楊 琴，包宜康，顧亞琴，郭 昀，吳小峰，酈紅巖

(1.江蘇中興藥業(yè)有限公司，江蘇鎮(zhèn)江，212009;2.江蘇吉貝爾藥業(yè)股份有限公司，江蘇鎮(zhèn)江，212009)

野馬追為菊科植物輪葉澤蘭Eupatorium lindleyanum DC.的干燥地上部分，味苦，性平，歸肺經(jīng)，具有化痰止咳平喘之功效，常用于治療痰多咳嗽氣喘等癥［1］。現(xiàn)代研究表明野馬追中主要含有黃酮類、生物堿類、揮發(fā)油類、香豆類素、有機酸類及多種微量元素等化學成分［2－4］。目前對野馬追的研究主要集中在黃酮、生物堿等大類［5－6］，而對有機酸類成分的研究較少，文章在前期研究的基礎上，參考相關文獻，對野馬追藥材中綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸三種有機酸類成分進行了定量檢測，為野馬追的質(zhì)量控制及后續(xù)研究開發(fā)等奠定實驗基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HPLC(LC－20A系統(tǒng)、SPD－20A檢測器，島津株式會社);N2000色譜工作站(浙大智達);BAS124S電子天平(德國Satorius);HH恒溫水浴鍋(金壇中大儀器廠)。

1.2 材料

綠原酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號:110753－201415)、新綠原酸、隱綠原酸對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號:PA0819RA13、2F0226BA14)，色譜級乙腈(德國MERCK)，水為公司自制注射用水，其余試劑均為分析純。

野馬追藥材原產(chǎn)地江蘇盱眙，由亳州吉貝爾現(xiàn)代中藥飲片科技有限公司提供，經(jīng)江蘇吉貝爾藥業(yè)股份有限公司魏福榮高級工程師鑒定為野馬追。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Phenomenex C18(250×4.6mm，5μm);流動相:乙腈—0.2%醋酸水溶液(11 ∶89);檢測波長:327nm;柱溫:30℃;流速:1.0mL/min;進樣 20μL，理論板數(shù)按綠原酸峰計算應不低于2500。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

稱取三種對照品適量，精密稱定，加流動相制成每1mL分別含新綠原酸0.82mg、綠原酸0.68mg、隱綠原酸 0.58mg 的混合溶液，作儲備液備用。

2.2.2 供試品溶液的制備

將野馬追藥材粉碎，過篩，精密稱取1.0g，加50mL石油醚提取以除色素或一些小分子化合物，揮干石油醚，藥渣加純化水20mL，水浴回流2次，每次0.5小時，濾過，合并兩次濾液，置50mL量瓶中，加流動相定容至刻度，搖勻即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 方法專屬性

按“2.1色譜條件”下進樣分析，得對照品溶液與供試品溶液的色譜圖如圖1所示，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸在此條件下分離度良好。

圖1 對照品及供試品溶液色譜圖(A－對照品溶液;B－供試品溶液;1.新綠原酸2.綠原酸3.隱綠原酸)Fig.1 The chromatogram of the reference solution and the test solution(A－Reference solution;B－Test solution;1.Neochlorogenic acid 2.Chlorogenic acid 3.Cryptochlorogenic acid)

2.3.2 線性關系的考察

分別精密吸取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的儲備對照品溶液0.25、0.5、1、3、5mL至10mL量瓶中，制成新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸濃度分級為0.0205、0.041、0.082、0.246、0.41mg/mL，0.017、0.034、0.068、0.204、0.34mg/mL 及 0.0145、0.029、0.058、0.174、0.29mg/mL的系列對照品溶液，按“2.1色譜條件”操作進樣分析，以峰面積(Y)對進樣量(μg)(X)進行線性回歸，得三種成分的回歸方程依次分別為 Y=13821X+18.17(r=0.9999)，Y=17675X+10.914(r=0.9993)，Y=15157X+13.241(r=0.9999)，且新綠原酸、綠原酸及隱綠原酸分別在 0.41～8.2μg、0.34～6.8μg、0.29～5.8μg范圍內(nèi)線性關系良好。

2.3.3 精密度試驗

精密吸取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸濃度分別為 0.082 mg/mL、0.068 mg/mL、0.058mg/mL的混合對照品溶液20μL，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，結(jié)果新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的RSD分別為0.87%、1.15%、1.04%，表明精密度良好。

2.3.4穩(wěn)定性試驗

稱取野馬追藥材適量，按“2.2.2供試品溶液的制備”下制備供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12、24小時測定峰面積，記錄峰面積，得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的峰面積RSD分別為1.36%、0.93%、1.25%，表明供試品在24小時內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復性試驗

稱取野馬追藥材6份，精密稱定，按“2.2.2供試品溶液的制備”項下方法制備供試品溶液，結(jié)果得供試品中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸平均含量分別為2.815mg/g、3.381mg/g、2.972mg/g，含量RSD分別為1.21%、1.06%、1.18%。

2.3.6 加樣回收率測定

取已知含量的野馬追藥材6份，每份約0.5g，精密稱定，加入2mL重新配制新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸對照品溶液的濃度分別為0.7113mg/mL、0.8476mg/mL、0.7511mg/mL的混合對照品溶液，按“2.2.2供試品溶液的制備”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1色譜條件”下方法進樣分析，得供試品溶液中各成分的回收率如表2所示。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)Table 2 Results of recovery test(n=6)

2.4 樣品測定

分別稱取不同批次的野馬追藥材1g，精密稱定，按“2.2.2供試品溶液的制備”項下操作，并按“2.1色譜條件”下方法進樣分析，得不同批次的野馬追藥材中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的含量數(shù)據(jù)見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果Table 3 Determination results of contents in samples

3 討論

在前期的實驗考察中，將綠原酸、新綠原酸和隱綠原酸分別配制一定濃度的對照品溶液進行紫外全波長掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)綠原酸、新綠原酸和隱綠原酸均在208nm和327nm左右處有最大吸收峰，而后分別選擇208nm和327nm進行綠原酸、新綠原酸和隱綠原酸混合對照品的HPLC檢測，發(fā)現(xiàn)在208nm波長處檢測時，雜峰較多，綠原酸、新綠原酸和隱綠原酸分離度較差，干擾其含量的測定，而在327nm處綠原酸、新綠原酸和隱綠原酸分離度良好，測定無其他成分干擾，故最終選擇327nm作為檢測波長。

中藥材及中藥制劑中同時測定的新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸含量的報道相對較多［7－10］，但大多采用的洗脫方法較為復雜(梯度或分段變波長)，筆者通過前期方法考察，篩選乙腈－水系統(tǒng)等度洗脫來進行含量測定，方法具有良好的精密度與穩(wěn)定性，能夠較好地滿足實驗測定要求。

本研究工作中，初步選擇甲醇－水系統(tǒng)和乙腈－水系統(tǒng)分別對野馬追供試品溶液進行測定，發(fā)現(xiàn)采用乙腈－水系統(tǒng)各成分的分離度及基線的平穩(wěn)性均優(yōu)于甲醇－水系統(tǒng)，故初步選擇乙腈－水系統(tǒng)作為流動相，同時加入了醋酸進一步調(diào)整峰型，最終在乙腈－0.2%醋酸水(11:89)的條件下，各成分分離度、出峰時間及峰型均較好。

筆者在研究過程中分別進行了水、甲醇、乙醇、50%乙醇等不同提取溶劑，加熱回流和超聲提取等不同的提取方法，以及在0.5、1、1.5h的不同提取時間對提取成分的影響，由于綠原酸類成分的特殊結(jié)構(gòu)，使用甲醇、乙醇、50%乙醇等溶劑提取時，提取出得成分較多，各目標峰之間很難達到基線分離，且相互間有干擾。由于其在熱水中的溶解度大于甲醇、乙醇中的溶解度，因此確定先用石油醚脫脂處理，再用純化水回流提取2次，每次0.5小時，以保證有效成分能提取完全，且避免長時間的高溫損壞。

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