王少輝，劉萍萍，魏建超，邵東華，趙秋華，史子學，馬志永

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.上海市閔行區(qū)動物疫病預防控制中心，上海 201109）

單增李斯特菌inlK基因缺失株的構(gòu)建及其生物學特性分析

王少輝1，劉萍萍1，魏建超1，邵東華1，趙秋華2，史子學1，馬志永1

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.上海市閔行區(qū)動物疫病預防控制中心，上海 201109）

為了分析內(nèi)化素InlK對單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）生物學特性及致病性的影響，利用自殺性質(zhì)粒進行同源重組構(gòu)建LM標準菌株10403s的inlK基因缺失株，然后比較分析野生株、inlK基因缺失株的生長特性、生物被膜形成能力、細胞侵襲能力、動物致病力等差異。結(jié)果顯示，inlK基因缺失不影響LM的生長速度，但可導致LM的生物被膜形成能力下降。細胞感染試驗表明基因缺失株ΔinlK對RAW264.7細胞的侵襲及胞內(nèi)存活能力分別下降了18%和31%。動物感染試驗顯示野生株和基因缺失株ΔinlK對小鼠的致死率分別為80%（4/5）和40%（2/5），且基因缺失株ΔinlK的體內(nèi)定殖能力顯著低于野生株。本研究表明內(nèi)化素InlK在LM感染過程中發(fā)揮著重要作用，為了解LM的致病作用提供參考。

單增李斯特菌；inlK基因；致病性

Abstract:To determine the biological role of internalin InlK of Listeria monocytogenes (LM), the inlK gene mutant strain ΔinlK was constructed from the virulent strain 10403s by the homologous recombination technology. The growth curve, bio fi lm formation, adhesion and invasion capacity to RAW264.7 cells and and pathogenicity in mice of wild-type strain, and mutant strain were determined. The results showed that inactivation of the inlK gene did not affect the growth but the bio fi lm formation decreased. Moreover, the invasion and intracellular survival capacities of mutant ΔinlK reduced by 18% and 31% as compared with the wild-type strain. In the mouse infection experiment, the mortality rate of wild-type strain and mutant ΔinlK was 80% (4/5) and 40% (2/5), respectively. Moreover, mutant strain ΔinlK displayed signi fi cant decreased colonization capacity in mice. These data indicated that internalin InlK was involved in the LM infection, indicating its contribution to pathogenicity.

Key words:Listeria monocytogenes; inlK gene; pathogenicity

單核細胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）又稱單增李斯特菌，是一種胞內(nèi)寄生的革蘭陽性桿菌。LM是重要的人獸共患病原菌，廣泛存在于自然界，由于LM耐受環(huán)境能力強，近年來，由單增李斯特菌引起的食物中毒的情況日趨嚴重，在歐美等地由LM造成的食物污染程度和病例已大大超過沙門菌[1-3]，對食品安全已形成嚴重威脅。LM經(jīng)污染食物進入人和動物體內(nèi)后，入侵腸道上皮細胞，擴散至全身從而引起敗血癥、腦膜炎及孕婦孕畜流產(chǎn)等。李斯特菌病雖發(fā)病率不高，但其致死率（20%～30%）遠高于其他常見食源性病原菌[4,5]。

LM侵入宿主后，毒力因子在黏附、侵襲等致病過程中發(fā)揮重要作用，因此研究LM毒力因子的分子致病機理，有助于李斯特菌病的防控。內(nèi)化素在LM侵襲宿主細胞過程中發(fā)揮重要作用，目前在LM基因組中發(fā)現(xiàn)了25種內(nèi)化素，其中，內(nèi)化素InlA和InlB在介導LM穿越宿主血腦屏障、血胎屏障的過程中都起著重要的作用[6-9]。其他內(nèi)化素的具體作用機制尚不清楚。Glaser等[10]通過比較基因組學分析發(fā)現(xiàn)lmo1290（inlK）基因僅存在于LM中，不存在于非致病性李斯特菌中，且LM感染過程中其表達明顯上升，提示lmo1290（inlK）基因參與LM致病過程。David等[11]通過蛋白結(jié)晶分析了InlK具有內(nèi)化素的保守序列。Laurent等[12]闡明了內(nèi)化素InlK在LM逃避自噬過程中的作用。然而，inlK基因?qū)M的生物學特性的影響尚不十分清楚。因此，本文構(gòu)建LM菌株10403s的inlK基因缺失株，并對其生物學特性進行研究。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒單增李斯特菌標準菌株10403s由浙江大學方維煥教授惠贈；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自天根（北京）生化科技有限公司；溫度敏感性穿梭質(zhì)粒pKSV7由本實驗室保存；pMD18T載體購自大連TaKaRa公司。

1.2 主要試劑和儀器腦心浸液培養(yǎng)基（Brain Heart Infusion，BHI）購自青島海博生物科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自天根（北京）生化科技有限公司；2×PCR Mix、DNA Marker購自北京康為世紀生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶購自大連TaKaRa公司；PCR儀為ABI公司產(chǎn)品；核酸電泳儀購自北京市六一儀器廠；全自動凝膠成像系統(tǒng)為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計根據(jù)單增李斯特菌10403s基因組序列，設(shè)計inlK基因上游同源臂擴增引物、下游同源臂擴增引物、缺失鑒定引物及互補引物（表1），由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

表1 本研究中使用引物Table 1 Primers used in this study

1.4 基因缺失株的構(gòu)建根據(jù)同源重組原理構(gòu)建LM10403sinlK基因缺失株。以細菌基因組為模板，分別PCR擴增inlK基因的上下游同源臂片段，回收PCR產(chǎn)物。然后以PCR產(chǎn)物為模板進行融合PCR將inlK基因上下游同源臂連接，并克隆至pMD18T載體測序。提取測序正確的質(zhì)粒，雙酶切后克隆至自殺性質(zhì)粒pKSV7。然后將重組自殺性質(zhì)粒pKSV7-inlKUD轉(zhuǎn)化至LM10403s中，通過溫度和氯霉素抗性壓力進行同源重組，然后在無抗性壓力下傳代，使載體丟失，經(jīng)PCR和測序鑒定基因缺失株，獲得的基因缺失株命名為ΔinlK株。

1.5 生長曲線測定測定LM10403s和基因缺失株ΔinlK的生長速度，分析inlK基因是否影響LM的生長特性。將菌液按1∶100接種于LB培養(yǎng)基，于37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，每小時取樣并測定菌液的OD600，記錄并繪制生長曲線圖。

1.6 生物被膜形成能力測定將LM10403s和基因缺失株ΔinlK在相同條件下培養(yǎng)，調(diào)節(jié)OD600至1.0，按1∶100比例稀釋至BHI培養(yǎng)基中，分別加入96孔聚苯乙烯微孔板，每孔200 μL，37℃靜置培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)液，用無菌PBS洗滌3次后加入200 μL結(jié)晶紫染色1 h。然后用PBS洗滌5次，自然風干后加入200 μL 95%乙醇，作用5～10 min，測定OD595，以無菌培養(yǎng)基作為陰性對照。

1.7 細胞侵襲試驗在BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)LM10403s及ΔinlK至對數(shù)生長期，收集菌體，用DMEM洗滌重懸。按10 MOI感染RAW264.7細胞，于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中感染1 h，以DMEM作為陰性對照。用無菌PBS洗滌3次，用含有慶大霉素（100 μg/mL）的DMEM作用1 h和3 h，用無菌PBS洗滌3次，然后用0.5% Triton-X 100裂解細胞并倍比稀釋，涂BHI平板，進行菌落計數(shù)。

1.8 動物致病性測定將對數(shù)生長期細菌用無菌PBS洗滌3次，重懸。以攻毒劑量為1×104CFU感染6～8周齡BALB/c小鼠，每組5只，連續(xù)觀察14 d，觀察并記錄小鼠死亡情況。

1.9 體內(nèi)載菌量測定將對數(shù)生長期細菌用無菌PBS洗滌3次，然后重懸，以腹腔方式感染8周齡BALB/c小鼠，攻毒劑量為1×105CFU/只，每組6只。24 h后，無菌采取脾臟，加入PBS勻漿，倍比稀釋涂布平板，37℃培養(yǎng)過夜后進行菌落計數(shù)，測定不同菌株在脾臟中的定殖生存能力。

2 結(jié)果

2.1 基因缺失株、互補株的構(gòu)建及鑒定將重組自殺性質(zhì)粒pKSV7-inlKUD電轉(zhuǎn)化至LM感受態(tài)細胞后，挑取疑似基因缺失株進行PCR鑒定，結(jié)果顯示缺失株內(nèi)側(cè)鑒定引物無法擴增出inlK基因。交叉PCR鑒定顯示野生株可以擴增出目的條帶，而缺失株則無目的條帶（圖1）。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果表明，基因缺失株ΔinlK構(gòu)建成功。

圖1 基因缺失株ΔinlK的PCR鑒定Fig.1 Identi fi cation of mutant strain ΔinlK by PCR

2.2 生長曲線測定生長曲線結(jié)果顯示，基因缺失株ΔinlK的生長速度與野生株相比無顯著變化，表明inlK基因不影響LM的生長（圖2）。

圖2 基因缺失株與野生株的生長曲線測定Fig.2 Bacterial growth curve of mutant ΔinlK and wild-type strain

2.3 生物被膜形成能力測定生物被膜在細菌抵抗外界不利環(huán)境過程中發(fā)揮作用，由圖3可見，缺失株ΔinlK與野生株相比，生物被膜形成能力顯著下降（P＜ 0.01），表明inlK基因?qū)τ贚M形成生物被膜具有重要作用。

2.4 侵襲能力測定分析顯示inlK基因編碼內(nèi)化素，可能參與LM侵襲細胞及胞內(nèi)存活。細胞侵襲試驗結(jié)果顯示，缺失株ΔinlK對RAW264.7細胞的侵襲及胞內(nèi)存活能力均顯著低于野生株（P＜ 0.01），表明inlK基因在LM侵襲細胞過程中發(fā)揮重要作用（圖4）。

圖3 生物被膜形成能力測定Fig.3 Determination of bio fi lm formation capacity of LM

圖4 細胞侵襲試驗結(jié)果Fig.4 Invasion capacity of LM to RAW264.7 cells

2.5 致病性測定動物攻毒試驗結(jié)果顯示，LM10403s和基因缺失株ΔinlK對BALB/c小鼠的致死率分別為80%（4/5）和40%（2/5）（圖5），表明inlK基因缺失導致LM致病力明顯降低。

2.6 體內(nèi)載菌量測定體內(nèi)載菌量統(tǒng)計結(jié)果顯示缺失株ΔinlK感染小鼠后，其在脾中的定殖能力均明顯低于野生株（P＜0.05）（圖6），表明缺失株ΔinlK對小鼠的感染能力下降，毒力降低。

3 討論

LM能引起人、畜李斯特菌病，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多等癥狀。近年來，由單增李斯特菌引起的食物中毒的情況日趨嚴重，在歐美等地由此菌造成的食物污染程度和病例已大大超過沙門菌[1,3-5]。LM在體內(nèi)感染及胞內(nèi)感染過程中，其毒力因子相互協(xié)作，從而有利于LM感染及致病。目前，LM的毒力相關(guān)基因主要為毒力島Ⅰ和毒力島Ⅱ[5]。由于LM是典型的胞內(nèi)寄生病原菌，內(nèi)化素對于LM侵襲細胞及胞內(nèi)存活至關(guān)重要。目前，已經(jīng)鑒定了25個內(nèi)化素，其中InlA、InlB的功能研究較為透徹，在LM穿透血腦屏障和血胎屏障過程中發(fā)揮重要作用。利用InlC作為探針進行DNA雜交，發(fā)現(xiàn)了一些新的內(nèi)化素InlC2、InlD、InlE和InlF，然而其具體作用有待進一步研究[6-8]。研究表明，InlJ在感染小鼠的過程中發(fā)揮作用，但是其具體作用機制尚不清楚[13]。前期研究結(jié)果表明，inlK基因編碼內(nèi)化素，且有助于LM逃避自噬，從而發(fā)揮致病作用。然而，inlK基因?qū)M的生物學特性的影響尚不十分清楚。

圖5 基因缺失株與野生株存活曲線Fig.5 Survival curve of mutant ΔinlK and virulent strain

圖6 單增李斯特菌感染小鼠脾臟載菌量測定Fig.6 Bacterial loads in spleens of mice infeted with LM

LM的內(nèi)化素均含有亮氨酸重復序列，位于細菌表面，可以識別細胞受體和幫助LM逃避自噬[6,11]。本研究構(gòu)建了LM標準菌株10403s的inlK基因缺失株，生長曲線結(jié)果表明內(nèi)化素InlK不影響LM的生長速度。生物被膜是細菌為適應外界環(huán)境變化而選擇的一種與浮游形式不同的生長方式，可增強細菌對抗生素及宿主的免疫反應，因此有利于細菌存活。缺失內(nèi)化素InlK導致LM的生物被膜形成能力顯著降低。內(nèi)化素InlK位于LM細胞膜外，可能與細菌胞外蛋白或組織表面物質(zhì)發(fā)生相互作用，有助于LM吸附于組織表面，這可能是野生株比缺失株生物被膜形成能力強的原因之一。

由于內(nèi)化素在LM侵襲細胞過程中發(fā)揮重要作用[8]，因此本研究分析了內(nèi)化素InlK對LM侵襲RAW264.7細胞的影響，結(jié)果顯示缺失株對RAW264.7細胞的侵襲率及胞內(nèi)存活能力均明顯低于野生株，表明內(nèi)化素InlK有助于LM的侵襲及胞內(nèi)存活。以小鼠為模型進行的體內(nèi)感染試驗結(jié)果顯示，缺失內(nèi)化素InlK導致LM在脾臟中的定殖能力顯著降低，從而導致缺失株的致病力下降。LM的其他內(nèi)化素，包括InlA、InlB、InlJ的基因缺失株在感染小鼠后，其在體內(nèi)定殖能力亦顯著低于野生株，從而降低致病力及致死率。另外，InlK可以招募穹窿體蛋白促進LM逃避自噬，增強其在體內(nèi)定殖及存活能力，發(fā)揮致病作用。因此，缺失InlK可能降低了LM的胞內(nèi)存活能力及致病力。

本研究成功構(gòu)建了LM內(nèi)化素inlK基因缺失株，并開展了InlK對LM生長特性、生物被膜形成能力、細胞侵襲能力、小鼠致病性的影響，為進一步研究LM的致病機理及防控李斯特菌病提供參考。

[1] Gombas D E, Chen Y, Clavero R S,et al. Survey ofListeria monocytogenesin ready-to-eat foods[J]. J Food Prot, 2003, 66(4)∶ 559-569.

[2] Liu D. Identification, subtyping and virulence determination ofListeria monocytogenes, an important foodborne pathogen[J]. J Med Microbiol, 2006, 55(Pt 6)∶645-659.

[3] Soto B M, Gerba C P, Porto F A,et al. Prevalence and characterization ofListeria monocytogenes, Salmonella and Shiga toxin-producingEscherichia coliisolated from small Mexican retail markets of queso fresco[J]. Int J Environ Health Res, 2015, 25(2)∶ 140-148.

[4] Mammina C, Aleo A, Romani C,et al. Characterization ofListeria monocytogenesisolates from human listeriosis cases in Italy[J]. J Clin Microbiol, 2009, 47(9)∶ 2925-2930.

[5] Mostowy S, Cossart P. From pathogenesis to cell biology and back[J]. Cell Host Microbe, 2009, 5(6)∶ 510-513.

[6] Bierne H, Sabet C, Personnic N,et al. Internalins∶ a complex family of leucine-rich repeat-containing proteins inListeria monocytogenes[J]. Microbes Infect,2007, 9(10)∶ 1156-1166.

[7] Braun L, Dramsi S, Dehoux P,et al. InlB∶ an invasion protein ofListeria monocytogeneswith a novel type of surface association[J]. Mol Microbiol, 1997, 25(2)∶ 285-294.

[8] Cabanes D, Dehoux P, Dussurget O,et al. Surface proteins and the pathogenic potential ofListeria monocytogenes[J]. Trends Microbiol, 2002, 10(5)∶ 238-245.

[9] Cossart P, Toledo-Arana A.Listeria monocytogenes,a unique model in infection biology∶ an overview[J].Microbes Infect, 2008, 10(9)∶ 1041-1050.

[10] Glaser P, Frangeul L, Buchrieser C,et al. Comparative genomics of Listeria species[J]. Science, 2001, 294(5543)∶849-852.

[11] Neves D, Job V, Dortet L,et al. Structure of internalin InlK from the human pathogenListeria monocytogenes[J].J Mol Biol, 2013, 425(22)∶ 4520-4529.

[12] Dortet L, Mostowy S, Samba-Louaka A,et al.Recruitment of the major vault protein by InlK∶ aListeria monocytogenesstrategy to avoid autophagy[J]. PLoS Pathog, 2011, 7(8)∶ e1002168.

[13] Sabet C, Toledo-Arana A, Personnic N,et al. TheListeria monocytogenesvirulence factor InlJ is specifically expressedin vivoand behaves as an adhesin[J]. Infect Immun, 2008, 76(4)∶ 1368-1378.

CONSTRUCTION AND CHARACTERIZATION OF INLK GENE MUTANT STRAIN OF LISTERIA MONOCYTOGENES

WANG Shao-hui1, LIU Ping-ping1, WEI Jian-chao1, SHAO Dong-hua1, ZHAO Qiu-hua2, SHI Zi-xue1,MA Zhi-yong1

(1. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. Minhang Center of Animal Disease Prevention and Control in Shanghai, Shanghai 201109, China)

S852.615

A

1674-6422（2017）04-0019-05

2016-08-10

國家自然科學基金（81201266）

王少輝，男，漢族，副研究員，主要從事畜禽細菌性傳染病研究

馬志永， E-mail：zhiyongma@shvri.ac.cn