桂 瑤 湯光花 陳永新 張瑞嶺

（1.湖北省武漢市紅十字會醫(yī)院，湖北 武漢430000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng)453002）

溶栓顆粒對急性腦梗死大鼠海馬神經(jīng)元凋亡、腦組織Caspase-3蛋白及外周血中細(xì)胞因子水平的影響

桂 瑤1湯光花2陳永新2張瑞嶺2

（1.湖北省武漢市紅十字會醫(yī)院，湖北 武漢430000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng)453002）

目的觀察溶栓顆粒對急性腦梗死大鼠海馬神經(jīng)元凋亡、腦組織Caspase-3蛋白及外周血中細(xì)胞因子水平的影響。方法將40只雄性SD大鼠隨機分為對照組、模型組、溶栓顆粒組和丁苯酞組，每組10只，采用改良線栓法制作急性腦梗死大鼠模型。21 d后評價行為學(xué)改變，觀察大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡情況，免疫組化法檢測腦組織Caspase-3蛋白表達，ELISA法測定外周血腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-2（IL-2）和白介素-8（IL-8）水平。結(jié)果21 d后模型組、溶栓顆粒組和丁苯酞組行為學(xué)指標(biāo)明顯低于對照組，而溶栓顆粒組和丁苯酞組明顯高于對照組 （P＜0.05）。模型組、溶栓顆粒組和丁苯酞組海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)和腦組織Caspase-3蛋白表達明顯高于對照組，而溶栓顆粒組和丁苯酞組低于對照組（P＜0.05）。模型組、溶栓顆粒組和丁苯酞組外周血TNF-α、IL-2和IL-8水平明顯高于對照組，而溶栓顆粒組和丁苯酞組低于對照組（P＜0.05）。結(jié)論溶栓顆粒可改善急性腦梗死大鼠模型的行為學(xué)指標(biāo)，修復(fù)神經(jīng)元細(xì)胞損傷，降低腦組織Caspase-3蛋白和外周血中細(xì)胞因子表達。

溶栓顆粒 急性腦梗死 神經(jīng)元Caspase-3細(xì)胞因子

急性腦梗死是腦供血障礙造成腦細(xì)胞缺血缺氧發(fā)生壞死，導(dǎo)致系列神經(jīng)癥狀，發(fā)病率高、致死率高，可由顱腦損傷、頸內(nèi)動脈血血栓脫落、手術(shù)血栓等引起，嚴(yán)重威脅人體健康。急性腦梗死發(fā)病復(fù)雜，可能與大腦神經(jīng)遞質(zhì)減少導(dǎo)致心理和精神活動低下有關(guān)，可能與激素異常導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子升高等有關(guān)[1-3]。急性腦梗死治療多采用抗血小板聚集、神經(jīng)保護等綜合，易引起多種副作用，臨床應(yīng)用受到限制[4]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為急性腦梗死是由氣機郁滯、氣虛血瘀導(dǎo)致，病因為情志內(nèi)傷，病機為憂思郁怒，肝氣郁結(jié)，治宜理氣開郁，調(diào)暢氣機為主[5]。溶栓顆粒具有升降并舉、氣血同調(diào)、痰瘀并治、標(biāo)本兼顧，治療急性腦梗死有較好的臨床療效，但其機制不清[6]。本研究通過建立急性腦梗死模型大鼠，研究溶栓顆粒對急性腦梗死模型大鼠海馬神經(jīng)元凋亡、腦組織Caspase-3蛋白及外周血中細(xì)胞因子水平的影響，探討溶栓顆粒治療作用機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SD大鼠，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。在（23±2）℃環(huán)境中采用12 h晝夜節(jié)律飼養(yǎng)，研究過程中自由飲水進食，白天（9：00～17：00）進行試驗研究。

1.2 藥物與試劑 溶栓顆粒（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院制劑室）；丁苯酞 （美國禮來公司，生產(chǎn)批號L01984）；羧甲基纖維素鈉和Caspase-3試劑盒購于英國Abcam公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-2（IL-2）和白介素-8（IL-8）試劑盒購于武漢華美生物工程有限公司；TUNEL凋亡試劑盒和DAB顯色試劑盒購于碧云天生物科技有限公司；PBS緩沖液和二抗購于寶生物工程有限公司；其他試劑均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；實驗用水為超純水。

1.3 實驗儀器LDZ-2型低速離心機（北京京立離心機有限公司）；WGY-10型分光光度計 （天津光學(xué)儀器有限公司）；Mini-PROTEAN3電泳、ELx800酶標(biāo)儀及Mini-PROTEAN3電轉(zhuǎn)移系統(tǒng) （美國伯騰儀器有限公司）；電子天平（瑞士梅特勒公司）；超低溫冰箱（合肥美菱股份有限公司）；倒置x51顯微鏡（日本奧林巴斯有限公司）。

1.4 造模與分組 自由飲食適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，選擇敞箱實驗評分相近的40只大鼠隨機分為對照組、模型組、溶栓顆粒組和丁苯酞組，每組10只。對照組正常飼養(yǎng)。將模型組、溶栓顆粒組和丁苯酞組大鼠，水合氯醛麻醉，俯臥固定于手術(shù)臺，采用改良線栓法制作急性腦梗死大鼠模型。模型組自由飲水進食，溶栓顆粒組第2日開始灌服溶栓顆粒，劑量200 mg/kg，丁苯酞組第2日開始灌服丁苯酞，劑量0.28mL/kg，溶栓顆粒組和丁苯酞組每日灌胃1次，連續(xù)20 d。

1.5 標(biāo)本采集與檢測1）行為學(xué)評價。21 d后采用敞箱實驗評價各組大鼠的行為學(xué)。在80 cm×80 cm×40 cm四壁涂黑的正方形紙板箱底面畫25cm正方形，將大鼠放入箱底，安靜狀態(tài)下記錄3 min內(nèi)大鼠在正方形紙板箱的水平次數(shù)、直立次數(shù)和修飾次數(shù)。然后對大鼠進行糖水消耗實驗，大鼠給予純水和1%蔗糖水，記錄24 h的消耗量。糖水偏愛度=1%蔗糖水量/總水量×100%。2）神經(jīng)元檢測。行為學(xué)測試完畢后，眼球取血處死動物。在4℃迅速取腦，生理鹽水清洗后，冰凍切片，選取海馬組織切片，PBS洗滌3次，貼片，晾干，二甲苯脫脂，酒精脫水，焦油紫染色，水清洗，鹽酸-酒精分色，酒精脫水后中性樹膠封片。切片脫蠟脫水，蛋白酶K消化，PBS清洗，滴加TUNEL試劑盒反應(yīng)液和復(fù)合液，DAB顯色，蘇木素復(fù)染并封片。顯微鏡下隨意取5個視野，觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)改變和海馬區(qū)棕褐色凋亡細(xì)胞數(shù)。3）Caspase-3蛋白分析。眼球取血處死動物后取腦組織，凍存管分裝，液氮保存。解凍后研磨腦組織，加入預(yù)冷的蛋白裂解液，4℃條件下10000 r/min離心20 min，取上清，采用蛋白質(zhì)定量試劑盒測定總蛋白。采用SDS-PAGE電泳分離腦組織總蛋白，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，PBS液洗10 min。蛋白封閉后，GAPDH為內(nèi)參，加入Caspase-3一抗和二抗，以1∶1000偶聯(lián)辣根過氧化物酶的羊抗兔IgG孵育30 min，暗室曝光、顯影、晾干，凝膠圖像處理軟件分析光密度值。4）細(xì)胞因子檢測。21 d處死實驗動物，采集外周血，3000 r/min離心15min，分離血清后-80℃保存。采用ELISA法測定外周血TNF-α、IL-2和IL-8細(xì)胞因子水平，嚴(yán)格按照試劑說明書操作。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗比較組內(nèi)和組間差異，計數(shù)資料以n（%）表示，應(yīng)用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠行為學(xué)評價結(jié)果比較 見表1。21 d后模型組、溶栓顆粒組和丁苯酞組行為學(xué)指標(biāo)明顯低于對照組，而溶栓顆粒組和丁苯酞組明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。但溶栓顆粒組和丁苯酞組行為學(xué)指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)和腦組織Caspase-3蛋白比較 見表2，圖1。對照組海馬神經(jīng)元細(xì)胞排列規(guī)則，細(xì)胞豐富，神經(jīng)元胞膜完整，胞核形態(tài)正常；模型組海馬神經(jīng)元細(xì)胞排列不規(guī)則，細(xì)胞減少，細(xì)胞紊亂變稀，神經(jīng)元胞膜破裂，細(xì)胞脫落形成空泡；溶栓顆粒組和丁苯酞組海馬神經(jīng)元細(xì)胞排列較規(guī)則，細(xì)胞較豐富，神經(jīng)元胞膜較完整，部分細(xì)胞萎縮、核變小，有部分空泡。模型組、溶栓顆粒組和丁苯酞組海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)明顯高于對照組，而溶栓顆粒組和丁苯酞組低于模型組（P＜0.05）。溶栓顆粒組和丁苯酞組海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。模型組、溶栓顆粒組和丁苯酞組腦組織Caspase-3蛋白表達明顯高于對照組，而溶栓顆粒組和丁苯酞組低于模型組 （P＜0.05），但溶栓顆粒組和丁苯酞組腦組織Caspase-3蛋白表達比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠行為學(xué)評價結(jié)果比較（±s）

表1 各組大鼠行為學(xué)評價結(jié)果比較（±s）

與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組 別n 水平得分（分）垂直得分（分）修飾次數(shù)（分）糖水偏愛度（%）對照組10模型組10溶栓顆粒組10 14.61±1.23 85.26±7.24 6.39±1.02 81.56±6.23 7.25±0.96*35.17±5.62*1.53±0.96*36.72±5.13*12.34±1.32*△73.41±6.89*△3.72±1.12*△70.15±5.67*△丁苯酞組1012.51±1.38*△74.10±7.05*△4.06±1.22*△71.03±5.18*△

表2 各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)和腦組織Caspase-3蛋白比較（±s）

表2 各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)和腦組織Caspase-3蛋白比較（±s）

組 別n 神經(jīng)元凋亡數(shù)（個）Caspase-3蛋白光密度值（OD）對照組10模型組10溶栓顆粒組10 12.34±2.67 0.76±0.11 61.27±6.81*2.34±0.15*31.51±5.47*△1.51±0.12*△丁苯酞組1032.64±5.31*△1.48±0.13*△

圖1 各組大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)（DAB-蘇木素，400倍）

2.3 各組大鼠外周血中細(xì)胞因子水平比較 見表3。模型組、溶栓顆粒組和丁苯酞組外周血TNF-α、IL-2和IL-8水平明顯高于對照組，而溶栓顆粒組和丁苯酞組低于模型組（P＜0.05）。但溶栓顆粒組和丁苯酞組外周血TNF-α、IL-2和IL-8水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠外周血中細(xì)胞因子水平比較（ng/mL，±s）

表3 各組大鼠外周血中細(xì)胞因子水平比較（ng/mL，±s）

組 別n TNF-αIL-2 IL-8對照組10模型組10溶栓顆粒組10 32.17±4.71 3.42±0.16 1.83±0.11 61.42±6.27*5.73±0.39*4.57±0.27*46.38±5.33*△4.41±0.25*△3.24±0.15*△丁苯酞組1045.26±5.41*△4.26±0.23*△3.13±0.12*△

3 討 論

急性腦梗死發(fā)病機制復(fù)雜，可能與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)、甲腎上腺素、膽堿能-去甲腎上腺素等有關(guān)，大腦神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)突觸間濃度減少，導(dǎo)致心理功能和精神活動低下，海馬神經(jīng)元凋亡是神經(jīng)退行性病變的主要病理基礎(chǔ)[7]。 近年來發(fā)現(xiàn)外周血TNF-α、IL-2等細(xì)胞因子與急性腦梗死密切關(guān)系[8]。急性腦梗死屬中醫(yī)郁病范疇。郁病主要由七情所傷、情志不遂，或郁怒傷肝、肝郁氣滯而發(fā)病，病位在肝。因此，治郁之要，在于氣血同調(diào)、痰瘀并治[9-10]。溶栓顆粒由枳實、柴胡、川芍、地龍、澤蘭、水蛙、丹參組成，具有疏肝解郁、調(diào)理氣血之功，治療郁病具有較好的臨床療效，但其作用機制尚不清楚。本研究通過分析其對急性腦梗死大鼠模型的行為學(xué)、海馬神經(jīng)元凋亡、腦組織Caspase-3蛋白及外周血中細(xì)胞因子水平，探討溶栓顆粒治療急性腦梗死的機制，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，21 d后模型組、溶栓顆粒組和丁苯酞組行為學(xué)指標(biāo)明顯低于對照組，而溶栓顆粒組和丁苯酞組明顯高于對照組，說明溶栓顆粒治療急性腦梗死具有較好的療效。模型組、溶栓顆粒組和丁苯酞組海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)和腦組織Caspase-3蛋白表達明顯高于對照組，而溶栓顆粒組和丁苯酞組低于對照組。說明溶栓顆?？尚迯?fù)神經(jīng)元細(xì)胞損傷，降低腦組織Caspase-3蛋白表達，可能是由于溶栓顆粒方中枳實和柴胡為君藥，疏肝解郁，調(diào)達肝氣；川芍、丹參共為臣藥，行氣活血之功，助君藥調(diào)理氣血；水蛭、地龍、澤蘭為佐藥，活血破血，熄風(fēng)通絡(luò)配主藥以利氣血的暢通；諸藥相配，升降并舉、氣血同調(diào)、痰疲并治、標(biāo)本兼顧。具有疏肝解郁、調(diào)理氣血之功效[11-12]。柴胡皂苷通過激活凋亡途徑上游蛋白Caspase-9，激活下游凋亡蛋白Caspase-3，產(chǎn)生促進細(xì)胞凋亡作用[13]。梔子恢復(fù)海馬的結(jié)構(gòu)與功能。同時本研究發(fā)現(xiàn)，模型組、溶栓顆粒組和丁苯酞組外周血TNF-α、IL-2和IL-8水平明顯高于對照組，而溶栓顆粒組和丁苯酞組低于對照組，說明溶栓顆?？山档屯庵苎屑?xì)胞因子表達。這與柴胡疏肝解郁，抑制海馬區(qū)細(xì)胞形態(tài)和活性，減少海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，丹參活血化瘀，減少外周血TNF-α、IL-2和IL-8的產(chǎn)生有關(guān)[14-15]。

綜上所述，急性腦梗死模型大鼠的海馬神經(jīng)元損傷嚴(yán)重，產(chǎn)生大量神經(jīng)元凋亡，腦組織Caspase-3蛋白升高，增加外周血中細(xì)胞因子，溶栓顆?？筛纳萍毙阅X梗死模型大鼠的行為學(xué)指標(biāo)，修復(fù)神經(jīng)元細(xì)胞損傷，降低腦組織Caspase-3蛋白和外周血中細(xì)胞因子表達。

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