熊 煒，王 艷，魏曉鋒，李春陽，張 強，黃忠榮，胡建華，李 健

（1.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135；2.上海實驗動物研究中心，上海 201203）

可視化豬肺炎支原體LAMP檢測方法的建立

熊 煒1，王 艷1，魏曉鋒2，李春陽1，張 強1，黃忠榮1，胡建華2，李 健1

（1.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135；2.上海實驗動物研究中心，上海 201203）

由豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae）引起的慢性肺炎是最難凈化的疫病之一，它流行廣、感染率高，對養(yǎng)豬業(yè)危害巨大。為了加強口岸現(xiàn)場查驗動物源性產(chǎn)品中豬肺炎支原體的力度，本研究建立了豬肺炎支原體環(huán)介導等溫核酸擴增技術(shù)（Loop-mediated isothermal ampli fi cation，LAMP）檢測方法。本研究通過在LAMP反應產(chǎn)物中加入顯色液，提高了檢測結(jié)果肉眼判定的準確性，實現(xiàn)了結(jié)果判定可視化的目標，有助于出入境口岸貨物查驗現(xiàn)場及豬場中豬肺炎支原體的檢測。

豬肺炎支原體；LAMP；可視化檢測

Abstract:Mycoplasma hyopneumoniae causes chronic pneumonia among pigs, which is one of hard erased diseases with characters of wide spread and high infection. In order to survey and detect Mycoplasma hyopneumoniae carried by animal original products at entryexit port, a Loop-mediated isothermal ampli fi cation (LAMP) method was established and proved to be speci fi c with high sensitivity and stability. By adding SybrGreen into LAMP product liquid, detection results could be read easily by eyes, which is more convenient to be used by ports and basic laboratories.

Key words:Mycoplasma hyopneumoniae；loop-mediated isothermal ampli fi cation (LAMP)；visible detection

豬支原體肺炎是由豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae）引發(fā)的一種慢性肺炎，又稱豬地方流行性肺炎，長期以來，本病一直被認為對養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟損失、且最常發(fā)生、流行最廣、最難凈化的重要疫病之一[1,2]。豬肺炎支原體對生長條件的需求極為苛刻，體外分離培養(yǎng)相當困難，它在傳統(tǒng)的基本肉湯培養(yǎng)基中生長緩慢，需經(jīng)3～30 d，肉湯培養(yǎng)基才能產(chǎn)生輕微的混濁，并產(chǎn)酸使顏色發(fā)生變化[3,4]。因此，傳統(tǒng)的生化和血清學檢測方法應用于進出境口岸豬肺炎支原體快速檢測具有明顯的局限性。此外，由于豬肺炎支原體易與其他豬病病原體相混淆，自然發(fā)生的病例均為混合感染，其可能混雜有細菌、病毒和寄生蟲，因此其對檢測方法的特異性、敏感性要求較高[5]。環(huán)介導等溫核酸擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型的核酸檢測方法，其特異性和敏感性可以與熒光PCR媲美，同時其檢測周期短、操作簡便、對檢測硬件設(shè)備的要求較低，適合于野外現(xiàn)場使用。目前，該技術(shù)已成功應用于口蹄疫、豬瘟等重大動物疫病的檢測，但應用于豬肺炎支原體的檢測鮮有報道。本研究通過分析豬肺炎支原體的基因序列，設(shè)計了多套LAMP引物體系，從中篩選出了理想的引物，建立了豬肺炎支原體的LAMP檢測方法，并實現(xiàn)了檢測結(jié)果的可視化判讀。

1 材料與方法

1.1 主要試劑ThermoPol緩沖液、Bst DNA聚合酶購自New England BioLabs公司；RNA酶抑制劑、dNTP、隨機引物、DNA Marker（DL2000）購自TaKaRa公司；甜菜堿（Betaine）購自Sigma公司；超純水購自Invitrogen公司。

1.2 毒株來源及樣品處理豬肺炎支原體、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV）SD1株、豬細小病毒（Porcine parvovirus，PPV）、偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）SA215株、豬圓環(huán)病毒2型（ Porcine circovirus type 2，PCV2）、豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）H株等的組織樣本、核酸樣本、細胞培養(yǎng)物為本實驗室和上海實驗動物研究中心保存。陽性組織樣品加等體積生理鹽水研磨勻漿，3000 ×g離心15 min，收集上清液待檢。

1.3 病毒核酸的提取取100 μL待檢上清液或血清，采用Qiagen DNA Blood mini Kit提取豬肺炎支原體、PPV、PRV、PCV2基因組；采用Trizol提取PRRSV、TGEV基因組，再制備成cDNA保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 LAMP引物設(shè)計從GenBank獲取豬肺炎支原體的基因序列，通過軟件分析和比對，使用Primer Explorer和LAMP Designer軟件設(shè)計豬肺炎支原體的LAMP特異引物，共設(shè)計12組（P1～P12）針對不同基因保守區(qū)域的引物，經(jīng)篩選鑒定，確定采用P1體系來擴增mhp165 基因，其具體序列見表1。

表1 P1引物Table 1 Primer 1

1.5 LAMP檢測體系反應體系總體積（25 μL）：1×ThermPol緩沖液2.5 μL，模板DNA 2 μL，其余各組份的終濃度：MgSO48 mmol/L，甜菜堿1 mol/L，dNTPs 1.4 mmol/L，外引物（F3和B3）0.2 μmol/mL，內(nèi)引物（FIP和BIP）1.6 μmol/mL，環(huán)引物（LF和LB）0.8 μmol/mL，Bst聚合酶8U。

1.6 LAMP檢測體系的敏感度試驗將提取的豬支原體肺炎基因組DNA分別稀釋至0.4×10-1、0.4×10-2、0.4×10-3、0.4×10-4、0.4×10-5ng/μL，以無菌ddH2O為空白對照，按照63℃恒溫反應60 min進行LAMP擴增，凝膠電泳判定結(jié)果?？梢暬瘷z測：配制上述相同的體系，并在檢測管的管蓋上滴加2 uL SybrGreen顯色液，小心蓋好反應管蓋，63℃運行60 min后，反應管顛倒混勻，肉眼判讀結(jié)果。

1.7 LAMP檢測體系的特異性試驗配置與1.6相同的反應體系分裝至6支LAMP反應管，再依次加入豬肺炎支原體、PRRSV、PPV、PRV、PCV2、TGEV等病毒核酸，按照63℃恒溫反應60 min進行LAMP擴增，凝膠電泳判定結(jié)果?？梢暬瘷z測：配制上述相同的體系，并在檢測管管蓋上滴加2 uL SybrGreen顯色液，小心蓋好反應管蓋，63℃運行60 min，反應結(jié)束后，反應管顛倒混勻，肉眼判讀結(jié)果。

1.8 LAMP檢測體系的重復性、穩(wěn)定性和實際樣品檢測以不同次提取的豬肺炎支原體核酸為模板進行5次LAMP；以不同批次水、Mg2+、Betaine、dNTP和酶為試劑，不同恒溫設(shè)備，在不同時間和實驗場所分別進行LAMP檢測，依次分析本研究所建立方法的重復性和穩(wěn)定性。將不同來源的8份豬肺炎支原體臨床組織樣本，分別采用PCR方法和建立的LAMP方法進行檢測，鑒定兩種檢測方法結(jié)果是否一致。

2 結(jié)果

2.1 豬肺炎支原體LAMP特異性引物的篩選針對豬肺炎支原體不同的保守基因序列共設(shè)計了12套LAMP引物，將這些引物放入相同的LAMP反應體系中進行反應，以評估不同LAMP引物體系擴增的效果（P1-P4引物擴增結(jié)果為例）。結(jié)果顯示，P1擴增豬肺炎支原體效果最顯著，起峰早，擴增效率高（圖1）。

圖1 不同引物體系的擴增曲線圖Fig. 1 Amplify curve of different primers

2.2 可視化豬肺炎支原體LAMP檢測方法的敏感性將提取的豬支原體肺炎基因組DNA分別稀釋至0.4×10-1、0.4×10-2、0.4×10-3、0.4×10-4、0.4×10-5ng/μL，再加入LAMP檢測體系中。配完檢測體系后，在檢測管的管蓋上滴加2 uL顯色液，小心蓋好反應管蓋，63℃運行60 min。反應結(jié)束后，反應管顛倒混勻，肉眼判讀結(jié)果。熒光溫度檢測顯示，DNA模板量的下限達0.4×10-4ng/μL時，可見目的的條帶的顯著擴增（圖2A）；DNA模板濃度等于或高于0.4×10-4ng/μL時，反應液顯天藍色，DNA模板濃度為0.4×10-5ng/μL及空白對照反應液均呈紫色（圖2B）。

圖2 豬肺炎支原體LAMP檢測法的靈敏度Fig.2 The sensitivity test of LAMP for detecting Mycoplasma hyopneumoniae

2.3 可視化豬肺炎支原體LAMP檢測方法的特異性配置含引物P1體系的LAMP反應管，除加入豬支原體肺炎核酸外，其余對照管分別加入PRRSV、PPV、PRV、PCV2、TGEV等病毒的核酸；并配完檢測體系后，在檢測管的管蓋上滴加2 uL顯色液（SybrGreen），小心蓋好反應管蓋，63℃運行60 min，反應結(jié)束后，反應管顛倒混勻，肉眼判讀結(jié)果。結(jié)果顯示，熒光強度檢測顯示，除豬肺炎支原體核酸管外，其余反應管核酸未擴增（圖3A）；除含有豬肺炎支原體核酸檢測管的反應液顯天藍色外，其余病毒反應液均呈紫色（圖3B）。

圖3 可視化豬肺炎支原體LAMP檢測方法的特異性Fig.3 The speci fi city of visible LAMP for detecting Mycoplasma hyopneumoniae

2.4 豬肺炎支原體LAMP 檢測方法的重復性、穩(wěn)定性和實際樣品檢測以不同批次提取的豬肺炎支原體核酸為模板進行5 次LAMP，分析方法的重復性；分別以不同批次水、Mg2+、Betaine、dNTP和酶為試劑，不同恒溫設(shè)備，在不同時間和實驗場所分別進行LAMP檢測，分析該方法的重復性和穩(wěn)定性。結(jié)果表明，建立的豬肺炎支原體LAMP 方法具有良好的重復性和穩(wěn)定性。將不同來源的8份豬肺炎支原體臨床組織樣本，分別采用PCR方法和本研究建立該LAMP方法進行檢測，其檢測結(jié)果一致。

3 討論

在我國，地方豬種比引入豬種更易感染豬肺炎支原體。豬肺炎支原體經(jīng)常和PRRSV、PCV2等病毒混合感染，造成重大的經(jīng)濟損失[6]。帶菌豬是本病的主要傳染源，病原體經(jīng)氣霧或與病豬的呼吸道分泌物直接接觸傳播，其經(jīng)母豬傳給仔豬使本病在豬群中持久存在，易感豬與帶菌豬接觸后，潛伏期為10 d或更長時間。由于豬肺炎支原體是通過氣霧或直接接觸傳播，一旦感染較難清除，同時豬群的感染程度與豬場的管理水平、季節(jié)、通風條件和群體密度有很大的關(guān)系[7]。在豬只感染的早期檢出豬肺炎支原體，對控制其傳播、減少損失具有重要的意義。本研究在分析豬肺炎支原體保守基因序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計和比較了多套不同LAMP引物檢測體系，從中篩選出了一組較理想的引物，建立了豬肺炎支原體LAMP檢測方法，并檢測了該方法的特異性和敏感性，證實了本研究建立的LAMP檢測方法具有良好的敏感性，同時該方法特異性好，不與PRRSV、PPV、PRV、PCV2、TGEV等病毒核酸發(fā)生交差反應，可用于豬肺炎支原體與上述病原的鑒別診斷。在建立的常規(guī)LAMP檢測方法的基礎(chǔ)上，本研究在封密反應管前滴加顯色液于反應管蓋上，在溫浴反應結(jié)束后，再顛倒反應管，讓顯色液與LAMP產(chǎn)物充分混合，提高了檢測結(jié)果的可視化，增強了肉眼判定的準確性，同時在不打開反應管的條件下進行染色，避免了擴增產(chǎn)物氣溶膠污染檢測環(huán)境的可能性。目前，PCR是檢測豬肺炎支原體的主要方法，該方法具有敏感度高，操作簡便的特點，但需要在配備有設(shè)備的專業(yè)化實驗室內(nèi)完成[8,9]。本研究建立的可視化LAMP檢測方法，除普通離心機和水浴鍋外，幾乎不需要其他設(shè)備，其檢測的敏感性和可靠性不低于傳統(tǒng)PCR方法，非常適合應用于豬場等條件簡陋的一線實驗室早期感染的監(jiān)控；對于出入境口岸，該方法可應用于貨物查驗現(xiàn)場動物源性產(chǎn)品中豬肺炎支原體的快速監(jiān)測，有助于提高陽性樣品的檢出率。

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ESTABLISHMENT OF VISIBLE LAMP METHODS FOR MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE

XIONG Wei1, WANG Yan1, WEI Xiao-feng2, Li Chun-yang1, ZHANG Qiang1, HUANG Zhong-rong1,HU Jian-hua2, LI Jian1
(1.Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shanghai 200135, China; 2.Shanghai Laboratory Animal Research center,Shanghai 201203, China)

S852.62

A

1674-6422（2017）04-0029-05

2012-02-23

上海市科委科研項目（14140900700）

熊煒，男，博士，研究員，從事病毒檢測和分子生物學研究

王艷，E-mail：wang_yan@shciq.gov.cn