劉 瑩

脂聯(lián)素對腎性高血壓小鼠心臟的影響

劉 瑩*

目的研究脂聯(lián)素對腎性高血壓小鼠心肌炎癥、纖維化與心臟功能的影響，并探討其作用機制。方法選擇脂聯(lián)素基因敲除純合子小鼠60只(A組)，野生型小鼠120只(平均分為2組，B組60例，C組60例)，分別制作腎血管性高血壓模型(A1、B1、C1)與假手術(shù)模型(對照組，A2、B2、C2)，其中C組接受外源性脂聯(lián)素干預。免疫組織化學染色方法(SP法)檢測心肌組織切片中性粒細胞浸潤數(shù)量，天狼星紅(VG)染色法檢測心肌膠原沉積纖維化程度，Western blot法檢測心肌組織中炎癥與致纖維化因子AngⅡ、IL-6、TNF-α、TGF-β水平，ELISA方法檢測各組小鼠BNP，觀察體外培養(yǎng)心肌細胞在脂聯(lián)素、AngⅡ干預下的凋亡指數(shù)。結(jié)果腎性高血壓模型組的BNP、心肌中性粒細胞數(shù)、心肌膠原及AngⅡ、IL-6、TNF-α、TGF-β水平高于假手術(shù)對照組，且A1組高于B1組，B1組高于B2組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。AngⅡ干預組心肌細胞凋亡指數(shù)高于空白對照組、脂聯(lián)素干預組及共同干預組(P<0.01)。結(jié)論脂聯(lián)素可以通過抗炎癥、抗纖維化、抗細胞凋亡的途徑保護腎性高血壓小鼠的心肌結(jié)構(gòu)與心功能。

脂聯(lián)素；腎性高血壓；炎癥； 纖維化； 凋亡

0 引言

心肌纖維化和心功能異常是高血壓心肌病的兩種重要表現(xiàn)，纖維化主要表現(xiàn)為心肌間質(zhì)中膠原合成和降解比例失調(diào)，沉積增多，排列紊亂，而炎癥反應是纖維化的最重要前提[1]。目前，炎癥在高血壓心肌病中的作用逐漸受到重視，在自發(fā)性高血壓大鼠中可以觀察到炎癥反應參與心肌纖維化及血管重構(gòu)的全過程。脂聯(lián)素是近年發(fā)現(xiàn)的由分化的脂肪細胞分泌的一種特異性蛋白，在細胞葡萄糖和脂肪酸等能量代謝過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，并參與細胞增殖肥大和免疫炎癥功能的調(diào)控[2]。脂聯(lián)素在血漿中含量豐富，其血漿濃度范圍為5～30 μg/mL，約占總血漿蛋白的0.01%。已有研究發(fā)現(xiàn)，在C反應蛋白(CRP)升高的人群中，血漿脂聯(lián)素水平降低，而且低脂聯(lián)素血癥與高CRP血癥存在負相關(guān)，也有研究報道了血漿脂聯(lián)素水平與原發(fā)性高血壓相關(guān)聯(lián)[3]，表明脂聯(lián)素在炎癥反應及高血壓的病理過程中表現(xiàn)活躍。然而，脂聯(lián)素究竟是加重炎癥與纖維化的進程，還是發(fā)揮抗炎癥與纖維化的作用，是通過哪些途徑完成此作用的機制，尚不清楚。因此，本研究擬采用脂聯(lián)素基因敲除小鼠的腎性高血壓模型，以及在脂聯(lián)素干預下培養(yǎng)的小鼠心肌細胞為研究對象，從體內(nèi)、體外兩個層面，明確脂聯(lián)素對腎性高血壓心肌炎癥、纖維化與心臟功能的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 脂聯(lián)素基因敲除純合子小鼠(Adiponectin-/-) 購于上海南方模式生物研究中心，小鼠心肌細胞株購于上海中喬新舟生物有限公司，兔抗小鼠中性粒細胞ANCA抗體購自博士德生物技術(shù)有限公司，檢測AngⅡ、IL-6、IL-1β、TNF-α、TGF-β水平的抗體購于Sigma公司，原位末端標記(TUNEL)試劑盒(Roche公司)，脂聯(lián)素與AngⅡ購于Santa Cruz公司，小鼠BNP檢測的ELISA試劑盒購于美國ADR公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及腎性高血壓模型的建立 60只8周齡脂聯(lián)素基因敲除純合子雄性小鼠(Adiponectin-/-)列為A組；野生型小鼠共120只，分為B組、C組，每組60只。A、B、C組小鼠各組均再隨機選30只,共組成6組,即A1、A2、B1、B2、C1、C2組，每組30只。其中，A1、B1、C1組小鼠采用二腎一夾(2K1C)經(jīng)典造模法，復制腎血管性高血壓CKD鼠模型。用3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，行腹正中切口切開腹壁，游離左腎動脈并用內(nèi)徑為0.2 mm銀夾鉗夾，使左腎動脈部分狹窄，右側(cè)腎動脈不觸及。A2、B2、C2均為假手術(shù)組(對照組)，方法相同，但不安置銀夾。術(shù)后每周測血壓3次，凡術(shù)后4周尾動脈收縮壓高于20 kPa者確定為高血壓形成。C1、C2組小鼠在腎性高血壓模型制作成功后，腹腔注射麻醉，在肩胛骨皮下埋藏裝有Adiponectin [Sigma，釋放速度24 g/(kg·h)微滲泵2MIA型，美國Alza公司]。以上各組均取全部動物30只，2周后斷頭處死，留取靜脈血清與心臟標本檢測。

1.2.2 免疫組織化學染色方法(SP法)檢測心肌組織切片中性粒細胞 取石蠟切片常規(guī)脫蠟，3%H2O2處理20 min，封閉內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗滌，微波處理20 min，再加10%正常羊血清，置室溫20 min后加第一抗體(濃縮型兔抗小鼠中性粒細胞ANCA抗體，購自博士德生物技術(shù)有限公司)，工作濃度為1∶100，置室溫2 h并于4 ℃過夜，PBS洗滌，加生物素標記羊抗兔IgG室溫20 min，PBS洗后加辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液室溫20 min，PBS洗滌，DAB顯色液顯色，蘇木素復染。同時磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。免疫組織化學圖像分析經(jīng)標準灰度校正后隨機取5個視野(×200倍)，測定陽性細胞的吸光度及面積，用 HPIAS-2000型圖像分析軟件對切片染色效果進行分析。每個標本隨機選取 5 個視野，測定平均光密度值，均值作為標本測定值。

1.2.3 膠原形態(tài)定性及定量分析 取左室中段橫截面心肌組織，按常規(guī)固定，制片后行膠原特異性染色-天狼星紅(VG)染色。在VG 染色下,心肌細胞、紅細胞呈黃色,膠原呈紅色。采用HPIAS-2000型圖像分析系統(tǒng)，通過灰度調(diào)節(jié)來區(qū)別膠原與非膠原測量心肌膠原容積分數(shù)(Collagen volume fraction，CVF)。計算方法：CVF=膠原面積/總面積，其中膠原面積不包括血管周圍膠原面積。隨機分析5個視野，取其均值作為該心臟的CVF。

1.2.4 Western blot方法檢測心肌組織中AngⅡ、IL-6、TNF-α、TGF-β水平 基本步驟：提取心肌組織總蛋白，蛋白 SDS-PAGE 電泳，蛋白質(zhì)PVDF電轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入相應的一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫下孵育2 h，ECL 顯影。采用生物凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)(Quantity One 4.62)軟件對目的條帶進行半定量灰度值分析。

1.2.5 心肌細胞凋亡檢測 體外培養(yǎng)的心肌細胞分為4組，A組為空白對照組，B組為脂聯(lián)素干預組(脂聯(lián)素30 mg/L)，C組為AngⅡ干預組(AngⅡ10 mol/L)，D組為脂聯(lián)素與AngⅡ共同干預組。體外采用TDT介導的dUTP缺口末端標記法(TUNEL)對凋亡細胞進行原位檢測，主要流程：取心肌細胞爬片,以4%甲醛/PBS 于4 ℃冰箱中固定25 min,再浸入0.2% Triton-X-100/PBS 液中,使細胞通透性增強,加用熒光素FITC 標記的核苷酸和脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TDT)混合液,于37 ℃作用60 min。在熒光顯微鏡下觀察,以核陽性作為結(jié)果判定的標準。與正常細胞比較,凋亡細胞體積變小,胞核濃縮,胞質(zhì)嗜酸性增強，TUNEL陽性信號為黃綠色或黃色熒光,位于胞核,呈小圓形、環(huán)形或新月形，未凋亡的細胞核呈深藍色。用計算機圖像分析系統(tǒng)分析，每組隨機取5張細胞爬片，每張爬片隨機取10個視野，至少計數(shù)1 000個細胞，分別計數(shù)每個視野的凋亡心肌細胞數(shù)和心肌細胞總數(shù)，計算凋亡指數(shù)=(凋亡細胞數(shù)/心肌細胞總數(shù))×100%。

1.2.6 ELISA方法檢測各組小鼠的BNP 所有研究小鼠斷頭取血離心后吸取上層血漿,-80 ℃保存待測。用ELISA 競爭性酶免疫分析法測定BNP濃度,試劑盒由美國ADR 公司生產(chǎn),用Bio-Rad Model 550酶標儀測定。

2 結(jié)果

2.1 各組BNP比較 腎性高血壓模型組的BNP高于假手術(shù)對照組，且A1組高于B1組，B1組高于C1組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；A2、B2、C2組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠 BNP、中性粒細胞ANCA表達陽性單位值、CVF

2.2 各組心肌中性粒細胞數(shù)量比較 腎性高血壓模型組的心肌中性粒細胞ANCA表達陽性單位值高于假手術(shù)對照組，且A1組高于B1組，B1組高于C1組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，但A2、B2、C2組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

2.3 各組心肌膠原定量比較 腎性高血壓模型組的心肌膠原容積分數(shù)(CVF)高于假手術(shù)對照組，且A1組高于B1組，B1組高于C1組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；A2組CVF高于B2、C2組(P<0.05)。見表1。

2.4 各組心肌細胞凋亡指數(shù)比較 AngⅡ干預組的心肌細胞凋亡指數(shù)高于空白對照組、脂聯(lián)素干預組及共同干預組(P<0.05)。見表2。

表2 各組心肌細胞凋亡指數(shù)的變化

2.5 各組心肌各種炎癥介子、纖維化因子半定量比較 腎性高血壓模型組AngⅡ、IL-6、TNF-α、TGF-β水平均高于假手術(shù)對照組，且A1組高于B1組，B1組高于C1組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；A2組上述指標高于B2、C2組，B2組的TGF-β水平高于C2組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

3 討論

國際上普通人群慢性腎臟病(CKD)的患病率為10%～16%，中國城市的CKD患病率為10.3%～12.1%，CKD患者絕大多數(shù)合并腎病性高血壓，高血壓又再次加重腎臟與心臟的損傷，形成惡性循環(huán)[4]。慢性心肌病(CVD)是腎病性高血壓發(fā)展的必然階段，可見腎病性高血壓是重大的公共衛(wèi)生問題，是對公共衛(wèi)生資源的巨大挑戰(zhàn)，如何防治腎病性高血壓造成的心肌損傷意義重大。

心肌纖維化是由于細胞外基質(zhì)尤其是膠原纖維增加而引起的心肌損害的病理過程，是心功能下降的直接因素[5]。心肌纖維化多發(fā)生在左心室，導致心臟順應性降低，最終導致心力衰竭。國外研究發(fā)現(xiàn)，在高血壓大鼠心肌的巨噬細胞、CD4 T淋巴細胞、CD8 T淋巴細胞和MHC-Ⅱ表達細胞與成纖維細胞共存，分布密度高于對照組[6]，因此，推測中性粒細胞、TNF-α、IL-6、TGF-β、AngⅡ等具有強烈導致炎癥與纖維化的細胞與細胞因子在腎病性高血壓心肌中表達明顯。

表3 各組心肌中AngⅡ、IL-6、TNF-α、TGF-β水平比較

IL-6是淋巴細胞分泌的具有誘導免疫與炎癥反應的細胞因子，可能通過激活核因子，啟動促炎癥與纖維化基因的表達。TNF-a 可以促進膠原的合成和成纖維細胞前膠原mRNA的轉(zhuǎn)錄，通過增加MMP活性和抑制TIMP而促進組織纖維化，TNF-α也可以促進成纖維細胞AT1表達上調(diào)，而且加重AngⅡ引起的組織纖維化[7]。TGF-β能夠促進膠原的合成，通過增加成纖維細胞膠原的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定前膠原mRNA，使膠原合成增多，是目前發(fā)現(xiàn)的最強大的致纖維化因子。AngⅡ不僅具有強烈的縮血管、升高動脈血壓的作用，而且通過其受體在影響細胞生長、增殖、凋亡和調(diào)節(jié)炎癥反應、組織纖維化、凝血機制等方面起著重要的病理生理作用，特別是在高血壓左室重構(gòu)的進展中起重要作用[8]。

BNP是一種由32個氨基酸殘基構(gòu)成的多肽類激素，其氨基端第7 位和第23 位氨基酸殘基為BNP 的功能域。BNP主要來源于心室，其含量與心室的壓力、呼吸困難的程度、激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)的情況相關(guān)[9]。心室的體積和壓力增高會導致血漿內(nèi)BNP的升高，而其升高的程度與心室擴張和壓力超負荷的程度呈正比，BNP 水平越高，表示患者心衰程度越嚴重。

脂聯(lián)素是最近發(fā)現(xiàn)的一種由脂肪組織分泌的膠原樣蛋白質(zhì)，在細胞葡萄糖和脂肪酸等能量代謝過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，并參與細胞增殖肥大和免疫功能的調(diào)控。脂聯(lián)素在血漿中含量豐富，已有研究顯示，脂聯(lián)素具有抗糖尿病、抗動脈粥樣硬化、抗炎等作用,具體作用機制尚不清楚，特別是對慢性腎病腎性高血壓患者發(fā)展成心血管疾病的干預作用，國內(nèi)外報道很少。本研究通過體內(nèi)與體外兩個途徑，證實了脂聯(lián)素通過減少中性粒細胞對心肌浸潤，降低TNF-α、IL-6、TGF-β、AngⅡ等致心肌炎癥與纖維化因子水平的途徑，發(fā)揮減輕心肌炎癥與纖維化的作用；同時可顯著降低心肌細胞凋亡，防止心室重構(gòu)，保護心功能，是保護心肌的新的治療手段。脂聯(lián)素來源廣泛，價格低廉，毒性低，易于推廣[10]，脂聯(lián)素心臟保護作用確切、明顯，預計對改善CKD、CVD患者生存預后，減輕政府巨大的衛(wèi)生開支，都有重要的社會效益與經(jīng)濟效益。

[1] Marsche G,Zelzer S,Meinitzer A,et al.Adiponectin predicts HDL cholesterol efflux capacity in adults irrespective of body mass index and fat distribution[J].J Clin Endocrinol Metab,2017.[Epub ahead of print]

[2] Price JC,Wang R,Seaberg EC,et al.The association of inflammatory markers with nonalcoholic fatty liver disease differs by human immunodeficiency virus serostatus[J].Open Forum Infect Dis,2017,4(3):ofx153.

[3] Osei K,Gaillard T.Disparities in Cardiovascular disease and type 2 diabetes risk factors in blacks and whites:dissecting racial paradox of metabolic syndrome[J].Front Endocrinol (Lausanne),2017,8:204.

[4] Santos CC,Diniz TA,Inoue DS,et al.Influence to high-intensity intermittent and moderate-intensity continuous exercise on indices of cardio-inflammatory health in men[J].J Exerc Rehabil,2016,12(6):618-623.

[5] Jung JH,Ahn SV,Song JM,et al.Obesity as a risk factor for prostatic enlargement:a retrospective cohort study in Korea[J].Int Neurourol J,2016,20(4):321-328.

[6] Roy B,Curtis ME,Fears LS,et al.Molecular mechanisms of obesity-induced osteoporosis and muscle atrophy[J].Front Physiol,2016,7:439.

[7] Huang CJ,Kwok CF,Chou CH,et al.The effect of exercise on lipid profiles and inflammatory markers in lean male adolescents:a prospective interventional study[J].J Investig Med,2015,63(1):29-34.

[9] Koleva DI,Orbetzova MM,Atanassova PK.Adipose tissue hormones and appetite and body weight regulators in insulin resistance[J].Folia Med (Plovdiv),2013,55(1):25-32.

[10]Lee Y,Kim BK,Lim YH,et al.The relationship between adiponectin and left ventricular mass index varies with the risk of left ventricular hypertrophy[J].PLoS One,2013,8(7):e70246.

Effectsofadiponectinontheheartofmicewithrenovascularhypertension

LIU Ying*

(Department of Cardiology,the People′s Hospital of Liaoning Province,Shenyang 110016,China)

ObjectiveTo investigate the effects of adiponectin on myocarditis,fibrosis and cardiac function of mice with renal hypertension and explore its mechanism.MethodsAdiponectin knockout homozygous mice (group A,n=60) and wild-type mice (n=120,60 mice in group B,60 mice in group C) were chosen to establish renovascular hypertension models (group A1,group B1 and group C1) and sham operated models(control group:group A2,group B2 and group C2),and mice in group C were treated with exogenous adiponectin.Immunohistochemical staining (SP) was used to detect the number of neutrophil infiltration in myocardial tissue sections.The degree of myocardial collagen deposition and fibrosis was detected by Sirius red (VG) staining.The levels of AngⅡ,IL-6,TNF-α and TGF-β in myocardial tissue were detected by Western blot,and the BNP was detected by ELISA.The apoptotic index of cultured cardiac myocytes under the influence of adiponectin and AngⅡ was measured.ResultsThe number of myocardial neutrophil,quantity of myocardial collagen and the levels of serum BNP,AngⅡ,IL-6,TNF-α and TGF-β in renal hypertension model group were higher than those of control group (P<0.05 orP<0.01),and the sequence from high to low was group A1,group B1 and group C1 (P<0.05 orP<0.01).The apoptosis index of myocardial cell in AngⅡ intervention group was higher than that of control group,adiponectin intervention group and combined intervention group (P<0.01).ConclusionAdiponectin can protect the cardiac structure and function of mice with renal hypertension by activities of anti-inflammation,anti-fibrosis and anti-apoptosis.

Adiponectin;Renal hypertension;Inflammation;Fibrosis;Apoptosis

2016-12-09

遼寧省人民醫(yī)院心內(nèi)科,沈陽 110016

沈陽市科技局人口與健康科技攻關(guān)專項(2015)

*

10.14053/j.cnki.ppcr.201710005