廖 婕 梅 燕

（1.四川省成都市溫江區(qū)婦幼保健院，四川 成都611130；2.重慶市中醫(yī)院，重慶400021）

·實(shí)驗(yàn)報(bào)告·

姜黃素對(duì)癲癇幼鼠學(xué)習(xí)記憶及神經(jīng)元凋亡的影響*

廖 婕1梅 燕2△

（1.四川省成都市溫江區(qū)婦幼保健院，四川 成都611130；2.重慶市中醫(yī)院，重慶400021）

目的觀察姜黃素對(duì)癲癇幼鼠的學(xué)習(xí)記憶及海馬組織神經(jīng)元凋亡的影響并探討其機(jī)制。方法將50只21 d齡的SD幼鼠隨機(jī)分正常組，模型組，姜黃素高（100mg/kg）、姜黃素中（50mg/kg）、姜黃素低（25mg/kg）劑量組，姜黃素各組給予相應(yīng)劑量姜黃素灌胃，連續(xù)2周。Morris水迷宮法檢測乳鼠學(xué)習(xí)記憶能力、TUNEL法檢測乳鼠海馬神經(jīng)元的凋亡、Western blotting法檢測Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果與模型組大鼠比較，姜黃素高、中、低劑量組的學(xué)習(xí)記憶能力顯著提高（P＜0.01）；細(xì)胞凋亡情況顯著改善（P＜0.01）；且Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。結(jié)論姜黃素可能通過抑制Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)，從而抑制癲癇幼鼠海馬神經(jīng)元的凋亡。

姜黃素 癲癇 神經(jīng)元 凋亡

癲癇是一種以大腦神經(jīng)元過度放電而引起的暫時(shí)性腦功能失常為特征的疾病[1]。癲癇發(fā)作可以引起神經(jīng)元的損傷，引發(fā)神經(jīng)元的凋亡[2]。姜黃素（curcumin）是姜科植物姜黃的主要有效成分，是一種小子分多酚類化合物[3]?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，姜黃素具有抗氧化、抗凋亡和抗炎的作用，且對(duì)由腦缺血再灌注損傷引起的神經(jīng)元凋亡有保護(hù)作用[4]。本實(shí)驗(yàn)利用戊四氮干預(yù)大鼠乳鼠構(gòu)建癲癇幼鼠模型，探討姜黃素對(duì)癲癇幼鼠神經(jīng)元的保護(hù)作用。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物50只21 d齡的SD大鼠幼鼠，體質(zhì)量（40±2）g，購自重慶市中醫(yī)院中藥研究院，隨機(jī)分為正常組，模型組，姜黃素高、中、低劑量組，每組10只。

1.2 試藥與儀器 姜黃素 （純度≥99%）購自美國Sigma公司，溶于0.9%氯化鈉溶液中，配成25 mg/mL的濃度劑量；戊四氮 （PTZ），購自美國Sigma公司；TUNEL試劑盒購自南京建成生物工程研究所；全蛋白提取試劑盒、Cleaved-caspase-3小鼠抗單克隆抗體，購自美國Cell Signalling Technology公司；β-actin小鼠單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 造模與分組 癲癇模型的建立，除正常組以外，其余各組幼鼠每日以40mg/kg的劑量腹腔注射PTZ。正常組每日注射相應(yīng)容積的0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)21 d。每日觀察各組幼鼠在給予PTZ后的癲癇發(fā)作情況，時(shí)間為1 h。根據(jù)Racine分級(jí)法對(duì)癲癇程度分級(jí)[5]，見表1，造模成功的大鼠達(dá)到Ⅳ～Ⅴ級(jí)驚厥標(biāo)準(zhǔn)。如1 h后無Ⅳ級(jí)以上癲癇發(fā)作，再次腹腔注射20mg/kg的PTZ，直到癲癇發(fā)作。動(dòng)物的給藥，待癲癇模型建立好后第1日起，姜黃素高、中、低劑量組大鼠每日灌胃100mg/kg、50mg/kg和25mg/kg的姜黃素，對(duì)照組和模型組灌胃相應(yīng)容積的0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)2周。

表1 Racine癲癇程度分級(jí)法

1.4 標(biāo)本采集與檢測1）Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。給藥完畢后，連續(xù)4 d進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，每日上午和下午定點(diǎn)訓(xùn)練1次，測量大鼠游到平臺(tái)的時(shí)間（逃避潛伏期）。第5日撤除平臺(tái)，記錄120 s內(nèi)大鼠穿越原平臺(tái)所在象限的搜索時(shí)間、原平臺(tái)象限游泳距離占總距離的百分比、穿越平臺(tái)次數(shù)。2）TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡情況。待動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，處死動(dòng)物，斷頭取腦，用4%的多聚甲醛磷酸緩沖液固定，石蠟包埋，切片，染色。嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒的操作步驟進(jìn)行操作。3）Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)檢測。采用Western blotting方法，嚴(yán)格按照全蛋白提取試劑盒的操作步驟提取海馬組織全蛋白。蛋白由SDS-PAGE凝膠進(jìn)行分離，待PVDF膜轉(zhuǎn)膜后，再用5%的脫脂牛奶進(jìn)行1 h的封閉。分別加入鼠抗Cleaved-caspase-3、p-Cleavedcaspase-3多克隆抗體（1∶250），在4℃下孵育過夜，經(jīng)TBST洗滌3次，各10min，再加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔的二抗（1∶500），搖床上孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，Bio-RAD圖像分析儀進(jìn)行圖像掃描，Quantity One軟件進(jìn)行灰度值測定，以Cleaved-caspase-3與β-actin的灰度值之比表示Cleaved-caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 見表2。訓(xùn)練第4日，與正常組相比，模型組和姜黃素高、姜黃素中、姜黃素低劑量組逃避潛伏期顯著延長（P＜0.05）；與模型組相比，姜黃素高、姜黃素中、姜黃素低劑量組逃避潛伏期顯著縮短（P＜0.05或P＜0.01）。與正常組相比，模型組和姜黃素高、姜黃素中、姜黃素低劑量組在四象限的游泳時(shí)間顯著縮短（P＜0.05），游泳距離與總距離之百分比及穿越平臺(tái)次數(shù)顯著降低 （P＜0.05或P＜0.01）；與模型組相比，姜黃素高、姜黃素中、姜黃素低劑量組在四象限的游泳時(shí)間顯著延長（P＜0.05），游泳距離與總距離之百分比及穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各組癲癇幼鼠Morris水迷宮檢測結(jié)果比較（±s）

表2 各組癲癇幼鼠Morris水迷宮檢測結(jié)果比較（±s）

與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組 別n正常組10模型組10姜黃素高劑量組10逃避潛伏期（s）原平臺(tái)象限游泳時(shí)間（s）游泳距離與總距離百分比（%）穿越次數(shù)（次）7.21±2.15△△8.56±2.74△△47.80±3.86△△9.82±2.09△△19.88±4.08**4.01±2.16**26.34±3.22**4.04±1.77**13.16±3.43**△△7.07±2.30**△△37.92±4.98**△△7.24±1.90**△△姜黃素中劑量組10 14.74±3.97**6.99±2.35*36.84±4.67**7.01±1.8**△△姜黃素低劑量組10 15.04±3.50*△△6.46±2.03*△△35.77±4.40**△△6.83±2.03*△△

2.2 各組TUNEL檢測結(jié)果比較 見表3。與正常組相比，模型組及姜黃素高、中、低劑量組幼鼠大腦海馬區(qū)有大量TUNEL陽性凋亡神經(jīng)元細(xì)胞（P＜0.01）；與模型組相比，姜黃素高、姜黃素中、姜黃素低劑量組幼鼠海馬區(qū)有較少的TUNEL陽性凋亡神經(jīng)元（P＜0.01）。

表3 各組癲癇幼鼠海馬區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較（個(gè)，±s）

表3 各組癲癇幼鼠海馬區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較（個(gè)，±s）

組 別n正常組10模型組10姜黃素高劑量組10陽性細(xì)胞數(shù)7.70±1.14△△198.66±31.30**115.48±20.26**△△姜黃素中劑量組10 110.88±21.43**△△姜黃素低劑量組10 106.29±19.45**△△

2.3 各組Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)水平比較

見圖1和表4。與正常組相比，模型組及姜黃素高、中、低劑量組幼鼠大腦海馬組織Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，姜黃素高、中、低劑量組幼鼠海馬區(qū)Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。

圖1 Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)的Western blotting圖

表4 各組癲癇幼鼠海馬組織Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表4 各組癲癇幼鼠海馬組織Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平比較（±s）

組 別n正常組10模型組10姜黃素高劑量組10 Cleaved-caspase-3 0.08±0.07△△1.78±0.24**0.98±0.16**△△姜黃素中劑量組10 1.05±0.13**△△姜黃素低劑量組10 1.17±0.20**△△

3 討 論

癲癇發(fā)作時(shí)可引起神經(jīng)元損傷，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡及壞死[6]。 驚厥發(fā)作的時(shí)候，海馬區(qū)會(huì)發(fā)生缺血缺氧，從而引起海馬神經(jīng)受損、凋亡，且癲癇發(fā)作時(shí)間越長，頻率越高，海馬神經(jīng)元損傷的程度更重[7]。姜黃素來源于姜科植物根莖，是一種植物多酚，具有多種藥理活性，如抗氧化、抗癌、抗炎癥等[8]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能顯著改善阿爾茨海默癥、帕金森等疾病，其機(jī)制與其抗氧化、抗炎、抗凋亡相關(guān)[9]。

Caspase是半胱氨酸蛋白酶家族的重要一員，在細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用[10]。Caspase家族核心成員為Caspase-3，其為半胱氨酸蛋白酶，能被天冬酰胺特異酶切[11]。Caspase-3在細(xì)胞凋亡早期，是被激活的重要蛋白酶，也叫做死亡蛋白酶，是凋亡的最后執(zhí)行因子[12]。Caspase-3通常是以無活性的Pro-Caspase（Caspase-3前體）形式而存在[13]，當(dāng)細(xì)胞受外界凋亡信號(hào)激活時(shí)，Caspase-3被剪切后產(chǎn)生Cleaved Caspase-3的活性片段[14]，其表達(dá)可直接反應(yīng)細(xì)胞的凋亡情況[15]。

通過本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素對(duì)癲癇幼鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有顯著提高，能減輕海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡的情況，并顯著降低Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)，說明姜黃素對(duì)癲癇幼鼠的神經(jīng)元具有保護(hù)作用，其具體機(jī)制值得進(jìn)一步深入探討。

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Effects of Curcum in on Learning and Memory and Neuron Apoptosis in Epileptic Immature Rats

LIAO Jie，MEI Yan.Maternal and Child Health Care Hospital of Wenjiang District of Chengdu，Sichuan，Chengdu 611130，China.

Objective：To explore the effects of curcumin on learning and memory and neuron apoptosis in epileptic immature rats.MethodsA total of 50male SD rats around 21 days of age were randomly allocated into 5 groups：the normal saline group，pentylenetetrazole（PTZ）group，high-dose curcumin group（100 mg/kg），middle-dose curcumin group（50 mg/kg），and low-dose curcumin group（25 mg/kg）.Curcumin was administrated orally for 2w.Morris water maze method was used to detect the learning and memory ability of neonatal rats；TUNEL method was used to detect the apoptosis of hippocampal neurons and the expression of cleaved-caspase-3 protein was detected by Western blottingmethod.ResultsCompared with in the model group，the high，medium and low dose groups significantly improve the ability of learning and memory（P＜0.01）；cell apoptosis was significantly improved（P＜0.01）；the expression of cleaved-caspase-3 protein was significantly decreased（P＜0.01）.ConclusionCurcumin can inhibit the expression of cleaved-caspase-3 protein and inhibit the apoptosis of hippocampal neurons in epileptic rats.

Curcumin；Epilepsy；Neuron；Apoptosis

R285.5

A

1004-745X（2017）10-1763-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.10.024

重慶市基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目（CSTC-jbky-01717）

△通信作者（電子郵箱：2735666720@qq.com）

2017-04-12）