溫建輝，倪付勇，王雪晶，李 明，宋亞玲，王振中，蕭 偉

（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 連云港 222000）

Box-Behnken Design-響應(yīng)面法優(yōu)化綠原酸轉(zhuǎn)化為新綠原酸的工藝研究＊

溫建輝，倪付勇，王雪晶，李 明，宋亞玲，王振中，蕭 偉＊＊

（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 連云港 222000）

利用Box-Behnken-響應(yīng)面法優(yōu)化綠原酸轉(zhuǎn)化為新綠原酸的工藝條件。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken Design實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間及pH值對(duì)新綠原酸產(chǎn)率的影響,優(yōu)化綠原酸轉(zhuǎn)化為新綠原酸的工藝參數(shù),得到模型預(yù)測公式。優(yōu)化條件為：反應(yīng)溫度107℃，反應(yīng)時(shí)間60 min，pH值為4.72時(shí)新綠原酸產(chǎn)率為64.20%，與模型預(yù)測值接近，方程擬合良好。采用優(yōu)選工藝制備新綠原酸并精制純化，分別運(yùn)用HPLC、1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS等方法對(duì)其進(jìn)行含量測定和結(jié)構(gòu)表征，結(jié)果表明純化后純度達(dá)98.78%，收率為87.37%。

綠原酸 新綠原酸 Box-Behnken Design響應(yīng)面法 結(jié)構(gòu)鑒定

圖2 綠原酸轉(zhuǎn)化為新綠原酸反應(yīng)式

1 儀器與材料

1.1 儀器

分析液相：Agilent 1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司，250 mm×4.6 mm，5 μm），配自動(dòng)進(jìn)樣器、四元泵、MWD檢測器，制備液相：Agilent 1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司），四元泵、MWD檢測器,制備柱（美國Agilent公司，21.2 mm×250 mm）；Bruker-AV-400型核磁共振光譜儀；AE240電子分析天平（瑞士Mettler公司），實(shí)驗(yàn)室PH計(jì)FE20 Plus（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），石英三口燒瓶（廣州市精科儀器有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

綠原酸（自制，批號(hào)：130809，純度為99.14%），新綠原酸（批號(hào)MUST-10091501，純度＞98%，成都曼斯特生物科技有限公司提供），甲醇（色譜純，Oceanpak，瑞典），甲酸、濃鹽酸（分析純，南京化學(xué)試劑有限公司），雙蒸水（自制）。

2 新綠原酸的測定方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備

稱取新綠原酸對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色容量瓶中，加50%甲醇定容制成新綠原酸濃度為0.2 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

分別精密稱取以下各工序制備的新綠原酸粗品5.0 mg，置于25 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解，定容至刻度即得。

2.3 色譜條件

2.3.1 基本條件

色譜柱為Acuity C18（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相甲醇（A）-0.5%甲酸溶液（B），流速1.0 mL·min-1。梯度洗脫條件：0-40 min，15%-50%A；40-52 min，50%-100%A。進(jìn)樣體積10 μL，柱溫30℃，檢測波長326 nm[18-20]。

2.3.2 線性關(guān)系考察

取新綠原酸對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成所需濃度的對(duì)照品溶液，作為儲(chǔ)備液（2.6 mg·mL-1）。取儲(chǔ)備液0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL，置10 mL量瓶中，分別用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣，測定，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品濃度（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程為：Y=26.306X+0.395 4（r=1.000 0），新綠原酸在0.065-2.08 mg·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.3.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣，測定，連續(xù)6次。以新綠原酸的峰面積計(jì)算，RSD為1.2%，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取“2.2”項(xiàng)供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h分別進(jìn)樣，按“2.3.1”項(xiàng)色譜條件測定，以新綠原酸峰面積計(jì)算，結(jié)果RSD為0.84%，結(jié)果表明供試品溶液放置24 h穩(wěn)定。

3 單因素試驗(yàn)

新綠原酸轉(zhuǎn)化的影響因素主要有反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、pH值、溶劑濃度(甲醇)、綠原酸濃度等，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，從轉(zhuǎn)化的角度出發(fā)，將綠原酸濃度定為0.25 mg·mL-1，溶劑為50%甲醇溶液，結(jié)果顯示反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、pH值對(duì)新綠原酸含量影響較大。因此，對(duì)反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、pH值進(jìn)行設(shè)計(jì)單因素考察，每個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)平行考察三次，取含量均值作為測定結(jié)果。

3.1 溫度對(duì)新綠原酸含量的影響

取20 mg綠原酸用4倍量50%甲醇溶解，考察反應(yīng)時(shí)間為60 min，pH值為5.0條件下，不同的反應(yīng)溫度（90℃，100℃，110℃,120℃，130℃）對(duì)新綠原酸含量的影響。以“2.3.1”項(xiàng)下的條件測定當(dāng)中新綠原酸的含量，含量變化情況見圖3。結(jié)果表明，隨著溫度的升高，新綠原酸含量隨之增加，當(dāng)溫度超過110℃時(shí)，新綠原酸含量反而下降。因此，確定反應(yīng)溫度為110℃。

圖3 反應(yīng)溫度單因素考察

圖4 反應(yīng)時(shí)間單因素考察

圖5 pH值單因素考察

3.2 時(shí)間對(duì)新綠原酸含量的影響

取20 mg綠原酸用4倍量50%甲醇溶解，考察反應(yīng)溫度為100℃，pH值為5.0條件下，不同反應(yīng)時(shí)間（30、60、90、120、150 min）對(duì)新綠原酸含量的影響。以“2.3.1”項(xiàng)下條件測定當(dāng)中新綠原酸的含量，含量變化情況見圖4。結(jié)果表明，隨著時(shí)間的增加，新綠原酸含量隨之增加，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過60 min時(shí)，新綠原酸含量下降。因此，確定反應(yīng)時(shí)間為60 min。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

3.3 PH值對(duì)新綠原酸含量的影響

取20 mg綠原酸用4倍量50%甲醇溶解，考察反應(yīng)時(shí)間為60 min，反應(yīng)溫度110℃，不同的pH（3.0，4.0，5.0，6.0，7.0）對(duì)新綠原酸含量影響，以“2.3.1”項(xiàng)下條件測定當(dāng)中新綠原酸的含量，含量變化情況見圖5。結(jié)果表明，隨著pH值的增大，新綠原酸含量隨之增加，當(dāng)pH大值于5.0時(shí)，新綠原酸含量下降。因此，確定pH值為5.0。

3.4 新綠原酸轉(zhuǎn)化工藝優(yōu)選

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)新綠原酸的轉(zhuǎn)化工藝進(jìn)行優(yōu)化，以反應(yīng)溫度（A）、反應(yīng)時(shí)間（B）、pH值（C）為考察因素，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，每因素設(shè)3個(gè)水平，用代碼值-1，0，1表示，因素水平見表1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。以粗品中新綠原酸的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Design-Exoect V8.0.5軟件對(duì)綜合評(píng)分結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式方程擬合，得回歸方程：含量=62.17-4.54A-1.44B-2.51C+0.27AB+3.80AC-1.82BC-11.26A2-3.57B2-5.76C2，相關(guān)系數(shù)R2=0.969 6，說明建立的二次項(xiàng)模型與實(shí)驗(yàn)擬合較好。由表3響應(yīng)面二次回歸方程方差分析結(jié)果所示，模型P＜0.01，效應(yīng)面模型達(dá)到極顯著水平，影響新綠原酸轉(zhuǎn)化因素的主次順序?yàn)锳＞C＞B，其中因素A反應(yīng)溫度影響極顯著（P＜0.001），因素C（pH）影響顯著（P＜0.05），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），因素A和C的交互作用對(duì)新綠原酸的轉(zhuǎn)化是顯著的，表明二次方程預(yù)測值與實(shí)際值吻合度較高。方程對(duì)應(yīng)的等高線、三維效應(yīng)圖見圖6。

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)方差分析

3.5 新綠原酸轉(zhuǎn)化工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

通過求解回歸方程得到最佳轉(zhuǎn)化工藝參數(shù)為：反應(yīng)溫度107.49℃，反應(yīng)時(shí)間58.60 min，pH值為4.72，新綠原酸含量預(yù)測值為63.19%。結(jié)合實(shí)際試實(shí)際操作，確定反應(yīng)溫度為107℃，反應(yīng)時(shí)間60 min，pH值為4.72，以該參數(shù)進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果顯示，采用該工藝參數(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，新綠原酸的含量均值為64.20%，RSD值＜2%，與預(yù)測值的相對(duì)偏差為1.56%，基本與模型預(yù)測值一致，適合新綠原酸粗品的制備。新綠原酸粗品A（峰1為新綠原酸）和新綠原酸對(duì)照品B色譜圖（圖7）。

4 新綠原酸的制備

取綠原酸10.0g，以“3.5”項(xiàng)下的優(yōu)選條件進(jìn)行反應(yīng)，最終得到新綠原酸粗品9.12 g，用50%的甲醇溶解，離心取上清液進(jìn)樣，以10%乙腈為流動(dòng)相，流速20 mL·min-1，進(jìn)樣量 800 μL，柱溫為室溫，檢測波長326 nm，多次進(jìn)樣制備，收集液濃縮、干燥后得到新綠原酸的量為5.12 g，收率為87.37%。

5 新綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

取“4”項(xiàng)下制備的新綠原酸樣品，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜方法測定，用面積歸一化法計(jì)算，確定新綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.78%，新綠原酸樣品經(jīng)ESI-MS分析，m/z:353.090 4[M-H]-，計(jì)算相對(duì)分子量為354。

6 結(jié)構(gòu)鑒定

新綠原酸，白色粉末，ESI-MSm/z:353[M-H]-。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ:1.86-2.01(4H,m,H-2,H-6),3.78(1H,m,H-4),4.12(1H,m,H-3),5.21(1H,m,H-5),6.26(1H,d,J=16.0 Hz,H-8′),6.77(1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),6.95(1H,dd,J=2.0,8.0 Hz,H-6′),7.05(1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),7.50(1H,d,J=16.0 Hz,H-7′)；13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:35.1(C-2),38.6(C-6),70.3(C-3),70.6(C-4),67.3(C-5),72.6(C-1),114.5(C-2′),114.9(C-8′),115.8(C-5′),121.1(C-6′),125.7(C-1′),144.3(C-3′),144.7(C-7′),145.7(C-4′),166.3(C-9′),175.4(COOH)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道的新綠原酸一致。

7 總結(jié)與討論

新綠原酸為熱毒寧注射液中有效活性成分之一，是一種咖啡?？鼘幩犷惢衔铮F(xiàn)代研究表明咖啡?？鼘幩犷惢衔镌谒幬铩⑹称?、飼料添加劑以及化妝品中具有較高的潛在價(jià)值[14]。藥理實(shí)驗(yàn)也表明它具有抗氧化活性、治療炎癥、抑制微生物和病毒活性、酶抑制作用等多種生物活性[21]。鑒于新綠原酸較好的藥理活性，對(duì)該化合物研究具有較大的實(shí)用價(jià)值，因此，本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken Design-響應(yīng)面法建立一種快速大量制備高純度的新綠原酸的方法，且通過實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證該工藝穩(wěn)定可行，為新綠原酸的制備及其下一步藥理藥效的深入研究提供保障。

圖6 自變量A，B，C之間交互作用與應(yīng)變量R1含量等高線、響應(yīng)面圖

圖7 新綠原酸粗品（A）和新綠原酸對(duì)照品（B）的HPLC圖

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Optimization on Transformation from ChlorogenicAcid to NeochlorogenicAcid by Box-Behnken Design-response Surface Methodology

Wen Jianhui,Ni Fuyong,Wang Xuejing,Li Ming,Song Yaling,Wang Zhenzhong,Xiao Wei
(Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co.Ltd.,Lianyungang 222000,China)

Box-Behnken design-response surface methodology was used to optimize the transformation from chlorogenic acid to neochlorogenic acid.Based on single factor experiments,the experiment design were developed by box-benhnhen central composite design with causal factors of the reaction temperature,time and PH to neochlorogenic acid.The optimum transformation conditions were as follow:reaction temperature at 107°C,reaction time of 60 min,the PH of 4.72.Under the optimum extraction technology conditions,the productivity of neochlorogenic acid was 64.20%.Neochlorogenic acid was isolated and purified.The determination and characterization of neochlorogenic acid was detected by HPLC,1H-NMR,13C-NMR and ESI-MS.The results showed that the content of neochlorogenic acid reached to 98.78%and the yield of 87.37%.

Chlorogenic acid,neochlorogenic acid,Box-Behnken design-response surface methodology,structural identification

10.11842/wst.2017.07.026

R284.1

A

新綠原酸為單咖啡?？鼘幩犷惢衔?，是由咖啡酸的1位和奎寧酸的5位通過酯化反應(yīng)而形成的天然化合物（結(jié)構(gòu)式見圖1），在植物界中分布廣泛，為最常見的單咖啡?？鼘幩犷惢衔镏弧＞哂锌咕鉄醄1-2]、抗血栓[3]、體外抗結(jié)核活性[4]，抗炎、抗氧化、對(duì)心血管疾病的作用、抑制血小板聚集[5]等藥理作用?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，新綠原酸在活性虛擬篩選中與靶蛋白HEV71的結(jié)合能為-9.2kcal/mol，具有一定的抑制手足口HEV71病毒活性[6]；在抗炎作用方面，新綠原酸對(duì)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞炎癥因子具有一定的抑制作用[7]；在抗補(bǔ)體經(jīng)典途徑試驗(yàn)中，新綠原酸的活性要優(yōu)于陽性藥肝素[8]；另外，新綠原酸作為熱毒寧注射液有機(jī)酸的活性成分之一，對(duì)H1N1、H3N2、B流感病毒神經(jīng)氨酸酶表現(xiàn)出良好的抑制作用[9]。

目前，新綠原酸尚無化學(xué)合成方法，均從植物中分離純化得到，但是由于其含量在植物中較低，若要獲得大量的高純度的新綠原酸單體，需要提取大量的藥材后利用不同的分離材料對(duì)該化合物富集、分離和純化，工序繁瑣，且藥材和試劑消耗量大。綠原酸為新綠原酸的同分異構(gòu)體，在植物中含量高且制備工藝非常成熟[10-13]，有研究發(fā)現(xiàn)綠原酸在一定條件下可以轉(zhuǎn)化為新綠原酸及其它綠原酸類衍生物[14-17]，影響其轉(zhuǎn)化的主要因素有：反應(yīng)時(shí)間、pH值、反應(yīng)溫度。鑒于此，本文擬通過Box-Behnken-響應(yīng)面法優(yōu)化綠原酸轉(zhuǎn)化為新綠原酸的最佳條件，為新綠原酸的規(guī)模制備提供參考（圖2）。

圖1 新綠原酸結(jié)構(gòu)式

2015-11-05

修回日期：2016-03-22

＊ 科學(xué)技術(shù)部國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（2013ZX09402203）：現(xiàn)代中藥創(chuàng)新集群與數(shù)字制藥技術(shù)平臺(tái)，負(fù)責(zé)人：王振中。

＊＊ 通訊作者：蕭偉，本刊編委，博士，研究員級(jí)高級(jí)工程師，主要研究方向：中藥新藥的研究與開發(fā)。

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：王 晶）