王麗超+劉丹+姜勇+屠鵬飛+曾克武
[摘要] 探究肉蓯蓉低分子糖(LMSC)對(duì)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞的激活作用靶點(diǎn)蛋白群及相關(guān)作用機(jī)制。該研究首先通過測(cè)定巨噬細(xì)胞吞噬活性以及NO釋放量來評(píng)價(jià)LMSC對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的激活作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,LMSC在0.25~2 g·L-1給藥濃度可顯著提高RAW264.7細(xì)胞的吞噬活性及NO的釋放量,提示具有巨噬細(xì)胞激活作用。通過構(gòu)建LMSC鍵合的環(huán)氧活化瓊脂糖固相微球作為親和介質(zhì),捕獲RAW264.7細(xì)胞裂解液中特異性結(jié)合靶標(biāo)蛋白;對(duì)高分辨質(zhì)譜鑒定獲得的LMSC靶標(biāo)蛋白群進(jìn)行信號(hào)通路富集分析,探討LMSC巨噬細(xì)胞激活作用相關(guān)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)共獲得Eef2等24個(gè)LMSC靶點(diǎn)蛋白,分別涉及Fcγ受體依賴的吞噬、TNF-α NF-κB信號(hào)通路、糖酵解/糖原異生以及檸檬酸(TCA)循環(huán)和呼吸電子運(yùn)輸過程等10條巨噬細(xì)胞激活相關(guān)信號(hào)通路。以上結(jié)果提示LMSC通過作用于多個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞吞噬、NF-κB信號(hào)通路以及糖代謝途徑最終實(shí)現(xiàn)對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞激活作用。
[關(guān)鍵詞] 肉蓯蓉; 低分子糖; 巨噬細(xì)胞激活; 分子親和色譜; 靶點(diǎn)識(shí)別; 作用機(jī)制分析
[Abstract] This study aims to investigate the targets and targets-involved mechanism for the macrophage activation of low molecular weight saccharides from Cistanche deserticola (LMSC). The phagocytic activity and NO release of RAW264.7 cells were detected, and results showed that LMSC exerts immune activation effect by significantly increasing the phagocytic activity and NO release. LMSC-conjugated epoxy-activated sepharose beads were prepared as affinity reagent to capture the target proteins. Twenty-four proteins such as Eef2 were identified by LC-MS/MS analysis. Pathway enrichment analysis showed LMSC activated RAW264.7 cells by regulating Fcgamma receptor dependent phagocytosis, TNF-alpha NF-κB signaling pathway, glycolysis/gluconeogenesis and the citric acid cycle and respiratory electron transport pathway.
[Key words] Cistanche deserticola; low molecular weight saccharides; macrophage activation; molecular affinity chromatography; target identification; mechanism analysis
肉蓯蓉Cistanches Herba是我國著名傳統(tǒng)補(bǔ)益中藥,具有補(bǔ)腎陽、益精血、潤(rùn)腸通便[1]之功效,有“沙漠人參”之稱?,F(xiàn)代分析化學(xué)研究表明肉蓯蓉中含有多種糖類成分,包括以果糖等為主的單糖化合物、蔗糖等寡糖化合物以及含ACDP-2等多糖,是肉蓯蓉發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、通便等作用的顯效物質(zhì)[2-5]。肉蓯蓉多糖被廣泛報(bào)道為一類具有免疫調(diào)節(jié)作用的活性成分,低分子糖類(LMSC)如寡糖和單糖卻鮮為研究。本課題組一項(xiàng)對(duì)肉蓯蓉中主要活性部位進(jìn)行巨噬細(xì)胞激活作用的研究發(fā)現(xiàn),低分子糖是一類具有巨噬細(xì)胞激活作用的活性成分,但其免疫激活作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制目前仍不明確。
分子親和色譜是一種通過固定相特異性結(jié)合目標(biāo)分子從而實(shí)現(xiàn)分離純化目的色譜方法[6]。該方法具有高親和力與高專一性,尤其適用于目標(biāo)產(chǎn)物濃度極低的有機(jī)復(fù)雜體系[7],近年來逐步發(fā)展成為天然藥物靶標(biāo)識(shí)別的有力工具。本研究利用基于分子親和色譜法的小分子靶標(biāo)蛋白捕獲技術(shù)識(shí)別并鑒定具有巨噬細(xì)胞激活作用的LMSC靶點(diǎn)蛋白群。通過生物信息學(xué)分析,獲得靶標(biāo)群的信號(hào)調(diào)節(jié)通路信息,以此探討LMSC的免疫調(diào)節(jié)活性及相關(guān)機(jī)制。
1 材料
1.1 細(xì)胞 小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心。
1.2 藥物與試劑 胎牛血清(FBS)購自德國PAN Biotech公司;抗生素、DMEM高糖培養(yǎng)基與6×蛋白上樣緩沖液均購自中科邁晨科技有限公司。肉蓯蓉低分子糖由本課題組自制,經(jīng)HPLC法測(cè)定主要含有甘露醇(16.53%)、蔗糖(8.34%)、果糖(25.38%)、葡萄糖(7.75%)等單體成分。大腸桿菌脂多糖(lipopolysaccharide from Escherichia coli O55:B5,LPS)、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)與0.33%中性紅溶液均購自美國Sigma-Aldrich公司。一氧化氮(NO)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠(Epoxy-activated Sepharose6B)購自瑞典GE healthcare公司??焖巽y染試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。質(zhì)譜用甲酸和乙腈均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。endprint
1.3 儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYO,日本);CIX100顯微鏡(Olympus Corporation,日本);5424R離心機(jī)(Eppendorf,德國);自動(dòng)純水機(jī)(Millipore,美國);Sunrise-Basic酶標(biāo)儀(TECAN,瑞士);THZ-C臺(tái)式恒溫振蕩器(蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);EASY-nLC-Ⅱ液相色譜儀(Thermo Fisher Scientific,美國);LTQ-Orbitrap離子阱串聯(lián)質(zhì)譜(Thermo Fisher Scientific,美國);毛細(xì)管液相色譜柱(Michrom Bioresources,美國)。
2 方法
2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及給藥 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中,并置于含5%CO2的37 ℃飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱。每2~3 d傳代1次,待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為空白組、脂多糖組或肉蓯蓉低分子糖組。LPS組細(xì)胞使用1 mg·L-1LPS溶液處理,作為陽性對(duì)照;LMSC組細(xì)胞加入不同質(zhì)量濃度的LMSC溶液(0.25,0.5,1,2 g·L-1;給藥前用濾膜過濾);空白組細(xì)胞加入等體積的無血清培養(yǎng)基。
2.2 中性紅法測(cè)定巨噬細(xì)胞吞噬活性 RAW264.7細(xì)胞接種于96孔板,過夜培養(yǎng)后更換為無血清培養(yǎng)基或含LPS或不同濃度LMSC的無血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后,細(xì)胞更換為0.075%中性紅溶液,于37 ℃繼續(xù)孵育4 h。吸棄上清液,用PBS洗2遍,并使用細(xì)胞裂解液(冰醋酸-乙醇1∶1)于4 ℃下裂解細(xì)胞,待裂解完全后測(cè)定各孔吸光度(A540 nm)。
2.3 細(xì)胞上清液中NO釋放量檢測(cè) RAW264.7細(xì)胞接種于48孔板,過夜培養(yǎng)后更換為無血清培養(yǎng)基或含LPS或不同濃度LMSC的無血清培養(yǎng)基。誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h后,收集上清液,參照試劑盒說明書測(cè)定各孔細(xì)胞上清液中NO含量。
2.4 MTT法測(cè)定巨噬細(xì)胞活力 RAW264.7細(xì)胞接種于96孔板,過夜培養(yǎng)后更換為無血清培養(yǎng)基或含LPS或不同濃度LMSC的無血清培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。各孔細(xì)胞更換為0.5 g·L-1MTT溶液,37 ℃孵育4 h,隨后用二甲基亞砜溶解MTT反應(yīng)產(chǎn)物,并用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度。
2.5 肉蓯蓉低分子糖親和介質(zhì)的制備 參考文獻(xiàn)方法[8],稱取環(huán)氧活化瓊脂糖樹脂0.5 g,于去離子水中溶脹40 min后離心并棄去上清液,重復(fù)該過程3次,使凝膠充分溶脹(其體積約為1 mL),備用。分別吸取0.5 mL溶脹的環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠與1 mL LMSC溶液(1 g·mL-1)或等體積溶劑混勻,置于37 ℃恒溫?fù)u床上孵育過夜。將空白或偶聯(lián)LMSC的瓊脂糖介質(zhì)用去離子水清洗數(shù)次至上清無色,隨后加入1 mL乙醇胺溶液(1 mol·L-1),于37 ℃恒溫?fù)u床上封閉2 d。反應(yīng)結(jié)束后依次用雙蒸水、NaCl-HAc緩沖液及NaCl-Tris-HCl緩沖液各清洗5次,最后用0.01%NP40洗脫液清洗2次,備用。
2.6 靶點(diǎn)群的富集與識(shí)別 向RAW264.7細(xì)胞總蛋白提取液(0.5 g·L-1)中分別加入50 μL空白介質(zhì)或LMSC親和介質(zhì),作為空白對(duì)照組及LMSC結(jié)合組;另設(shè)置同時(shí)加入LMSC溶液及LMSC親和介質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)組。各組混合后,于4 ℃下孵育過夜,使LMSC與靶點(diǎn)蛋白充分結(jié)合。反應(yīng)結(jié)束后用0.01%NP40洗脫液反復(fù)清洗親和介質(zhì)6次以洗去親和介質(zhì)上殘余的游離蛋白。洗滌過的親和介質(zhì)加入等體積 2×上樣緩沖液,98 ℃變性8 min解離結(jié)合蛋白。吸取上清液,進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,隨后參照試劑盒說明書進(jìn)行銀染分析。
2.7 LC-MS/MS法鑒定靶點(diǎn)蛋白群 參照文獻(xiàn)方法[8],利用二維納升級(jí)高效液相色譜儀串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜法(nano-HPLC-LTQ-Orbitrap/MS)鑒定特異性結(jié)合蛋白。具體方法如下:首先利用胰蛋白酶對(duì)顯色后的差異蛋白條帶進(jìn)行膠內(nèi)酶解,獲得靶點(diǎn)肽段混合物。肽段混合物經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后,吸取10 μL樣品溶液加樣至毛細(xì)管液相色譜柱。色譜條件:流動(dòng)相0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脫條件見表1。質(zhì)譜條件:電噴霧電壓為1.8 kV,正離子模式采集數(shù)據(jù),全掃描范圍設(shè)置為m/z 350~2 000;對(duì)15個(gè)最強(qiáng)峰進(jìn)行MS/MS掃描,二級(jí)碰撞能量設(shè)定為35 V。最后利用SEQUEST檢索軟件對(duì)獲得的肽段數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索匹配。
2.8 作用靶點(diǎn)群通路與功能分析 將鑒定得到的靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入Cytoscape 3.5.1軟件中,應(yīng)用ClueGO插件進(jìn)行KEGG,REACTOME Pathways及Wiki Pathways分析,設(shè)定種屬為小鼠,P<0.05為顯著性閾值,其余采用默認(rèn)參數(shù)。
2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s表示。采用GraphPad Prism-6.02 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),以P<0.01作為具有非常顯著性差異。
3 結(jié)果與討論
3.1 肉蓯蓉低分子糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬活性的影響 在本課題組另一項(xiàng)對(duì)肉蓯蓉巨噬細(xì)胞激活作用活性組分發(fā)現(xiàn)的研究中,LMSC可能是一類具有巨噬細(xì)胞激活作用的成分。本實(shí)驗(yàn)首先利用中性紅法測(cè)定RAW264.7小鼠腹腔巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)體系經(jīng)不同給藥濃度LMSC刺激后細(xì)胞內(nèi)中性紅含量,以此考察LMSC對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬活性的影響。與空白對(duì)照組相比,陽性對(duì)照藥LPS刺激細(xì)胞48 h可顯著增強(qiáng)細(xì)胞吞噬活性(P<0.01);LMSC在0.25~2 g·L-1各給藥組均能顯著提高RAW264.7細(xì)胞的吞噬活性(P<0.01),且呈現(xiàn)劑量依賴特征。以上結(jié)果提示,LMSC可能具有激活RAW264.7細(xì)胞的作用,見圖1。endprint
3.2 肉蓯蓉低分子糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO釋放的影響 NO是一種重要的具有機(jī)體免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子[9],被廣泛報(bào)道參與調(diào)控RAW264.7細(xì)胞激活反應(yīng)。為進(jìn)一步考察LMSC對(duì)RAW264.7細(xì)胞的激活作用,測(cè)定了LMSC刺激后細(xì)胞上清液中NO的含量。巨噬細(xì)胞激活陽性藥物L(fēng)PS組NO釋放量顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01),與之相似,0.5,1,2 g·L-13種劑量LMSC給藥組中RAW264.7細(xì)胞NO釋放量均明顯高于空白對(duì)照組(P<0.01),且呈劑量依賴性,見圖2。以上結(jié)果表明LMSC具有促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞釋放NO的效果,證實(shí)其巨噬細(xì)胞激活作用。
3.3 肉蓯蓉低分子糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響 細(xì)胞毒性作用是制約新藥開發(fā)與影響藥物發(fā)揮藥效的一項(xiàng)重要因素,為了考察本實(shí)驗(yàn)中LMSC所用劑量是否具有潛在的細(xì)胞毒性,利用MTT法檢測(cè)LMSC給藥后的RAW264.7細(xì)胞活力。LMSC在0.25~2 g·L-1干預(yù)RAW264.7細(xì)胞24 h后對(duì)細(xì)胞活力沒有顯著影響,以上結(jié)果提示0.25~2 g·L-1LMSC對(duì)RAW264.7沒有細(xì)胞毒性,見圖3。
3.4 肉蓯蓉低分子糖巨噬細(xì)胞激活作用靶點(diǎn)群的富集與鑒定 環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠是一種廣泛應(yīng)用于含有羥基或氨基的糖類、蛋白質(zhì)等多種分子偶聯(lián)的固相載體。LMSC主要由富含羥基的果糖、甘露醇等成分組成,本研究利用所含的羥基可與環(huán)氧活性基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)的特性,將肉蓯蓉低分子糖鍵合到環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠微球表面,構(gòu)建LMSC親和介質(zhì),見圖4A。利用分子親和色譜技術(shù),將LMSC親和介質(zhì)與RAW264.7細(xì)胞總蛋白提取液進(jìn)行孵育,以捕獲直接作用靶點(diǎn)蛋白群。對(duì)靶點(diǎn)群進(jìn)行銀染色,見圖4B,LMSC親和介質(zhì)結(jié)合組的蛋白條帶明顯多于未偶聯(lián)LMSC的空白介質(zhì)組,而LMSC競(jìng)爭(zhēng)組由于過量游離LMSC與靶點(diǎn)蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,引起親和介質(zhì)捕獲靶點(diǎn)數(shù)目顯著降低。隨后利用HPLC-MS/MS法對(duì)各蛋白條帶進(jìn)行鑒定,共獲得Eef2等24個(gè)靶點(diǎn)蛋白,提示肉蓯蓉低分子糖可能通過以上靶點(diǎn)蛋白聯(lián)合作用引起巨噬細(xì)胞激活。
3.5 肉蓯蓉低分子糖巨噬細(xì)胞激活作用靶點(diǎn)群相關(guān)的作用機(jī)制分析 為了探究肉蓯蓉低分子糖靶點(diǎn)蛋白引起RAW264.7巨噬細(xì)胞激活的作用機(jī)制,本研究應(yīng)用KEGG,REACTOME和Wiki信號(hào)通路數(shù)據(jù)庫對(duì)LMSC靶蛋白群所涉及的生物學(xué)通路進(jìn)行分析。信號(hào)通路富集分析結(jié)果見圖5和表2,LMSC巨噬細(xì)胞激活作用靶點(diǎn)蛋白主要參與10條巨噬細(xì)胞激活相關(guān)信號(hào)通路,歸納為以下4類:Fcγ受體依賴的吞噬作用、TNF-α NF-κB信號(hào)通路、糖酵解/糖原異生以及檸檬酸(TCA)循環(huán)和呼吸電子運(yùn)輸。
4 討論
現(xiàn)代研究報(bào)道中藥及天然藥物具有廣泛的生物學(xué)活性,但由于化學(xué)組成十分復(fù)雜,如何闡明中藥及天然藥物復(fù)雜成分體系的作用機(jī)制,至今仍面臨挑戰(zhàn)。基于分子親和色譜法的小分子靶標(biāo)蛋白捕獲技術(shù),本研究結(jié)合肉蓯蓉分子糖(LMSC)中主要成分均具有羥基這一化學(xué)組成共性,構(gòu)建了LMSC鍵合的環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠微球作為親和介質(zhì),以此鑒定具有巨噬細(xì)胞激活作用的LMSC靶點(diǎn)蛋白群,并對(duì)靶點(diǎn)群相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路進(jìn)行分析,進(jìn)而揭示了LMSC巨噬細(xì)胞激活作用機(jī)制。
巨噬細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)具有吞噬顆粒型抗原作用的一類重要的免疫應(yīng)答細(xì)胞[10]。外源物刺激引起的巨噬細(xì)胞激活主要表現(xiàn)為吞噬功能的增強(qiáng)以及一系列信號(hào)傳導(dǎo)途徑引起的NO等因子的釋放。LMSC劑量依賴性提高RAW264.7細(xì)胞吞噬活性并顯著提高NO釋放,表明LMSC具有巨噬細(xì)胞激活作用。利用生物信息學(xué)手段對(duì)分子親和色譜法捕獲的LMSC巨噬細(xì)胞激活作用靶點(diǎn)進(jìn)行信號(hào)通路富集分析,提示LMSC通過調(diào)節(jié)Fcγ受體依賴的吞噬作用、TNF-α NF-κB信號(hào)通路、糖酵解/糖原異生以及檸檬酸(TCA)循環(huán)和呼吸電子運(yùn)輸?shù)冗^程發(fā)揮巨噬細(xì)胞激活作用。
Fcγ受體是細(xì)胞表面受體,是巨噬細(xì)胞模式識(shí)別受體之一[11],其位于細(xì)胞表面,能夠特異性識(shí)別外源性顆粒,使顆粒結(jié)合到細(xì)胞表面。Fcγ受體介導(dǎo)的吞噬作用信號(hào)傳導(dǎo)可引起下游肌動(dòng)蛋白聚合及吞噬體的形成[11]。LMSC顯著提高RAW264.7細(xì)胞吞噬活性,其作用可能與通過結(jié)合Hsp90等多種Fcγ受體信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)蛋白進(jìn)而調(diào)節(jié)Fcγ受體依賴的吞噬作用相關(guān)。NF-κB信號(hào)通路被認(rèn)為是巨噬細(xì)胞激活的一條關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)途經(jīng)[12]。NF-κB是細(xì)胞核內(nèi)一種重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,NF-κB信號(hào)通路激活可以引起胞漿中NF-κB活化而移位至細(xì)胞核,進(jìn)而介導(dǎo)各種細(xì)胞因子和NO等介質(zhì)的基因表達(dá)。LMSC刺激后可引起RAW264.7細(xì)胞大量釋放NO,其作用可能是通過結(jié)合Eef2等多種涉及TNF-α NF-κB信號(hào)通路等相關(guān)蛋白進(jìn)而激活NF-κB信號(hào)通路及與之相關(guān)的真核翻譯起始與延長(zhǎng)過程而實(shí)現(xiàn)的。此外,LMSC相關(guān)靶點(diǎn)還涉及糖酵解/糖原異生以及檸檬酸(TCA)循環(huán)和呼吸電子運(yùn)輸2種糖類代謝途徑,推測(cè)LMSC含有的果糖、甘露醇等多種低分子糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行能量供給并與糖代謝相關(guān)的Aldoa等蛋白結(jié)合,進(jìn)而調(diào)控糖代謝相關(guān)途徑。
綜上所述,本研究利用分子親和色譜相關(guān)靶標(biāo)蛋白識(shí)別技術(shù)鑒定得到LMSC巨噬細(xì)胞激活作用的24個(gè)不同功能靶點(diǎn)蛋白;靶蛋白相關(guān)的信號(hào)通路富集分析提示LMSC通過作用于Fcγ受體依賴的吞噬、TNF-α NF-κB信號(hào)通路以及糖代謝過程最終發(fā)揮RAW264.7巨噬細(xì)胞激活作用。該研究為揭示肉蓯蓉免疫調(diào)節(jié)作用活性組分與相關(guān)作用機(jī)制提供了理論支持,同時(shí)為天然藥物復(fù)雜活性成分群的靶點(diǎn)識(shí)別及作用機(jī)制研究提供了思路。
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[責(zé)任編輯 張寧寧]endprint