王立新++王元松　蘇陽(yáng)　田風(fēng)勝++崔榮崗

[摘要] 目的 探討復(fù)榮通脈膠囊對(duì)糖尿病大鼠心肌Smad7蛋白表達(dá)的影響。 方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只大鼠分為正常組（10只）、造模組（50只）。成模后，將40只糖尿病大鼠隨機(jī)分為糖尿病組和復(fù)榮通脈低、中、高劑量組，每組各10只。復(fù)榮通脈低、中、高劑量組分別給予復(fù)榮通脈膠囊0.7、1.4、2.8 g/kg灌胃，正常組和糖尿病組給予等量純凈水灌胃。8周后，留取大鼠心肌制備病理切片，觀察各組血糖、血脂及Smad7蛋白的陽(yáng)性表達(dá)。 結(jié)果 治療前、治療8周后，糖尿病組和復(fù)榮通脈低、中、高劑量組血糖水平均明顯高于正常組（P < 0.05），各組大鼠組內(nèi)治療前后血糖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。治療8周后，糖尿病組和復(fù)榮通脈低、中、高劑量組總膽固醇、三酰甘油水平均明顯高于正常組（P < 0.05）。正常組Smad7蛋白表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，糖尿病組和復(fù)榮通脈低、中、高劑量組Smad7蛋白表達(dá)均明顯下降（P < 0.05﹚；與糖尿病組、復(fù)榮通脈低劑量組比較，復(fù)榮通脈中、高劑量組Smad7蛋白高表達(dá)（P < 0.05﹚。 結(jié)論 復(fù)榮通脈膠囊具有上調(diào)糖尿病大鼠心肌Smad7蛋白表達(dá)、抑制糖尿病心肌細(xì)胞損傷的作用。

[關(guān)鍵詞] 復(fù)榮通脈膠囊；糖尿??；心??；Smad7蛋白

[中圖分類號(hào)] R587.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）09（b）-0017-04

Effect of Furong Tongmai Capsules on Smad7 expression in myocardium of rats with diabetes mellitus

WANG Lixin WANG Yuansong SU Yang▲ TIAN Fengsheng CUI Ronggang

Department of Endocrinology， Clinical Medical College of Integrated Chinese and Western Medicine in Cangzhou Affiliated to Hebei Medical University， Hebei Province， Cangzhou 061001， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of Furong Tongmai Capsules on Smad7 expression in myocardium of rats with diabetes mellitus. Methods Sixty rats were randomly divided into normal group （10 rats） and model group （50 rats） by random number table method. After the model was made， 40 rats with diabetes mellitus were randomly divided into diabetes mellitus group and low， medium， high dose group of Furong Tongmai Capsules， with 10 rats in each group. Low， medium， high dose group of Furong Tongmai Capsules were given 0.7， 1.4， 2.8 g/kg of Furong Tongmai Capsules by gavage， normal group and diabetes mellitus group were given equal quantity of purified water. After 8 weeks， the myocardium in rats was preserved to make pathological section. The positive expression of blood glucose， blood lipid， Smad7 protein in each group was observed. Results Before treatment and after treatment for 8 weeks， the levels of blood glucose in diabetes mellitus group and low， medium， high dose group of Furong Tongmai Capsules were all higher than those of normal group （P < 0.05）， while there were no significant differences of blood glucose within each group before and after treatment （P > 0.05）. After treatment for 8 weeks， the levels of total cholesterol， triacylglycerol in diabetes mellitus group and low， medium， high dose group of Furong Tongmai Capsules were all higher than those of normal group （P < 0.05）. The Smad7 of normal group showed high positive expression， which of diabetes mellitus group and low， medium， high dose group of Furong Tongmai Capsules was all decreased （P < 0.05）； compared with diabetes mellitus group and low dose group of Furong Tongmai Capsules， the Smad7 expression of medium， high dose group of Furong Tongmai Capsules was increased significantly （P < 0.05）. Conclusion Furong Tongmai Capsules have the function of increasing the Smad7 expression in myocardium of rats with diabetes mellitus， inhibiting myocardial cell injury.endprint

[Key words] Furong Tongmai Capsules； Diabetes mellitus； Myocardium； Smad7

糖尿病心肌病是由于高血糖導(dǎo)致的心肌損害，其病理特點(diǎn)為廣泛灶性心肌壞死，可導(dǎo)致心力衰竭、心源性休克及嚴(yán)重心律失常，危及生命。目前臨床常用的治療方法是在降糖的基礎(chǔ)上改善微循環(huán)和心肌細(xì)胞代謝。我們?cè)谂R床觀察中發(fā)現(xiàn)，復(fù)榮通脈膠囊對(duì)糖尿病合并心肌病有可靠療效，同時(shí)我們通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，復(fù)榮通脈膠囊可以降低大鼠血清ADMA水平及NF-κB表達(dá)，增強(qiáng)內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）表達(dá)[1]。在另外一組實(shí)驗(yàn)中，復(fù)榮通脈膠囊可降低大鼠血清內(nèi)皮素1（ET-1），升高NO，抑制纖溶酶原激活物抑制物1（PAI-1），促進(jìn)組織型纖溶酶原激活物（t-PA）在大鼠胸主動(dòng)脈的表達(dá)，改善血管內(nèi)皮功能紊亂，調(diào)節(jié)纖溶系統(tǒng)，對(duì)糖尿病大血管病變有治療作用[2]，但其作用機(jī)制尚未完全闡明?，F(xiàn)將復(fù)榮通脈膠囊對(duì)糖尿病大鼠心肌Smad7蛋白表達(dá)影響的研究報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用2月齡雄性Wistar大鼠60只，體重200～250 g，SPF級(jí)，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證編號(hào)：1405034，單位許可證號(hào)：SCXK（冀）2013-1-003。

1.2 藥物

復(fù)榮通脈膠囊藥物組成：水蛭、地龍、全蝎、黃芪、當(dāng)歸、玄參、葛根、首烏藤、川牛膝、穿山龍、甘草。由河北醫(yī)科大學(xué)附屬滄州中西醫(yī)結(jié)合臨床醫(yī)學(xué)院中藥制劑科提供，每粒0.5 g，含生藥2 g。冀藥制字：Z20070041。

1.3 試劑及儀器

鏈脲佐菌素（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)S0130-1G）；檸檬酸鈉（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)S8220）；Smad7免疫組化試劑盒（淼森科技有限公司）；電子血糖儀（德國(guó)羅氏羅康全活力型）；全自動(dòng)生化分析儀（日本日立7600-010）；光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯BX51T-PHD-J11）；離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf-5430）；石蠟切片機(jī)（德國(guó)萊卡RM2015）；DSHZ-300型恒溫水浴箱（江蘇太倉(cāng)醫(yī)用儀器廠）。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組及模型的建立 造模前12 h禁食，自由飲水。將60只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行分組，造模組（50只）、正常組（10只）。按文獻(xiàn)[3-4]的方法造模：將1%鏈脲佐菌素（STZ）溶于0.1 mmol/L、pH=4.2的無菌檸檬酸緩沖液，腹腔注射60 mg/kg，正常組大鼠注射相同劑量的檸檬酸緩沖液。注射3 d后測(cè)大鼠隨機(jī)血糖，由尾靜脈取血，血糖≥16.7 mmol/L提示造模成功。造模成功44只。

1.4.2 分組與給藥 成模后采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只糖尿病大鼠分為糖尿病組、復(fù)榮通脈低劑量組、復(fù)榮通脈中劑量組、復(fù)榮通脈高劑量組，每組各10只。正常組和糖尿病組每日給予純凈水10 mL/kg灌胃，復(fù)榮通脈低、中、高劑量組首先換算出大鼠的藥物治療等效劑量（通過人體-大鼠體表面積比值表）[5]，分別給予0.7、1.4、2.8 g/kg灌胃，糖尿病組和正常組用相同容量純凈水灌胃，灌胃容量10 mL/kg，每日1次，連續(xù)8周。飼養(yǎng)條件：自由進(jìn)食水，普通飼料，每天重新配制灌胃藥物，室溫控制在23～26℃，日光燈照明，明暗各12 h，4籠1只。治療過程中糖尿病組和復(fù)榮通脈中、高劑量組各有1只大鼠死亡。

1.4.3 標(biāo)本的處理 治療8周后，各實(shí)驗(yàn)組大鼠制備標(biāo)本前1 d隔夜禁食12 h，自由飲水。麻醉方式采用3%戊巴比妥（80 mg/kg）腹腔內(nèi)注射。測(cè)尾靜脈血糖，解剖大鼠，通過腹主動(dòng)脈采血，室溫放置1 h后離心10 min，測(cè)總膽固醇（TC）及三酰甘油（TG）等生化指標(biāo)。

1.4.4 石蠟切片與免疫組化測(cè)定 用4%多聚甲醛固定大鼠心肌細(xì)胞，經(jīng)過脫蠟水化、透明、封片制備切片。切片厚度5 mm，經(jīng)免疫組化染色后，應(yīng)用計(jì)算機(jī)彩色病理圖文分析系統(tǒng)，分析陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞占整個(gè)視窗的百分比。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠治療前后血糖變化比較

治療前，糖尿病組與復(fù)榮通脈低、中、高劑量組血糖比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），但均較正常組明顯升高（P < 0.05）。治療8周后，糖尿病組與復(fù)榮通脈低、中、高劑量組血糖比較，差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），但與正常組相比，以上各組血糖仍明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。各組大鼠組內(nèi)治療前后血糖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

2.3 各組大鼠心肌Smad7蛋白表達(dá)比較

與正常組比較，糖尿病組及復(fù)榮通脈低、中、高劑量組Smad7的表達(dá)均明顯降低（P < 0.05﹚；與糖尿病組、復(fù)榮通脈低劑量組比較，復(fù)榮通脈中、高劑量組Smad7蛋白表達(dá)明顯升高（P < 0.05﹚；復(fù)榮通脈中劑量組與高劑量組Smad7蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表3。正常組可見Smad7（棕黃色顆粒樣）呈高表達(dá)，糖尿病組、復(fù)榮通脈低劑量組可見Smad7（棕黃色顆粒樣）呈低表達(dá)，復(fù)榮通脈中、高劑量組可見Smad7（棕黃色顆粒樣）呈中等表達(dá)。見圖1（封三）。

3 討論

我國(guó)2型糖尿病患病率為9.7%，成人糖尿病總數(shù)為9240萬[6]，糖尿病合并心腦血管疾病常見。長(zhǎng)期高血糖導(dǎo)致糖脂代謝紊亂，氧化應(yīng)激增加，出現(xiàn)線粒體腫脹、心肌細(xì)胞凋亡、心肌纖維化等細(xì)胞的改變[7]。氧化應(yīng)激和炎癥在糖尿病性心肌病的發(fā)生中有重要作用[8]。炎癥是糖尿病血管病變的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其水平高低直接影響血管病變的發(fā)生和發(fā)展[9]。心肌細(xì)胞Smad7的改變貫穿于多種心臟病理生理過程中，并可能在冠心病、心臟肥厚和心力衰竭等疾病中起到關(guān)鍵作用[10]。endprint

糖尿病大鼠心肌細(xì)胞中Smad7的蛋白表達(dá)水平顯著降低，Smad7抑制受體激活型SMAD信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)于心臟可能是一種保護(hù)作用[11]。通過安體舒通治療，大鼠心肌組織中Smad7的蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，可以有效改善心肌梗死后心力衰竭大鼠的心功能[12]。燈盞花素也可以通過升高Smad7的蛋白，改善糖尿病大鼠的心功能[13]。通過黃芪注射液和苓桂術(shù)甘湯干預(yù)心肌再灌注損傷的大鼠，可以增加心肌Smad7的表達(dá)，減少心肌細(xì)胞的凋亡[14-15]。

復(fù)榮通脈膠囊中水蛭為君，地龍、全蝎為臣，全方結(jié)合其他益氣養(yǎng)陰中藥，在既往實(shí)驗(yàn)及臨床研究中，我們觀察到其具有抗凝血、抗炎、改善微循環(huán)等藥理作用[16-18]，其抗炎治療可以改善細(xì)胞的氧化應(yīng)激，抑制炎癥因子，保護(hù)糖尿病大鼠的血管[19]。君藥水蛭可以上調(diào)大鼠心肌細(xì)胞Smad7蛋白的表達(dá)，抑制糖尿病大鼠心肌的病理改變[20]。

本研究通過模擬糖尿病大鼠高血糖導(dǎo)致心肌細(xì)胞受損，發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠心肌Smad7蛋白表達(dá)明顯下降，其參與介導(dǎo)了糖尿病大鼠的心肌損傷。用復(fù)榮通脈膠囊進(jìn)行干預(yù)后，中、高劑量組能夠明顯上調(diào)Smad7的表達(dá)，通過抑制Smad7信號(hào)傳導(dǎo)通路，減少心肌細(xì)胞的凋亡，兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果并無明顯差異，但低劑量組并無此種效果。

復(fù)榮通脈膠囊對(duì)大鼠心肌有保護(hù)作用，且具有劑量依賴效應(yīng)，但并非嚴(yán)格的線性關(guān)系，給予中等劑量治療最符合成本-效益比。

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（收稿日期：2017-06-02 本文編輯：張瑜杰）endprint