白紅娟，王壽艷，梁芳楠，趙婷婷，康鵬洲

(中北大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院， 山西 太原 030051)

球形紅細(xì)菌降解2,4-二硝基甲苯的途徑及酶學(xué)性質(zhì)

白紅娟，王壽艷，梁芳楠，趙婷婷，康鵬洲

(中北大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院， 山西 太原 030051)

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)分析了球形紅細(xì)菌降解2,4-二硝基甲苯(2,4-DNT)的中間代謝產(chǎn)物，分析了可能的降解途徑，討論了培養(yǎng)基中2,4-DNT的初始質(zhì)量濃度、溶液pH值及反應(yīng)溫度對(duì)3種酶的酶比活力影響。結(jié)果表明，當(dāng)2,4-DNT的初始質(zhì)量濃度為40 mg/L時(shí)，培養(yǎng)72h后，可以檢測(cè)到5種物質(zhì)：2,4-二硝基甲苯、4-氨基-2硝基甲苯、2-氨基-4硝基甲苯、4-硝基-1,2-二(三甲基硅烷)苯、1,2,4-三(三甲基硅烷)苯，其可能的降解途徑為2,4-DNT首先還原為4-氨基-2-硝基甲苯和2-氨基4-硝基甲苯，再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為4-硝基-1,2-羥基苯，然后氧化為1,2,4-三羥基苯，之后開(kāi)環(huán)生成β-酮己二酸，最終降解為小分子物質(zhì)。硝基還原酶、鄰苯二酚2,3-雙加氧酶和鄰苯二酚1,2-雙加氧酶的酶比活力最適宜溫度分別為35、30、35℃，最適宜pH值分別為7.0、8.0、7.0，最適宜培養(yǎng)基初始2,4-DNT質(zhì)量濃度均為40mg/L。

球形紅細(xì)菌；2,4-二硝基甲苯；2,4-DNT；硝基還原酶；鄰苯二酚1,2-雙加氧酶；鄰苯二酚2,3-雙加氧酶

引 言

2,4-二硝基甲苯(2,4-DNT)是2,4,6-三硝基甲苯(TNT)生產(chǎn)過(guò)程中的主要副產(chǎn)物[1]，不僅廣泛應(yīng)用于國(guó)防、醫(yī)藥、造漆、橡膠等過(guò)程中，同時(shí)，它也是甲苯二胺、農(nóng)藥、聚氨酯和染料等生產(chǎn)過(guò)程中的中間體[2-4]。因其具有較大的毒性，美國(guó)環(huán)保署已將其列為優(yōu)先控制污染物名單[5]。

國(guó)內(nèi)外對(duì)微生物降解2,4-DNT進(jìn)行了深入研究，然而其代謝途徑有所差異[6-11]。微生物在不同條件下降解2,4-DNT時(shí)，可能生成不同產(chǎn)物。 厭氧還原2,4-DNT時(shí)，通常生成2-氨基-4-硝基甲苯、4-氨基-2-硝基甲苯、2,4-二氨基甲苯等[4,6]；好氧氧化2,4-DNT時(shí)，苯環(huán)上引入羥基、羰基，最后開(kāi)環(huán)、礦化[7-8]；也可能生成毒性較大的肼類(lèi)化合物，且肼類(lèi)化合物的生成與羥胺硝基甲苯相關(guān)[9-10]。同時(shí)，微生物轉(zhuǎn)化2,4-DNT的過(guò)程中涉及酶促反應(yīng)，如：硝基還原酶還原硝基，加氧酶在苯環(huán)引入羥基、羰基等。研究降解2,4-DNT的微生物主要是在嚴(yán)格的厭氧菌和好氧菌條件下。厭氧轉(zhuǎn)化產(chǎn)物需要好氧菌后續(xù)處理，2,4-DNT在化學(xué)結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)，導(dǎo)致其很難直接發(fā)生氧化反應(yīng)；而兼性細(xì)菌首先缺氧還原2,4-DNT，然后再好氧氧化開(kāi)環(huán)、礦化；有關(guān)兼性細(xì)菌較少報(bào)道。球形紅細(xì)菌(Rhodobactersphaeroides)是兼性細(xì)菌，也是益生菌。它既能在厭氧條件下利用光照進(jìn)行生長(zhǎng)，也能在好氧條件下利用有機(jī)物生長(zhǎng)[11]。前期研究表明[12]，球形紅細(xì)菌能在72h完全轉(zhuǎn)化2,4-DNT，120h徹底礦化，但是對(duì)降解途徑及酶學(xué)性質(zhì)還需要進(jìn)行深入研究。因此，本研究采用球形紅細(xì)菌對(duì)2,4-DNT進(jìn)行降解，并利用GC-MS方法對(duì)球形紅細(xì)菌降解2,4-DNT的中間產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，同時(shí)研究了降解過(guò)程中關(guān)鍵酶的酶活力，為硝基苯類(lèi)化合物的廢水治理提供參考。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑和儀器

球形紅細(xì)菌(Rhodobactersphaeroides)H菌株系紫色非硫菌群紅細(xì)菌屬光合細(xì)菌，由山西大學(xué)光合細(xì)菌研究室分離、鑒定并保存[13]；2,4-二硝基甲苯(2,4-DNT，純度99%)，阿拉丁公司；牛血清白蛋白和鄰苯二酚，生工生物工程(上海)股份有限公司；其余試劑均為分析純；水為二次去離子水。

高效液相色譜儀(HPLC)，美國(guó)Waters公司。色譜柱為C18反相柱(250mm×4.6mm×5μm)，20 ℃下測(cè)量，流動(dòng)相為甲醇/水(體積比70∶30)，流速為0.9mL/min，探測(cè)波長(zhǎng)254nm，進(jìn)樣體積20μL；HP5973型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)，美國(guó)惠普公司；SCIENIZ-ⅡD型超聲破碎儀，寧波新芝科學(xué)器材研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

基礎(chǔ)培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行配置。

液體馴化培養(yǎng)基：將2,4-DNT作為唯一有機(jī)碳源配制培養(yǎng)基，使其溶于甲醇溶液中，待甲醇揮發(fā)后直接加入除蘋(píng)果酸以外的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.2.2 質(zhì)譜分析

球形紅細(xì)菌在以2,4-DNT為唯一有機(jī)碳源的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)72 h后，經(jīng)過(guò)8000r/min高速離心機(jī)離心10min后取上清液，經(jīng)0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾，用GC-MS進(jìn)行分析。

1.2.3 粗酶液的制備[14]及蛋白含量測(cè)定

取培養(yǎng)好的菌液，用8000r/min高速離心機(jī)離心10min，收集菌體，用33μmol/L、pH 值為7.5的Tris-HCl緩沖液洗滌2次，懸浮于1mL的緩沖液中。將其在冰水浴下用超聲波細(xì)胞粉碎儀破碎細(xì)胞，破碎20min(每間隔3s破碎1s)。然后在10000r/min的高速冷凍離心機(jī)中離心10min，棄沉淀，上清液即細(xì)胞粗酶液，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白[15]，采用考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)定粗酶液中的蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 酶比活力測(cè)定

硝基還原酶比活力測(cè)定參考文獻(xiàn)[16]，略作修改。反應(yīng)體系中含有110μmol/L 2,4-DNT、1.5mmol/L NADH、50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH值為7)，200μL粗酶液，終體積為1mL。反應(yīng)從加入NADH后開(kāi)始，在30℃下反應(yīng)60min，之后在90 ℃下加熱10min終止反應(yīng)。將樣品在1000g的離心力下離心3min，之后在254nm處通過(guò)高效液相色譜儀測(cè)定2,4-DNT的吸光度。

鄰苯二酚-2,3-雙加氧酶和鄰苯二酚-1,2-雙加氧酶比活力測(cè)定參照文獻(xiàn)[17]。

酶活力(U)定義為反應(yīng)條件下每分鐘催化生成1mmol 產(chǎn)物(或轉(zhuǎn)化1mmol底物)所需的酶量；酶比活力定義為每毫克可溶性蛋白質(zhì)所含酶活力單位數(shù)(U/mg)。

1.2.5 相對(duì)酶比活力的計(jì)算

配制不同2,4-DNT質(zhì)量濃度分別為0、20、40、60、80mg/L的液體馴化培養(yǎng)基，制得粗酶液，在30℃，pH值為7的條件下分別測(cè)定酶比活力。以40mg/L的2,4-DNT條件下的酶比活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶比活力。

將40mg/L的2,4-DNT作為唯一有機(jī)碳源的培養(yǎng)基制得粗酶液，在30℃下設(shè)置5個(gè)反應(yīng)體系，pH值分別調(diào)為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。在不同pH值條件下測(cè)定酶比活力。以pH值為7條件下的酶比活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶比活力。

將40mg/L的2,4-DNT作為唯一有機(jī)碳源的培養(yǎng)基制得粗酶液，在pH值為7時(shí)，設(shè)置為5個(gè)反應(yīng)體系，為25、30、35、40、45℃。在不同溫度條件下分別測(cè)定酶比活力。以溫度為35℃下的酶比活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶比活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 球形紅細(xì)菌降解2,4-DNT的中間產(chǎn)物

為了測(cè)定球形紅細(xì)菌降解2,4-DNT的中間產(chǎn)物，在降解反應(yīng)完成后采用GC-MS進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果如圖1所示。

從圖1中可以看出，在未降解時(shí)，可檢測(cè)到物質(zhì)A，其出峰時(shí)間為10.58min，當(dāng)被降解72h后，物質(zhì)A的峰已經(jīng)消失，同時(shí)出現(xiàn)了4個(gè)較大的峰，得到了中間產(chǎn)物B(出峰時(shí)間10.76min)、C(出峰時(shí)間11.87min)、D(出峰時(shí)間17.98min)和E(出峰時(shí)間18.50min)。表明被降解72 h后，物質(zhì)A已經(jīng)被完全降解，并得到了4種主要的中間產(chǎn)物。

通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)譜圖對(duì)比A及其中間代謝產(chǎn)物B、C、D和E的質(zhì)譜圖，其對(duì)應(yīng)的相對(duì)分子質(zhì)量、保留時(shí)間和質(zhì)核比(m/z)如表1所示。在檢測(cè)過(guò)程中出現(xiàn)的物質(zhì)有2,4-二硝基甲苯(2,4-DNT)、2-氨基-4-硝基甲苯(2-A-4-NT)、4-氨基-2-硝基甲苯(4-A-2-NT)，1,2,4-三(三甲基硅烷)苯和4-硝基-1,2-二(三甲基硅烷)苯。與Valli[18]所報(bào)道的一致。

由此可判斷，球形紅細(xì)菌降解2,4-DNT的主要途徑是：先將硝基還原為氨基，生成中間產(chǎn)物4-A-2-NT和2-A-4-NT，隨后將4-A-2-NT氧化為4-硝基-1,2-羥基苯，再進(jìn)一步還原為1,2,4-三羥基苯。據(jù)推測(cè)[18-19]1,2,4-三羥基苯在雙加氧酶的作用下完成開(kāi)環(huán)，生成β-酮己二酸，進(jìn)一步礦化為小分子物質(zhì)CO2、H2O(見(jiàn)圖2)。

表1 球形紅細(xì)菌降解2,4-DNT代謝過(guò)程中的代謝產(chǎn)物和衍生物

2.2 不同條件對(duì)3種酶的酶比活力的影響

2.2.1 2,4-DNT初始濃度的影響

培養(yǎng)基中不同2,4-DNT的初始濃度對(duì)酶比活力有重要的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

根據(jù)表1中的酶比活力值計(jì)算得到相對(duì)酶比活力，圖3為不同初始濃度培養(yǎng)條件下2,4-DNT對(duì)硝基還原酶、鄰苯二酚2,3-雙加氧酶、鄰苯二酚1,2-雙加氧酶的相對(duì)酶活力大小的影響。

從圖3可以看出，當(dāng)2,4-DNT初始質(zhì)量濃度達(dá)到40mg/L時(shí)，3種酶的相對(duì)酶比活力都達(dá)到最佳，之后隨著2,4-DNT初始濃度的逐漸加大，3種酶的酶比活力逐漸降低。表明在一定范圍內(nèi)，球形紅細(xì)菌中3種酶的相對(duì)酶比活力會(huì)隨著2,4-DNT初始質(zhì)量濃度的增大而升高，當(dāng)2,4-DNT達(dá)到一定濃度后，則會(huì)對(duì)相對(duì)酶比活力起抑止作用；因此，當(dāng)培養(yǎng)基中2,4-DNT質(zhì)量濃度達(dá)到40mg/L時(shí)，3種關(guān)鍵酶的相對(duì)酶比活力達(dá)到最佳。這是由于當(dāng)2,4-DNT的質(zhì)量濃度較低時(shí)，酶的活性中心未達(dá)到飽和，酶的活力會(huì)隨著2,4-DNT質(zhì)量濃度的增加而增大。隨著2,4-DNT質(zhì)量濃度達(dá)到40mg/L時(shí)，酶的活性中心趨于飽和，酶的活性達(dá)到一個(gè)極限[20]；2,4-DNT質(zhì)量濃度過(guò)大時(shí)，降低了分子的擴(kuò)散性，降低酶解反應(yīng)速率，酶的活力降低。

表2 培養(yǎng)基中不同初始濃度2,4-DNT處理下細(xì)胞中酶比活力

2.2.2 pH值的影響

分別研究了pH值為5、6、7、8、9的不同緩沖體系對(duì)硝基還原酶、鄰苯二酚1,2-雙加氧酶、鄰苯二酚2,3-雙加氧酶的相對(duì)酶比活力影響。分別以110μmol/L的2,4-DNT或20μmol/L鄰苯二酚為底物，30℃下，在pH值為5～9的Tris-HCl緩沖液中反應(yīng)，測(cè)定3種酶的酶比活力，結(jié)果見(jiàn)表3。根據(jù)表3酶比活力值計(jì)算得到相對(duì)酶比活力，pH值對(duì)相對(duì)酶比活力的影響見(jiàn)圖4。

圖4表明，硝基還原酶的最適宜反應(yīng)pH值為7；當(dāng)pH為 8時(shí)，鄰苯二酚2,3-雙加氧酶的相對(duì)酶比活力達(dá)到最大，之后隨著pH值的逐漸加大，鄰苯二酚2,3-雙加氧酶的相對(duì)酶比活力逐漸降低；當(dāng)pH值為7時(shí)，鄰苯二酚1,2-雙加氧酶的相對(duì)酶比活力達(dá)到最大，之后隨著pH值過(guò)高而導(dǎo)致鄰苯二酚1,2-雙加氧酶的相對(duì)酶比活力降低甚至失活。

表3 不同pH值反應(yīng)條件下細(xì)胞中的酶比活力

2.2.3 溫度的影響

考察了溫度為25、30、35、40、45℃對(duì)硝基還原酶、鄰苯二酚2,3-雙加氧酶和鄰苯二酚1,2-雙加氧酶的酶比活力的影響，結(jié)果見(jiàn)表4。根據(jù)表4的酶比活力值計(jì)算得到相對(duì)酶比活力隨溫度變化結(jié)果，見(jiàn)圖5。

表4 不同溫度反應(yīng)條件下細(xì)胞中的酶比活力

由圖5可知，在30～40℃時(shí)，硝基還原酶和鄰苯二酚2,3-雙加氧酶均具有較高的相對(duì)酶比活力，35℃時(shí)，其相對(duì)酶比活力均達(dá)到最大，之后隨著溫度的逐漸升高，相對(duì)酶比活力均逐漸降低。在25～30℃時(shí)，隨著溫度的升高，鄰苯二酚1,2-雙加氧酶的酶比活力增加，30℃時(shí)，其相對(duì)酶比活力達(dá)到最佳，而隨著溫度的繼續(xù)升高，其相對(duì)酶比活力降低。

3 結(jié) 論

(1)在球形紅細(xì)菌降解2,4-DNT的過(guò)程中，出現(xiàn)了4種中間產(chǎn)物，分別為2-氨基-4-硝基甲苯、4-氨基-2硝基甲苯、4-硝基-1,2-二羥基苯和1,2,4-三羥基苯。推測(cè)其可能的降解途徑為：2,4-二硝基甲苯首先還原為4-氨基-2-硝基甲苯和2-氨基-4-硝基甲苯，繼而氧化為4-硝基-1,2-二羥基苯，而后轉(zhuǎn)化為1,2,4-三羥基苯，然后開(kāi)環(huán)生成β-酮己二酸，最終降解為小分子物質(zhì)。

(2)硝基還原酶、鄰苯二酚2,3-雙加氧酶和鄰苯二酚1,2-雙加氧酶是球形紅細(xì)菌降解2,4-DNT過(guò)程中的關(guān)鍵酶。在2,4-DNT質(zhì)量濃度為40mg/L的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)72h時(shí)，硝基還原酶、鄰苯二酚2,3-雙加氧酶和鄰苯二酚1,2-雙加氧酶酶比活性達(dá)到最大。硝基還原酶、鄰苯二酚2,3-雙加氧酶和鄰苯二酚1,2-雙加氧酶的最適宜反應(yīng)溫度分別為35、30、35℃，最適pH值分別為7.0、8.0、7.0。

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DegradationPathwayandPropertiesofEnzymeof2,4-DinitrotoluenebyRhodobacterSphaeroides

BAI Hong-juan， WANG Shou-yan， LIANG Fang-nan， ZHAO Ting-ting， KANG Peng-zhou

(School of Environment and Safe Engineering, North University of China, Taiyuan 030051, China)

The intermediates of 2,4-dinitrotoluene (2,4-DNT) metabolized byrhodobactersphaeroideswere analyzed by the gas chromatograph-mass spectrometer (GC-MS), the possible degradation pathway was analyzed, and the effect of initial mass concentration of 2,4-DNT in culture medium, pH value of solution and reaction temperature on the enzyme specific activity of three kinds of enzymes was discussed. The results show that five intermediates including 2,4-dinitrotoluene, 4-amino-2-nitrotoluene, 2-amino-4-nitrotoluene, 4-nitro-1,2-di(TMS)benzene and 1,2,4-tri(TMS)benzene were detected when initial mass concentration of 2,4-DNT is 40mg/L after cultivating for 72h. The possible degradation pathway is that 2,4-DNT is first reduced to 4-amino-2-nitrotoluene and 2-amino-4-nitrotoluene and further transformed into 4-nitro-1,2-hydroquinone, then is oxidized to 1,2,4-trihydroxybenzene, finally 1,2,4-trihydroxybenzene ring is cleaved to form β-ketoadipic acid, which was finally degraded to smaller molecular compounds. For enzyme specific actiyity of nitroreductase, catechol 2,3-dioxygenase and catechol 1,2-dioxygenase , the optimal temperature is 35, 30 and 35℃, respectively, the optimal pH value is 7.0, 8.0 and 7.0, respectively and the optimal initial mass concentration of 2,4-DNT in culture medium is 40mg/L.

Rhodobactersphaeroides; 2,4-dinitrotoluene; 2,4-DNT; nitroreductase; catechol 1,2-dioxygenase; catechol 2,3-dioxygenase

TJ55;TQ464.8

1007-7812(2017)05-0082-06

10.14077/j.issn.1007-7812.2017.05.016

2017-03-27；

2017-07-23

山西省回國(guó)留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目(No. 2016-084)

白紅娟(1969-)，女，博士，教授，從事環(huán)境微生物技術(shù)研究。E-mail: bhj44871@163.com