王志美，徐忠偉，王佳寶，代二慶，徐瑞成,4

(1. 錦州醫(yī)科大學(xué)中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院附屬醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，天津 300162；2. 中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，天津 300162；3. 中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院附屬醫(yī)院軍人醫(yī)療保健中心，天津 300162；4. 天津市職業(yè)與環(huán)境危害生物標(biāo)志物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300309)

蟾酥活性成分協(xié)調(diào)索拉非尼通過(guò)下調(diào)Akt/NF-κB信號(hào)途徑抑制肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)

王志美1，徐忠偉2，王佳寶1，代二慶3，徐瑞成2,4

(1. 錦州醫(yī)科大學(xué)中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院附屬醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，天津 300162；2. 中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，天津 300162；3. 中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院附屬醫(yī)院軍人醫(yī)療保健中心，天津 300162；4. 天津市職業(yè)與環(huán)境危害生物標(biāo)志物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300309)

目的探討蟾酥活性成分蟾蜍靈和華蟾毒配基協(xié)調(diào)索拉非尼抑制肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制。方法MTT法檢測(cè)HepG2細(xì)胞經(jīng)藥物作用12、24、48 h后的增殖活性；Hoechst 33342熒光染色檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；流式細(xì)胞儀檢測(cè)藥物對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響；Western blot檢測(cè)Akt、p-Akt(Ser473)、IκB、NF-κB、p-NF-κB p65、Bcl-2、Bax、cyclin A、PCNA蛋白表達(dá)水平。結(jié)果蟾蜍靈、華蟾毒配基和索拉非尼作用組均能抑制HepG2細(xì)胞增殖，且藥物聯(lián)合作用組的增殖抑制率明顯高于單獨(dú)藥物作用組，呈時(shí)間依賴(lài)性，用金氏公式得出在24 h具有協(xié)同作用(P<0.01)；熒光染色結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞經(jīng)藥物處理24 h后，細(xì)胞呈現(xiàn)出核染色質(zhì)凝集的凋亡形態(tài)特征；細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，索拉非尼作用組使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期(P<0.01)，蟾蜍靈、華蟾毒配基作用組使細(xì)胞周期阻滯于S期(P<0.01)，藥物聯(lián)合作用組使細(xì)胞周期阻滯于S期(P<0.01)；Western blot結(jié)果顯示，蟾蜍靈、華蟾毒配基和索拉非尼單獨(dú)藥物作用組和聯(lián)合作用組Akt、NF-κB總蛋白表達(dá)均無(wú)明顯變化，p-Akt(Ser473)、p-NF-κB p65、Bcl-2、cyclin A、PCNA蛋白表達(dá)水平逐漸降低，聯(lián)合作用組比單獨(dú)藥物作用組降低更為明顯(P<0.01)。IκB、Bax蛋白表達(dá)水平逐漸升高，聯(lián)合作用組比單獨(dú)藥物作用組升高更加明顯(P<0.01)。結(jié)論蟾酥活性成分蟾蜍靈和華蟾毒配基協(xié)調(diào)索拉非尼通過(guò)下調(diào)Akt/NF-κB信號(hào)通路，抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖。

索拉非尼；蟾酥；蟾蜍靈；華蟾毒配基；HepG2；Akt；NF-κB

原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，起病隱匿，進(jìn)展迅速，預(yù)后極差[1]，大多數(shù)患者在確診時(shí)已進(jìn)展到HCC晚期。索拉非尼是一種多靶點(diǎn)、多激酶抑制劑，是臨床治療晚期肝癌的一線用藥，有效延長(zhǎng)HCC患者的生存時(shí)間。然而，HCC患者對(duì)索拉非尼可產(chǎn)生耐藥性，同時(shí)伴隨胃腸道疾病、手足皮膚病、心血管毒性等多種并發(fā)癥。這些并發(fā)癥可能一定程度上影響索拉非尼的治療效果。因此，篩選臨床中索拉非尼的效應(yīng)增強(qiáng)劑或協(xié)同效應(yīng)劑成為客觀需求[2]。蟾蜍靈(bufalin)以及華蟾毒配基(cinobufagin)是蟾酥發(fā)揮抗癌作用的主要活性成分，屬于外源性強(qiáng)心苷類(lèi)物質(zhì)，是天然的鈉鉀泵(Na+/K+-ATPase)抑制因子[3]。研究表明，蟾蜍靈和華蟾毒配基通過(guò)抑制Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡[4-5]，通過(guò)抑制NF-κB途徑誘導(dǎo)胰癌細(xì)胞周期阻滯和骨肉瘤細(xì)胞凋亡[6-7]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，蟾蜍靈和華蟾毒配基作用HCC細(xì)胞可誘發(fā)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期S期阻滯[8]。因此，本研究對(duì)蟾酥活性成分蟾蜍靈和華蟾毒配基聯(lián)合索拉非尼在抗HCC的藥理學(xué)作用機(jī)制中可能存在的協(xié)同和增效機(jī)制進(jìn)行深入研究。

1 材料與方法

1.1材料人肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)自協(xié)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；蟾蜍靈、華蟾毒配基購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，無(wú)水乙醇溶解成母液，實(shí)驗(yàn)終濃度為1 μmol·L-1，-20℃避光保存；H-DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、碘化丙啶(PI)、Hoechst 33342、RNaseA、Triton X-100和二甲基亞砜(DMSO) 購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；一抗兔抗人Akt、p-Akt(Ser473)、IκB、NF-κB、p-NF-κB p65、Bcl-2、Bax、cyclin A、PCNA和GAPDH單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；HRP標(biāo)記的二抗和ECL化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自美國(guó)KPL公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組HepG2細(xì)胞按常規(guī)方法培養(yǎng)。H-DMEM完全培養(yǎng)基中含有10%胎牛血清、1%青-鏈霉素、1%谷氨酰胺、1%丙酮酸鈉。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、0.1 μmol·L-1索拉非尼組、1 μmol·L-1蟾蜍靈組、1 μmol·L-1華蟾毒配基組、1 μmol·L-1蟾蜍靈聯(lián)合0.1 μmol·L-1索拉非尼組、1 μmol·L-1華蟾毒配基聯(lián)合0.1 μmol·L-1索拉非尼組。

1.3MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活性取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，以5 000個(gè)/孔的密度接種于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，按照預(yù)先設(shè)計(jì)的分組加入相應(yīng)濃度的藥物，分別作用12、24、48 h后，加入20 μL MTT孵育3 h后，水平離心，1 500×g離心5 min，棄上清，加入150 μL DMSO，放入溫箱5 min，震蕩混勻，酶標(biāo)儀測(cè)定A490nm值。計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。抑制率/% =(A對(duì)照-A實(shí)驗(yàn))/(A對(duì)照- A空白)×100%。用金氏公式計(jì)算蟾酥活性成分聯(lián)合索拉非尼是否有協(xié)同作用：q=E(A+B)/(EA+EB-EA·EB)。式中EA、EB分別為單獨(dú)藥物作用組的抑制率，E(A+B)為藥物聯(lián)合作用的抑制率，q>1.15為協(xié)同作用，0.85～1.15為相加作用，<0.85為拮抗作用。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.4熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)實(shí)驗(yàn)分組同前，藥物作用24 h后，離心，收集細(xì)胞，PBS洗4次，懸于200 μL PBS中，加入20 μL Hoechst 33342(終濃度為10 mg·L-1)，在37℃孵育箱中染色15 min，1 000×g離心10 min，棄上清，加入適量PBS，吹打混勻，每組細(xì)胞取3張玻片，200倍視野，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞融合至80%時(shí)加藥，實(shí)驗(yàn)分組同前。24 h后胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗凈胰酶后，細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的75%乙醇固定過(guò)夜。上機(jī)前離心棄上清，PBS洗3次以充分洗凈固定液，加入100 μL染色劑(RNaseA 100 mg·L-1、50 mg·L-1PI、0.2% Triton X-100)，避光染色30 min后，加入400 μL預(yù)冷PBS，過(guò)300目尼龍網(wǎng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.6Westernblot法檢測(cè)蛋白表達(dá)常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞后加藥，胰酶消化收集各組細(xì)胞，PBS洗3次，在冰上加入RIPA裂解混合液，超聲細(xì)胞破碎儀破碎各組細(xì)胞，12 000×g離心10 min后留上清，BCA定量各組蛋白濃度。上樣50 μg，進(jìn)行半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)移至 NC膜上。5%的脫脂奶粉常溫封閉 1 h，一抗(1 ∶1 000稀釋)Akt、p-Akt(Ser473)、IκB、NF-κB、p-NF-κB p65、Bcl-2、Bax、cyclin A、PCNA和GAPDH 4℃孵育過(guò)夜，TBST洗NC膜3次，每次15 min。二抗常溫孵育1 h，TBST洗膜4次，每次10 min。將NC膜置于暗盒中，滴加ECL液化學(xué)發(fā)光(A液 ∶B液=1 ∶1)，顯影定影，用Scion Image軟件進(jìn)行灰度值分析。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1蟾酥活性成分與索拉非尼單獨(dú)以及聯(lián)合用藥對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制有協(xié)同作用肝癌HepG2細(xì)胞經(jīng)蟾蜍靈、華蟾毒配基和索拉非尼單藥處理及聯(lián)合處理后，在不同時(shí)間均能出現(xiàn)細(xì)胞增殖抑制作用。與單獨(dú)藥物作用組相比，藥物聯(lián)合作用組對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率明顯增高(Tab 1、Fig 1)。1 μmol·L-1蟾蜍靈+0.1 μmol·L-1索拉非尼作用12、24、48 h時(shí)，q值分別為1.05、1.32、1.19。1 μmol·L-1華蟾毒配基+0.1 μmol·L-1索拉非尼作用12、24、48 h時(shí)，q值分別為 1.10、1.20、1.13，在藥物作用24 h時(shí)均表現(xiàn)為協(xié)同作用(P<0.01)。

Tab 1 Effects of bufalin, cinobufagin, sorafenib and their combinations on proliferation of HepG2 cells (±s, n=3)

**P<0.01vscontrol group

2.2蟾酥活性成分與索拉非尼單獨(dú)以及聯(lián)合用藥

Fig 1 Effects of bufalin, cinobufagin, sorafenib andtheir combinations on proliferation of HepG2 cells (±s, n=3)

A: Effects of bufalin, sorafenib and their combination on proliferation of HepG2 cells; B: Effects of cinobufagin, sorafenib and their combination on proliferation of HepG2 cells.**P<0.01vssorafenib group

誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡形態(tài)變化經(jīng)熒光染色后(Fig 2)，熒光顯微鏡下可見(jiàn)對(duì)照組HepG2細(xì)胞核較大，被Hoechst 33342染成均勻的藍(lán)色熒光。蟾蜍靈、華蟾毒配基和索拉非尼作用組24 h后，可見(jiàn)藍(lán)染、染色質(zhì)凝集的凋亡細(xì)胞形態(tài)。藥物聯(lián)合作用組24 h后，藍(lán)染、染色質(zhì)凝集的凋亡細(xì)胞形態(tài)大量出現(xiàn)。

Fig 2 Effects of bufalin, cinobufagin, sorafenib and their combinations on cell morphology of HepG2 cells (× 200)

A: Control group; B: Sorafenib group; C: Bufalin group; D: Cinobufagin group; E: Bufalin combined with sorafenib; F: Cinobufagin combined with sorafenib

2.3蟾酥活性成分與索拉非尼單獨(dú)以及聯(lián)合用藥對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響Fig 3流式結(jié)果顯示，正常對(duì)照組細(xì)胞G0/G1、S、G2/M期比例分別為69.61%、20.85%、9.54%。索拉非尼作用24 h后，G1期細(xì)胞比例為72.88%，與對(duì)照組相比，差異有顯著性(P<0.01)，呈現(xiàn)G0/G1期周期阻滯。蟾蜍靈和華蟾毒配基作用24 h后，處于S期的細(xì)胞比例分別為38.17%、34.53%，與對(duì)照組的20.85%相比，差異有顯著性(P<0.01)，呈現(xiàn)S期周期阻滯。聯(lián)合用藥24 h后，索拉非尼聯(lián)合蟾蜍靈以及索拉非尼聯(lián)合華蟾毒配基處于S期的細(xì)胞分別上升至39.08%和38.23%，與對(duì)照組的20.85%相比，差異有顯著性(P<0.01)，呈現(xiàn)S期周期阻滯。

Fig 3 Effects of bufalin, cinobufagin, sorafenib and their combinations on cell cycle of HepG2 cells(±s, n=3)

A: Control group; B: Sorafenib group; C: Bufalin group; D: Cinobufagin group; E: Bufalin combined with sorafenib; F: Cinobufagin combined with sorafenib; G: Changes of HepG2 cells S phases in proportion of bufalin, cinobufagin, sorafenib and their combination treatment.**P<0.01vscontrol group.

2.4蟾酥活性成分與索拉非尼單獨(dú)以及聯(lián)合用藥對(duì)HepG2細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.4.1蟾酥活性成分與索拉非尼單獨(dú)以及聯(lián)合用藥對(duì)HepG2細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 如Fig 4A所示，1 μmol·L-1蟾蜍靈、1 μmol·L-1華蟾毒配基與0.1 μmol·L-1索拉非尼單獨(dú)或聯(lián)合作用HepG2細(xì)胞24 h后，cyclin A、PCNA蛋白表達(dá)量下調(diào)，藥物聯(lián)合作用組明顯下調(diào)，與正常對(duì)照組相比，差異有顯著性(P<0.01)。Cyclin A、PCNA蛋白表達(dá)量的降低，提示蟾酥活性成分與索拉非尼聯(lián)合用藥可能引起HepG2細(xì)胞S期細(xì)胞周期阻滯。

2.4.2蟾酥活性成分與索拉非尼單獨(dú)以及聯(lián)合用藥對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 如Fig 4B所示，1 μmol·L-1蟾蜍靈、1 μmol·L-1華蟾毒配基與0.1 μmol·L-1索拉非尼單獨(dú)或聯(lián)合作用HepG2細(xì)胞24 h后，Bcl-2蛋白表達(dá)量下調(diào)，藥物聯(lián)合作用組明顯下調(diào)，與正常對(duì)照組相比，差異有顯著性(P<0.01)。Bax蛋白表達(dá)量上調(diào)，藥物聯(lián)合作用組明顯上調(diào)，與正常對(duì)照組相比，差異有顯著性(P<0.01)。Bcl-2/Bax的比值下降，藥物聯(lián)合作用組下降明顯，與正常對(duì)照組相比，差異有顯著性(P<0.01)。Bcl-2/Bax的比值常作為細(xì)胞凋亡“分子開(kāi)關(guān)”，其比值的下降使細(xì)胞對(duì)凋亡抑制作用減弱，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。

2.4.3蟾酥活性成分與索拉非尼單獨(dú)以及聯(lián)合用藥對(duì)HepG2細(xì)胞信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 如Fig 4C所示，1 μmol·L-1蟾蜍靈、1 μmol·L-1華蟾毒配基與0.1 μmol·L-1索拉非尼單獨(dú)作用或聯(lián)合作用HepG2細(xì)胞24 h后，Akt、NF-κB總蛋白表達(dá)均無(wú)明顯變化；p-Akt(Ser473)、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)量下調(diào)，藥物聯(lián)合作用組明顯下調(diào)，與正常對(duì)照組相比，差異有顯著性(P<0.01)。IκB蛋白表達(dá)量上調(diào)，藥物聯(lián)合作用組明顯上調(diào)，與正常對(duì)照組相比，差異有顯著性(P<0.01)。

3 討論

HCC的致死率居世界第2位，其發(fā)生發(fā)展與信號(hào)通路的異常密切相關(guān)。Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一。研究顯示，Akt信號(hào)通路在人類(lèi)腫瘤細(xì)胞中普遍失調(diào)，因此，該通路為腫瘤靶向治療和預(yù)防轉(zhuǎn)移提供新的思路。Akt抑制劑GSK2110183、MK-2206在肺癌、胰腺癌以及血液惡性腫瘤中表現(xiàn)出很好的治療效果[9]。索拉非尼是一種多靶點(diǎn)的激酶抑制劑，經(jīng)美國(guó)食品藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)用于晚期HCC的標(biāo)準(zhǔn)治療藥物。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，索拉非尼可以通過(guò)下調(diào)Akt信號(hào)途徑，抑制人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的生長(zhǎng)增殖[10]，但發(fā)現(xiàn)索拉非尼單獨(dú)作用于Akt信號(hào)通路，對(duì)信號(hào)途徑中的關(guān)鍵酶Akt、mTOR等磷酸化抑制作用卻有限[11]。同時(shí)，流行病學(xué)隊(duì)列研究顯示，索拉非尼僅僅能延長(zhǎng)HCC患者生存3個(gè)月，并且具有多種不良反應(yīng)。因此，篩選臨床中索拉非尼的效應(yīng)增強(qiáng)劑或協(xié)同效應(yīng)劑成為客觀需求[2]。已有研究表明，索拉非尼聯(lián)合培美曲塞通過(guò)抑制Akt途徑有效誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡[12]；索拉非尼聯(lián)合C2-神經(jīng)酰胺通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR和ERK信號(hào)通路，有效誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[13]。蟾酥及其相關(guān)制劑為我國(guó)傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物，在我國(guó)廣泛用于肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤的中晚期治療，療效明顯。蟾酥注射液聯(lián)合放化療有效治療中晚期肺癌、胃癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤[6]。相關(guān)研究報(bào)道，蟾蜍靈和華蟾毒配基通過(guò)抑制Akt信號(hào)通路，下調(diào)Bcl-2/Bax的比值，誘導(dǎo)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡[6]。

A: The protein levels of cyclin A and PCNA in HepG2 cells treated with bufalin, cinobufagin, sorafenib and their combinations; B: The protein levels of Bcl-2 and Bax in HepG2 cells treated with bufalin, cinobufagin, sorafenib and their combinations; C: The protein levels of Akt/NF-κB signal in HepG2 cells treated with bufalin, cinobufagin, sorafenib and their combinations.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

本研究將蟾蜍靈、華蟾毒配基分別與索拉非尼聯(lián)合作用于肝癌HepG2細(xì)胞，結(jié)果顯示，蟾蜍靈、華蟾毒配基和索拉非尼對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞均有抑制增殖的作用，且呈時(shí)間依賴(lài)性。藥物聯(lián)合作用時(shí)抑制增殖作用更加明顯，并在作用24 h后產(chǎn)生協(xié)同抑制效果。同時(shí)出現(xiàn)了染色質(zhì)凝集等細(xì)胞凋亡形態(tài)，藥物聯(lián)合作用細(xì)胞凋亡形態(tài)更為明顯。流式結(jié)果顯示，索拉非尼將細(xì)胞阻滯在G1期，蟾蜍靈和華蟾毒配基單藥以及與索拉非尼聯(lián)合作用使細(xì)胞阻滯在S期。Cyclin A是正向細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，在G1晚期出現(xiàn)合成，S期開(kāi)始檢測(cè)到激酶活性，促進(jìn)DNA的復(fù)制合成。PCNA是真核細(xì)胞DNA合成所必須的一種核蛋白，是DNA聚合酶的輔助蛋白，直接參與DNA的復(fù)制[8]， G1期后期開(kāi)始出現(xiàn)，S期達(dá)到高峰，G2/M期明顯下降。本研究中發(fā)現(xiàn)，藥物聯(lián)合后cyclin A、PCNA的蛋白表達(dá)下降更為明顯，從而推斷藥物聯(lián)合以后可能引起S期細(xì)胞周期阻滯，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，PI3K激活的Akt可以通過(guò)磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、caspase-9、NF-κB等，是重要的抗凋亡調(diào)節(jié)因子[14]。NF-κB是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞最重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在多數(shù)細(xì)胞中，NF-κB以同源二聚體或異源三聚體的形式與其抑制蛋白IκB直接結(jié)合，形成三聚體復(fù)合物，以無(wú)活性形式存在于多種類(lèi)型細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，有信號(hào)誘導(dǎo)激活I(lǐng)κB激酶(IKK)，引起IκB的降解，使NF-κB快速入核，與DNA接觸，從而調(diào)控下游基因的表達(dá)。通過(guò)誘導(dǎo)抗凋亡因子Bcl-2蛋白家族，啟動(dòng)凋亡抑制因子(X-chromosome linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)，促進(jìn)癌基因c-Myc的激活，進(jìn)而對(duì)凋亡信息產(chǎn)生抗性，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)。相關(guān)研究報(bào)道，NF-κB的持續(xù)活化可作為包括乳腺腫瘤、卵巢腫瘤、直腸癌、胰腺癌、前列腺癌、黑色素瘤等實(shí)體瘤和白血病的標(biāo)志[15]。提示我們，阻斷NF-κB的活化，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡為惡性腫瘤的治療提供了新的思路。Bcl-2家族蛋白在線粒體內(nèi)源性凋亡通路中起著重要作用，Bcl-2具有拮抗細(xì)胞凋亡作用，Bax具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，Bcl-2與Bax的比值對(duì)藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡起著決定性的作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，藥物作用肝癌HepG2細(xì)胞后，單獨(dú)藥物作用組與藥物聯(lián)合作用組Akt、NF-κB總蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化，但是，p-Akt(Ser473)、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯降低，且藥物聯(lián)合作用組降低程度更加明顯；Bcl-2蛋白表達(dá)水平逐漸降低，藥物聯(lián)合作用組降低程度更加明顯；IκB、Bax蛋白表達(dá)水平逐漸升高，藥物聯(lián)合作用組升高更為明顯。結(jié)果顯示，蟾蜍靈、華蟾毒配基聯(lián)合索拉非尼抑制Akt信號(hào)通路，直接或間接抑制IKK活性，減少I(mǎi)κB蛋白的降解，從而抑制NF-κB通路，減少Bcl-2蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)Bax的表達(dá)，使Bcl-2/Bax的比值下降，從而抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡。

綜上，蟾酥活性成分蟾蜍靈和華蟾毒配基協(xié)調(diào)索拉非尼通過(guò)下調(diào)Akt/NF-κB信號(hào)通路，抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖。

(致謝：本文實(shí)驗(yàn)在天津武警后勤學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室完成，衷心感謝課題組老師和同學(xué)的協(xié)助)。

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SynergywiththeactiveingredientsoftoadvenomandsorafenibsuppresseshepatocellularcarcinomaHepG2cellsproliferationthroughdown-regulatingAkt/NF-κBsignalingpathways

WANG Zhi-mei1, XU Zhong-wei2, WANG Jia-bao1, DAI Er-qing3, XU Rui-cheng2,4

(1.thePostgraduateCultureBaseofJinzhouMedicalUniversity-theAffiliatedHospitalofLogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce,Tianjin300162,China; 2.CentralLaboratoryLogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce,Tianjin300162,China; 3.theAffiliatedHospitalofLogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce,Tianjin300162,China; 4.KeyLabforBiomarkersofOccupationalandEnvironmentalHazard,Tianjin300309,China)

AimTo investigate the effect of the active ingredients of toad venom (bufalin and cinobufagin)combined with sorafenib on the growth of hepatocellular carcinoma HepG2 cells, and to explore the possible mechanism.MethodsThe rates of inhibition after treated with drugs 12, 24, 48 h were detected by MTT assay. The changes of cell morphology were detected by Hoechst 33342 fluorescent staining. The changes of cell cycle were detected by flow cytometry. The expressions of proteins such as Akt, p-Akt(Ser473), IκB, NF-κB, p-NF-κB p65, Bcl-2, Bax, cyclin A, PCNA were detected by Western blot.ResultsBufalin, cinobufagin and sorafenib could inhibit the proliferation of HepG2 cells, presenting a dose- and time-dependent manner. Meanwhile, it could significantly increase the inhibitory rate of cells compared with those of single treatment, and they performed a synergistic activity in sorafenib combined with cinobufagin or bufalin by Jin Formula after 24 h treatment (P<0.01). The results of fluorescence staining showed the observation of the morphological features of nuclear condensation. Sorafenib induced the cell cycle G0/G1phase arrest (P<0.01), and bufalin, cinobufagin and the combination treatment generated the cell cycle S phase arrest (P<0.01). The results of Western blot showed that the expressions of Akt, NF-κB were not obviously changed between control and all other treatment. The expression levels of p-Akt(Ser473), p-NF-κB p65, Bcl-2, PCNA and cyclin A in combination treatment significantly decreased, and the expression levels of IκB and Bax significantly increased compared to those in single treatment (P<0.01).ConclusionThe active ingredients of toad venom (bufalin and cinobufagin) combined with sorafenib performs a synergetic effect on the anti-cancer of HepG2 cells by down-regulating Akt/NF-κB signaling pathway.

sorafenib; toad venom; bufalin; cinobufagin; HepG2; Akt; NF-κB

A

1001-1978(2017)11-1510-07

R282.74；R329.24；R329.28；R735.7；R979.1

時(shí)間：2017-10-10 10:05 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20171010.1005.016.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.11.008

2017-08-19，

2017-09-21

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81673651，81273552，81273745)；武警后勤學(xué)院博士啟動(dòng)金項(xiàng)目(No WHB201501)

王志美(1989-)，女，碩士生，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合臨床，E-mail：1032924476@qq.com； 代二慶(1969-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合臨床，通訊作者，E-mail：13502136445@163.com； 徐瑞成(1968-)，男，碩士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通訊作者，Tel：022-84876451，E-mail：xu_rc@sohu.com