），抑制腫瘤細(xì)胞增殖（P < 0.05或P < 0.01），此外，APG和miR-101 mimics還能下調(diào)腫瘤組織Nrf2蛋白的表達(dá)（P < 0.01），上調(diào)miR-101表達(dá)（P < 0.05）。 結(jié)論 APG能有效抑制肝癌移植瘤生長(zhǎng)，其機(jī)制可能與抑制腫瘤細(xì)胞增殖，上調(diào)miR-101表達(dá)和下調(diào)Nrf2表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 芹菜素；肝癌；化療增敏；核轉(zhuǎn)錄因子紅細(xì)胞系相關(guān)因子-2；miR-101

[中圖分類號(hào)] R965 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）09（b）-0009-04

Inhibiting effect of apigenin on hepatocellar carcinoma xenografts in nude mice

GAO Aimei1 CHENG Xiaoli2

1.Department of Pharmacy， the Fifth People′s Hospital of Shanghai， Fudan University， Shanghai 200240， China； 2.Department of Pharmacy， Shenzhen Bao′an District Maternity and Child Health Care Hospital， Guangdong Province， Shenzhen 518133， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of apigenin （APG） on hepatocellar carcinoma xenografts in nude mice and the possible molecular mechanism. Methods Models of nude mice were transplanted with BEL-7402/doxorubicin （ADM）， and randomly divided into 3 groups， each group had 8 mice. The groups of mice were treated i.p. as follow： ADM （3 mg/kg， control group）， APG+ADM （50 mg/kg+3 mg/kg， APG group）， miR-101 mimics +ADM （5 mg/kg+3 mg/kg， miR-101 mimics group）， every three days for a total of seven times. The volumes of tumor were measured. After the end of medication， the mice were sacrificed for measurement of tumor weights. Tumor cell proliferation was analyzed by Ki-67 immunostaining. Nuclear factor erythroid-2-related factor 2 （Nrf2） protein level was measured by Western blot. miR-101 level was detected by Real-time PCR. Results The volumes and weights of tumors in APG group and miR-101 mimics group were decreased compared with the control group （P < 0.05）. Compared to the control group， APG and miR-101 mimics resulted in inhibition of tumor cell proliferation （P < 0.05 or P < 0.01）， inhibition of Nrf2 expression （P < 0.01）， and up-regulation of miR-101 levels （P < 0.05）. Conclusion APG can inhibit the growth of hepatocellar carcinoma， its mechanism may partly be to inhibit the expression of Ki-67 and Nrf2， up-regulate the level of miR-101.

[Key words] Apigenin； Hepatocellular carcinoma； Chemosensitization； Nrf2； miR-101endprint

芹菜素（4'，5，7-trihydroxyflavone，apigenin，APG）是天然存在的一種黃酮類化合物，廣泛存在于多種水果、蔬菜、豆類和茶葉中。研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素具有抗氧化、抗誘變、抗炎癥、抗腫瘤等多種藥理活性[1-4]。多項(xiàng)研究表明芹菜素對(duì)腫瘤具有抑制作用，其主要作用機(jī)制包括抗腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移以及抗氧化等[5-8]。因此，芹菜素作為一種天然高效低毒的抗腫瘤藥已成為目前腫瘤治療研究的熱點(diǎn)之一[9-10]。筆者前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，APG可逆轉(zhuǎn)人肝癌阿霉素（doxorubicin，ADM）耐藥細(xì)胞BEL-7402/ADM的耐藥，增強(qiáng)ADM化療敏感性，增加細(xì)胞內(nèi)ADM的蓄積[11]。APG這種協(xié)同抑癌作用可能與下調(diào)耐藥細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子紅細(xì)胞系相關(guān)因子-2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2）信號(hào)通路有關(guān)。為了進(jìn)一步研究APG在體內(nèi)的抗腫瘤活性，本研究構(gòu)建裸鼠肝癌皮下移植腫瘤動(dòng)物模型，探討APG的體內(nèi)抗腫瘤活性及相關(guān)機(jī)制，以期為肝癌耐藥的治療提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

APG，陜西慧科植物開發(fā)有限公司；RPMI-1640，美國(guó)GIBCO公司；小牛血清，杭州四季青生物工程公司；胰蛋白酶，美國(guó)Amresco公司；ADM，浙江海正藥業(yè)股份有限公司；鼠抗人Ki-67單克隆抗體、即用型二步法（非生物素）免疫組化檢測(cè)試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗人Nrf2抗體，美國(guó)Santa Cruz Biotechnology 公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG，美國(guó)Jackson免疫研究實(shí)驗(yàn)室；TRIzol，美國(guó)Invitrogen公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，TaKaRa公司；定量PCR儀，美國(guó)ABI公司。

1.2 細(xì)胞和動(dòng)物

BEL-7402/ADM人肝癌耐藥細(xì)胞購(gòu)自南京凱基生物科技公司，常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。BALB/c-nu雌性裸小鼠，體重為22～24 g，鼠齡4～5周，購(gòu)于北京華阜康生物公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2014-0004。按規(guī)定飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的SPF屏障系統(tǒng)內(nèi)。

1.3 裸鼠肝癌模型的建立及分組給藥

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BEL-7402/ADM細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化，離心洗滌2次后，用生理鹽水調(diào)整至濃度為3×107/mL。取細(xì)胞懸液0.3 mL，用1 mL注射器將細(xì)胞接種到裸鼠右腋下皮下組織，10 d左右可觸及米粒大小結(jié)節(jié)。挑選出體積為50 mm3左右的裸鼠24只進(jìn)行分組：對(duì)照組（ADM 3 mg/kg腹腔注射）、APG組（APG 50 mg/kg+ADM 3 mg/kg腹腔注射）和miR-101 mimics組（miR-101 mimics 5 mg/kg瘤內(nèi)注射+ADM 3 mg/kg）腹腔注射，每組8只。上述藥物每3天腹腔注射l次，共7次。給藥后每3天測(cè)移植瘤體積。移植瘤體積按公式V=ab2/2（a=瘤長(zhǎng)，b=瘤寬）計(jì)算[12-14]，并繪制生長(zhǎng)曲線。末次給藥后第2天，頸部脫臼法處死荷瘤鼠，剝離瘤體，觀察大體形態(tài)并稱取瘤重。

1.4 免疫組化檢測(cè)

瘤組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后包埋脫水，制成5 mm厚的切片。切片常規(guī)脫蠟，加入3%過(guò)氧化氫室溫孵育10 min，PBS漂洗3次；用0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液微波修復(fù)5 min，PBS漂洗3次；加入正常兔血清37℃孵育15 min，以封閉非特異性抗原；加一抗Ki-67多克隆抗體（1∶200），37℃孵育2 h，PBS漂洗3次；滴加相應(yīng)的二抗，37℃孵育20 min，PBS漂洗3次；DAB顯色，蘇木精復(fù)染核，逐級(jí)脫水，透明，封片。染色結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核可見棕黃色顆粒，即Ki-67染色陽(yáng)性表達(dá)。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均增殖指數(shù)。增殖指數(shù)=（陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.5 Western blot檢測(cè)

取適量瘤組織，攪碎成勻漿，裂解獲得蛋白。根據(jù)BCA試劑盒說(shuō)明對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。蛋白上樣，SDS凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，一抗孵育，4℃過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h，于凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用Image J軟件對(duì)各抗體條帶灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)

TRIzol提取組織總RNA，按試劑盒說(shuō)明將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以U6為內(nèi)參。miR-101上游引物：5′-CGGCGGTACAGTA CTGTGATAA-3′，下游引物5′-CTGGTGTCGTGGAGTC？鄄GGCAATTC-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCA？鄄CA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTG？鄄CGT-3′。反應(yīng)條件：95℃ 15 min，95℃ 15 s，55℃ 20 s，70℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用2-ΔΔCt方法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠一般情況和腫瘤生長(zhǎng)狀況

接種10 d左右，裸鼠皮下可見粟粒大小的類圓形結(jié)節(jié)，質(zhì)硬，不可活動(dòng)。在接種后的前20 d，腫瘤增長(zhǎng)緩慢，裸鼠精神良好，反應(yīng)敏捷，飲食、大小便及活動(dòng)正常，移植瘤未見破潰；在接種后的第21～30天，腫瘤增長(zhǎng)速度開始加快，裸鼠精神狀態(tài)較之前變得萎靡不振、活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍、消瘦等；從第30天以后，腫瘤增長(zhǎng)速度更加迅速，裸鼠變得愈加萎靡不振，基本上不活動(dòng)，飲食和飲水量急劇減少，身體愈加消瘦。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)裸鼠意外死亡。endprint

2.2 抗腫瘤作用

待移植模型成功建立后（接種后第21天）確定分組并開始給藥。治療開始后每3天測(cè)量一次移植瘤體積，并繪制生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，對(duì)照組腫瘤生長(zhǎng)最快。與對(duì)照組相比，APG、miR-101 mimics組移植瘤生長(zhǎng)受到明顯抑制。用藥結(jié)束后處死裸鼠，剝離瘤體，觀察其大體形態(tài)可見：腫瘤呈結(jié)節(jié)狀，包膜完整，血供豐富，切面呈灰白色，無(wú)周圍組織浸潤(rùn)及出血壞死灶。移植瘤稱重結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，APG、miR-101 mimics組瘤重均呈不同程度的抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；APG組與miR-101 mimics組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見圖1。

2.3 肝癌移植瘤組織Ki-67的表達(dá)

Ki-67是反映細(xì)胞增殖活性的細(xì)胞核抗原。結(jié)果顯示，Ki-67抗原表達(dá)于移植瘤細(xì)胞核內(nèi)，陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色或棕褐色，其中對(duì)照組腫瘤組織可見大量片狀棕黃色陽(yáng)性表達(dá)，而其余各治療組細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)較對(duì)照組少。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，APG與miR-101 mimics均可抑制移植瘤細(xì)胞增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01或P < 0.05）；APG組與miR-101 mimics組比較，Ki-67的表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖2（封三）。

2.4 Western blot檢測(cè)移植瘤組織Nrf2蛋白表達(dá)

Western blot測(cè)定移植瘤組織Nrf2蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在APG及miR-101 mimics組Nrf2蛋白的表達(dá)明顯低于對(duì)照組（P < 0.01），提示APG與miR-101 mimics抑制肝癌移植瘤的作用可能與下調(diào)Nrf2蛋白有關(guān)。APG組與miR-101 mimics組比較，Nrf2蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見圖3。

2.5 qRT-PCR檢測(cè)移植瘤組織miR-101的表達(dá)

結(jié)果顯示，在APG及miR-101 mimics組，miR-101的表達(dá)明顯高于對(duì)照組（P < 0.05），提示APG及miR-101 mimics抑制肝癌移植瘤的作用可能與上調(diào)miR-101有關(guān)。APG組與miR-101 mimics組比較，miR-101的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見圖4。

3 討論

化療是肝癌綜合治療的重要手段之一。ADM是常用的肝癌化療藥，屬細(xì)胞周期非特異性藥物，具有強(qiáng)烈細(xì)胞毒性，可抑制腫瘤細(xì)胞RNA和DNA合成[15]，但其副作用也非常明顯，主要表現(xiàn)為多器官毒性，包括肝毒性、心臟毒性和骨髓抑制等，且長(zhǎng)期應(yīng)用還容易降低機(jī)體敏感性，導(dǎo)致化療失敗[16]。因此，在肝癌化療過(guò)程中降低化療藥毒副作用，增強(qiáng)其敏感性，提高化療效果己成為目前亟待解決的難題。

前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，APG在體外可明顯增加BEL-7402/ADM對(duì)抗腫瘤藥的敏感性，其機(jī)制與下調(diào)PI3K/Akt/Nrf2信號(hào)通路有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了BEL-7402/ADM裸鼠肝癌皮下移植瘤模型，進(jìn)一步研究了APG在體內(nèi)對(duì)肝癌細(xì)胞的作用。結(jié)果顯示，APG組和miR-101 mimics組腫瘤生長(zhǎng)均較對(duì)照組明顯減慢；比較各組抑瘤率結(jié)果顯示，APG組和miR-101 mimics組瘤重均呈不同程度的抑制。Ki-67是與細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原，它是存在于增生細(xì)胞核的一種非組蛋白核蛋白，故可用于識(shí)別生長(zhǎng)中的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，評(píng)價(jià)細(xì)胞增生情況[17-20]。免疫組化結(jié)果顯示，APG組與miR-101 mimics組的增殖指數(shù)明顯低于對(duì)照組；上述體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，APG與miR-101 mimics可能通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖，從而起到增強(qiáng)ADM抗癌效果的作用；進(jìn)一步Western blot檢測(cè)瘤組織Nrf2蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，APG與miR-101 mimics能夠降低移植瘤Nrf2蛋白的表達(dá)；qRT-PCR法測(cè)定瘤組織的miR-101水平，結(jié)果顯示，在APG及miR-101 mimics組，miR-101的表達(dá)明顯高于對(duì)照組。提示APG增加BEL-7402/ADM對(duì)ADM的敏感性可能與miR-101和Nrf2有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示APG可能通過(guò)上調(diào)腫瘤組織miR-101表達(dá)、下調(diào)腫瘤組織Nrf2表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，進(jìn)而有效提高肝癌細(xì)胞對(duì)ADM的化療敏感性，促進(jìn)其抗癌療效。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Shukla S，Maclennan GT，F(xiàn)u P，et al. Apigenin Attenuates Insulin Like Growth Factor I Signaling in an Autochthonous Mouse Prostate Cancer Model [J]. Pharm Res，2012，29（6）：1506-1517.

[2] Tong X，Pelling JC. Targeting the PI3K/Akt/mTOR axis by apigenin for cancer prevention [J]. Anticancer Agents Med Chem，2013，13（7）：971-978.

[3] Seo HS，Ku JM，Choi HS，et al. Apigeninovercomes drug resistance by blocking the signal transducer and activator of transcription 3 signaling in breast cancer cells [J]. Oncol Rep，2017，38（2）：715-724.

[4] Bao YY，Zhou SH，F(xiàn)an J，et al. Anticancer mechanism of apigenin and the implications of GLUT-1 expression in head and neck cancers [J]. Future Oncol，2013，9（9）：1353-1364.endprint

[5] Lu HF，Chie YJ，Yang MS，et al. Apigenin induces caspase-dependent apoptosis in human lung cancer A549 cells through Bax- and Bcl-2-triggered mitochondrial pathway [J]. Int J Oncol，2010，36（6）：1477-1484.

[6] Shukla S，Gupta S. Apigenin：a promising molecule for cancer prevention [J]. Pharm Res，2010，27（6）：962-978.

[7] Bauer D，Redmon N，Mazzio E，et al. Apigenininhibits TNFα/IL-1α-induced CCL2 release through IKBK-epsilon signaling in MDA-MB-231 human breast cancer cells [J]. PLoS One，2017，12（4）：e0175558.

[8] Salmani JMM，Zhang XP，Jacob JA，et al. Apigenin's anticancer properties and molecular mechanisms of action： Recent advances and future prospectives [J]. Chin J Nat Med，2017，15（5）：321-329.

[9] Nabavi SM，Habtemariam S，Daglia M，et al. Apigeninand Breast Cancers： From Chemistry to Medicine [J]. Anticancer Agents Med Chem，2015，15（6）：728-735.

[10] Bao YY，Zhou SH，F(xiàn)an J，et al. Anticancer mechanism ofapigeninand the implications of GLUT-1 expression in head and neck cancers [J]. Future Oncol，2013，9（9）：1353-1364.

[11] Gao AM，Ke ZP，Wang JN，et al. Apigenin sensitizes doxorubicin-resistant hepatocellular carcinoma BEL-7402/ADM cells to doxorubicin via inhibiting PI3K/Akt/Nrf2 pathway [J]. Carcinogenesis，2013，34（8）：1806-1814.

[12] Chen Y，Zhang L，Yang C，et al. Discovery of benzenesulfonamide derivatives as potent PI3K/mTOR dual inhibitors with in vivo efficacies against hepatocellular carcinoma [J]. Bioorg Med Chem，2016，24（5）：957-966.

[13] Chen X，Guo H，Li F，et al. Physcion 8-O-β-glucopyranoside suppresses the metastasis of breastcancerinvitro andin vivoby modulating DNMT1 [J]. Pharmacol Rep，2017， 69（1）：36-44.

[14] Jain M，Zhang L，He M，et al. Interleukin-13 receptor alpha2 is a novel therapeutic target for human adrenocortical carcinoma [J]. Cancer，2012，118（22）：5698-5708.

[15] Koleini N，Kardami E. Autophagy and mitophagy in the context of doxorubicin-induced cardiotoxicity [J]. Oncotarget，2017，8（28）：46663-46680.

[16] Ni W，Chen B，Zhou G，et al. Overexpressed nuclear BAG-1 in human hepatocellular carcinoma is associated with poor prognosis andresistancetodoxorubicin [J]. J Cell Biochem，2013，114（9）：2120-2130.

[17] Fisher G，Yang ZH，Kudahetti S，et al. Prognostic value of Ki-67 for prostate cancer death in a conservatively managed cohort [J]. Br J Cancer，2013，108（2）：271-277.

[18] Park SY，Piao Y，Thomas C，et al.Cdc2-like kinase 2 is a key regulator of the cell cycle via FOXO3a/p27 in glioblastoma[J].Oncotarget，2016，7（18）：26793-26805.

[19] Duregon E，Bertero L，Pittaro A，et al. Ki-67proliferation index but not mitotic thresholds integrates the molecular prognostic stratification of lower grade gliomas [J]. Oncotarget，2016，7（16）：21190-21198.

[20] May M，Burger M，Otto W，et al. Ki-67，mini-chromosome maintenance 2 protein（MCM2）and geminin have no independent prognostic relevance forcancer-specific survival in surgically treated squamous cell carcinoma of the penis [J]. BJU Int，2013，112（4）：E383-E390.

（收稿日期：2017-06-12 本文編輯：程 銘）endprint