隋春紅，李校娜，徐亞維，紀朋艷，王程※

（1吉林醫(yī)藥學院藥學院，吉林132013；2吉林農(nóng)業(yè)科技學院生物工程學院，吉林132101）

硒化糯米蛋白抗氧化活性的研究

隋春紅1，李校娜1，徐亞維2，紀朋艷1，王程1※

（1吉林醫(yī)藥學院藥學院，吉林132013；2吉林農(nóng)業(yè)科技學院生物工程學院，吉林132101）

采用化學修飾法將堿提酸沉法分離獲得的糯米蛋白制備成硒化糯米蛋白（Se-GP）并鑒定其抗氧化活性。研究表明制備的多種Se-GP均具有一定的谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）活力，其中Se-GP14的GPX活力最高，約為51.49 U/g。各種Se-GP均可發(fā)揮清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）、羥自由基（OH·）和超氧陰離子（）自由基的作用，并可有效維持抗壞血酸/二價鐵離子（Vc/Fe2+）誘導損傷的牛心肌線粒體的形態(tài)和正常功能，抑制損傷線粒體的膨脹，降低線粒體中脂質過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）的產(chǎn)生。

糯米蛋白；硒；抗氧化活性

硒（selenium，Se）是一種必需微量元素，人體缺少Se元素可能會出現(xiàn)大骨節(jié)病、克山病、甲狀腺疾病等[1]，研究發(fā)現(xiàn)Se在預防和治療癌癥、心血管系統(tǒng)疾病、肝病、高血壓、糖尿病等多種疾病過程中發(fā)揮著重要的作用[2]。人主要從植物硒蛋白中攝取Se，其形式主要以硒代蛋氨酸（selenomethionine，Se-Met）和硒代半胱氨酸（selenocysteine，Se-Cys）存在[3-4]。目前，富硒作物已經(jīng)在我國大力開發(fā)種植，但由于我國大部分地區(qū)土壤中Se含量并不豐富，僅靠富硒作物的生產(chǎn)很難滿足人們的補Se需求，因此，大量人工制備植物源硒蛋白成為研究的焦點。糯米是稻米的一種，也是人類主要糧食之一。糯米蛋白（glutinous protein，GP）的氨基酸平衡特性好，營養(yǎng)價值高，主要是由球蛋白、清蛋白、谷蛋白和醇溶性蛋白四種蛋白組成，是很好的植物蛋白資源[5]。本研究嘗試以糯米為原料，采用堿提酸沉法提取GP并利用凝膠層析法分離各組分，再采用化學硒化法制備Se-GP并檢測其抗氧化活性，以彌補栽培高硒糯米的不足，為合理開發(fā)植物蛋白質資源提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

東北有機糯米（蛋白含量10.2%）購自吉林市永鵬農(nóng)副產(chǎn)品開發(fā)有限公司。新鮮牛心于市場購買。透析袋3500購自美國Spectium公司；考馬斯亮藍R-250、十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒、四甲基二乙胺（TEMED）購自上海碧云天生物技術有限公司；Sephadex G-25購自瑞典Pharmacia公司；牛血清白蛋白（BSA）購自美國Sigma公司。苯甲基磺酰氟（PMSF）、半胱氨酸、硒粉、還原型谷胱甘肽（GSH）、巰基乙醇、二硫二硝基苯甲酸（DTNB）、甘氨酸、鄰苯三酚、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）、GSH還原酶購自美國Sigma公司；硒標準液（國家標準物質研究中心）；硫代巴比妥酸（TBA）、鄰苯三酚、二硫二硝基苯甲酸（DTNB）、抗壞血酸（VC）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、氯化硝基四氮唑藍（NBT）、巰基乙醇、二苯基三硝基苯肼自由基（DPPH·）、依布硒（Ebselen）、三氯乙酸（TCA）購自美國Sigma公司；Na2HPO4、水楊酸、NaH2PO4、NaBH4、FeSO4、H2O2購自國藥集團化學試劑有限公司；蛋白分子量Marker購自美國Transgen公司。

AFS-230E型雙道原子熒光光度計（北京海光儀器公司）；FD-1C-50型冷凍干燥機（上海比朗儀器有限公司）；LDI-1700基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀（美國Linear Scientific公司）；HD-4核酸蛋白檢測儀（上海滬西分析儀器廠）；UV-2550紫外分光光度計、AA-6300型原子吸收分光光度計、Se空心陰極燈（日本島津公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 堿提酸沉法提取糯米蛋白將糯米在60℃下烘干至恒重，研磨成粉后過80目篩。以料液比1 g/10 mL往糯米粉中加入蒸餾水，并加1 mol/L NaOH堿液調節(jié)pH=10，在45℃恒溫水浴中堿解6 h。將混合物在4000 r/min條件下，離心10 min，然后取上清液置于燒杯中，滴加1 mol/L稀鹽酸調節(jié)pH=4.0（蛋白質等電點），在4℃冰箱中靜置24 h使蛋白質沉淀，洗滌沉淀并冷凍干燥后獲得GP。用Lowry法[6]測定GP粗蛋白質含量計算提取率，蛋白質的提取率（%）=提取GP的質量（g）/糯米原料中蛋白質的質量（g）×100%。

1.2.2 GP組分的分離與分子量測定使用Suphedex G-25凝膠層析分離GP各組分，凝膠柱100 cm×2.6 cm，用pH=7.5，20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗脫。將GPt提取過程中過濾后的上清液pH值調至7.5，取3 mL上樣，洗脫流速0.8 mL/min，280 nm波長下檢測流出液，將吸光度值大于0.2的組分收集起來，用蒸餾水透析3次，經(jīng)脫鹽后的GP各組分凍干備用。另收集峰尖的蛋白溶液，進行SDS-PAGE（5%濃縮膠、15%分離膠）鑒定[7]和MALDI-TOF-MS測定GP分子量[8]。

1.2.3 GP的化學修飾按照Klaymen方法，在氮氣的保護下制備1 mol/L NaHSe[9]。用50 mmol/L PBS（pH=7.4）溶解純化GP各組分，制備濃度0.25 g/L GP溶液，每1mL GP溶液加入12.5μL PMSF（20g/L乙腈溶液），在密閉容器中25℃溫水浴3 h，隨后通入氮氣20 min，達到排除體系內氧氣的目的，加入15μLNaHSe溶液，在37℃氮氣保護下反應40 h，反應完成后將溶液置于空氣中充分氧化，12000 r/min離心20 min除去硒，經(jīng)SephadexG-25凝膠層析柱除鹽后凍干，即得Se-GP。

1.2.4 GP和Se-GP的硒含量和GPX活力分別采用氫化物原子熒光光譜法檢測[10]和Wilson的酶偶聯(lián)方法測定GP、Se-GP的硒含量和谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）活力[11]。以150mmol/L PBS（pH=7.4）作為空白對照，在340nm處測定NADPH的吸光度值變化。酶活力的定義為1 min內氧化1μmol/L NADPH所需的酶量為1U，比活力的單位為U/g。

1.2.5 Se-GP清除自由基力的測定配制Ebselen樣品（2.5，5.0，7.5，10μmol/L）[12]和不同濃度梯度的硒化植物蛋白樣品（25，50，75，100 mg/L）。以Ebselen為對照，分別測定Se-GP對DPPH·、羥自由基（hydroxyl radical，OH·）和超氧陰離子（superoxideanion radical，O-2·）的清除率[13]。

1.2.6 Se-GP對線粒體損傷保護作用的測定采用差速離心法制備牛心線粒體[14]，以少量提取緩沖液懸浮后置于0℃保存，BSA為標準，考馬斯亮藍法測定牛心線粒體濃度[15]。用125 mmol/L KCl、1 mmol/L MgCl2、5 mmol/L谷氨酸鹽、1μmol/L GSH的測定緩沖液（pH=7.4）配制終濃度為0.5 g/L的線粒體溶液。37℃保溫30 min后，加入終濃度為12.5μmol/L FeSO4和0.5 mmol/L VC，即為線粒體損傷模型。模型建立后立即加入各待測樣品（各組分硒化植物蛋白樣品的終濃度為50 mg/L，Ebselen樣品的終濃度為10μmol/L），在37℃下振蕩并記錄時間。分別以未加入樣品的損傷線粒體為對照和未進行模型損傷的正常線粒體，在0，2，4，6，8，10，15，20 min時間點測定線粒體膨脹度。在520 nm波長下，通過測定溶液吸光度值的變化來判斷線粒體的膨脹度，線粒體膨脹時溶液渾濁度增加，A520值下降，即線粒體膨脹度與A520值成反比[16]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過3次獨立實驗測定所有數(shù)據(jù)，并以平均值±標準差（x±SD）表示。數(shù)據(jù)及數(shù)據(jù)間差異采用SPSS 13.0軟件進行分析，P＜0.05認為具有統(tǒng)計學差異。

2 結果與討論

2.1 GP提取和鑒定

采用堿提酸沉法可從100 g糯米中提取6.52± 0.31 g GP（糯米原料的蛋白含量為10.2%，），提取率約為63.9%。經(jīng)Suphedex G-25凝膠層析分離收集2個主要蛋白峰的GP成分（圖1）。收集各峰尖蛋白與粗提GP同時進行SDS-PAGE分析（圖2），結果發(fā)現(xiàn)堿提酸沉法提取的GP分子量偏?。赡転榍宓鞍谆蚯虻鞍祝?，適于進一步的化學修飾，而不適于化學硒化GP（分子量較大的谷蛋白）在酸堿條件下更易變性沉淀而被去除。再對GP各組分所含主要蛋白的分子量采用MALDI-TOFMS進行分析測定（圖3），結果檢測到2種主要蛋白并根據(jù)測定的分子量分別命名為GP17和GP14。

圖1 糯米蛋白的Suphedex G-25凝膠色譜洗脫曲線

圖2 糯米蛋白的SDS-PAGE分析

圖3 糯米蛋白的MALDI-TOF-MS分析

2.2 GP和Se-GP的硒含量和GPX活力見表1。

表1 各種糯米蛋白和硒化糯米蛋白的硒含量和抗氧化酶活性

實驗研究中常以含硒酶GPX的活力來衡量硒蛋白抗氧活力。各組分GP和Se-GP的Se含量和GPX活力見表1。結果表明提取的GP的GPX活力很低，而經(jīng)過硒化修飾的Se-GP表現(xiàn)出較高的GPX活力，且Se-GP17的GPX活力比Se-GP14略高。這說明Se的存在，可以使蛋白質表現(xiàn)出GPX活力，但活力的大小可能與Se的含量、蛋白質分子量以及蛋白質的空間結構等諸多因素有關[17]。

2.3 GP和Se-GP對自由基的清除

分別檢測Se-GP17、Se-GP14、GP17和GP14對DPPH·、OH·、·的清除作用。實驗結果表明：以Ebselen為對照，Se-GP17和Se-GP14對DPPH·的清除作用較對應的GP17和GP14分別增強了3.1和2.4倍（如圖4）；對HO·的清除作用較對應的GP17和GP14分別增強了3.9和1.1倍（如圖5）；對·的清除作用較對應的GP增強了2.7～3.2倍（如圖6）。還可以看出Se-GP17對DPPH·、OH·的清除率與對照Ebselen相當，而對·的清除效果優(yōu)于對照Ebselen。

圖4 GP和Se-GP對DPPH·的清除作用

圖5 GP和Se-GP對OH·的清除作用

圖6 GP和Se-GP對·的清除作用

2.4 硒化糯米蛋白（Se-GP）對線粒體膨脹的抑制作用

建立VC/Fe2+誘導牛心線粒體損傷模型被并檢測Se-GP對損傷線粒體的保護作用，深入的研究Se-GP的抗氧化活性。當線粒體受到損傷時，線粒體的形態(tài)結構和功能被破壞。結果顯示，Se-GP對損傷線粒體膨脹的抑制作用明顯高于GP，對損傷線粒體膨脹具有一定的抑制作用，其中Se-GP17的作用最強（圖7）。GP和Se-GP對損傷線粒體中MDA也產(chǎn)生抑制作用，線粒體膜受損后可以產(chǎn)生MDA等脂質過氧化產(chǎn)物，MDA含量異常增加會導致細胞損傷。結果顯示，GP和Se-GP對損傷線粒體產(chǎn)生MDA均有一定的抑制作用，而且Se-GP對損傷線粒體中MDA產(chǎn)生的抑制作用明顯高于GP，其中Se-GP17的作用比較強（圖8）?？赏茢嗷瘜W修飾后的Se-GP，提高了線粒體抗氧化能力，終止自由基鏈式反應，達到保護線粒體損傷的目的。

圖7 GP和Se-GP對線粒體膨脹的抑制作用

圖8 GP和Se-GP對損傷線粒體中MDA含量的抑制作用

3 結論

采用堿提酸沉法提取出GP，并用化學修飾法將經(jīng)Suphedex G-25凝膠層析分離的GP17和GP14蛋白分別制備成Se-GP17和Se-GP14。且這套工藝操作簡單、作用條件溫和、具有良好的應用價值。實驗結果顯示制備的各種Se-GP均具有清除DPPH·、OH·和·自由基的作用，并具有一定的GPX活性。同時通Vc/Fe2+誘導牛心線粒體損傷模型的實驗顯示，各種Se-GP均能有效地降低氧化損傷所導致的線粒體膨脹率，減弱脂質過氧化反應，維持線粒體形態(tài)。實驗顯示Se-GP17的GPX活力最高，清除自由基的能力最強，保護損傷線粒體的效果最佳。

[1] Rayman MP.The important of selenium to human health[J]. Lancet，2000，356（9225）：233-274.

[2] Zhao P，Wang Y，Zhang Y，Guo T，Zhang Z，Zhang WJ，Zhang XG，Ashraf MA.The extraction of different proteins in selenium enriched peanuts and their antioxidant properties[J].Saudi J Biol Sci. 2016，23（3）：353-357.

[3] Carey AM，Lombi E，Donner E，et al.A review of recent developments in the speciation and location of arsenic and selenium in rice grain[J].Anal Bioanal Chem.2012，402（10）：3275-3286.

[4] Terry N，Zayed AM，De Souza MP，et al.Selenium in higher plants[J].Ann Rev Plant Biol，2000，51（1）：401-432.

[5] Sharma VK，McDonald TJ，Sohn M，et al.Biogeochemistry of selenium.A review[J].EnvChem Lett，2015，13（1）：49-58.

[6] Lowry OH，Rosebrough NJ，F(xiàn)arr AL，et al.Protein measurement with the Folin phenol reagent[J].J BiolChem，1951，193（1）：265-275.

[7] Neilson KA，George IS，Emery SJ，et al.Analysis of rice proteins using SDS-PAGE shotgun proteomics[J].Methods MolBiol，2014，1072（1）：289-302.

[8] Wang C，Shen N，Yan GL，et al.The protective effect of a metallic selenopeptide with superoxide dismutase and glutathione peroxidase activities against alcohol induced injury in hepatic L02 cells[J].Int J Pept Res Ther，2014，20（3）：307-324.

[9] Klayman DL，Griffin TS.Reaction of selenium with sodium borohydride in proticsolvents.A facile method for the introduction of selenium into organic molecules[J].J Am ChemSoc，1973，95（1）：197-199.

[10] Sanchez-Rodas D，Mellano F，Morales E，et al.A simplified method for inorganic selenium and selenoaminoacids speciation based on HPLC-TR-HG-AFS[J].Talanta，2013，106（3）：298-304.

[11] Wilson SR，Zucker PA，Huang RRC，et al.Development of synthetic compounds with glutathioneperoxidase activity[J].J Am ChemSoc，1989，111（15）：5936-5939.

[12] Azad GK，Singh V，Mandal P，et al.Ebselen induces reactive oxygen species（ROS）-mediated cytotoxicity in Saccharomyces cerevisiae with inhibition of glutamate dehydrogenase being a target[J]. FEBS Open Bio，2014（4）：77-89.

[13] 王程，王悅，隋春紅，等.硒化大米蛋白抗氧化性活性研究[J].食品工業(yè)科技，2016，37（10）：165-170.

[14] Lansman RA，Shade RO，Shapiro JF，et al.The use of restriction endonucleases to measuremitochondrial DNA sequence relatedness in natural populations.III.Techniques and potential applications[J]. MolEvol，1981，17（4）：214-226.

[15] Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding[J].Anal Bio Chem，1976，72（1-2）：248-254.

[16] Moukette BM，Pieme CA，Njimou J R，et al.In vitro antioxidant properties，freeradicalsscavengingactivitiesofextractsand polyphenol composition of a non-timber forest product used as spice：Monodoramyristica[J].Biological Research，2014，1（3）：1036-1044.

[17] Ibrahim M，Muhammad N，Naeem M，et al.In vitro evaluation of glutathione peroxidase（GPx）-like activity and antioxidant properties of an organoselenium compound[J].ToxicolIn Vitro，2015，29（5）：947-952.

Research on Selenide Glutinous Proteins and Their Antioxidant Activity

SUI Chunhong1，LI Xiaona1，XU Yawei2，JI Peng yan1，WANG Cheng1
（1.Jilin Medical University School of Pharmacy，Jilin 132013；2.Jilin Agricultural Science and Technology University School of Bioengineering，Jilin 132101）

Selenide glutinous proteins（Se-GP）were prepared via glutinous proteins obtained by through alkali extraction and acid precipitation were chemically modified，then their antioxidant activities were appraised.The results of the study showed that Se-GP had certain antioxidant activity of glutathione peroxidase（GPX），therein to，GPX activity of Se-GP14 was highest，circa 51.49 U/g.Various Se-GPs could play a scavenging role on 1，1-diphenyl-2-three nitrophenylhydrazine free radical（DPPH·），hydroxyl radical free radical（OH·）and superoxide anion free radical（O-2·）andefficiently maintain morphology and normal function of cardiac mitochondria in bovine to avoid swelling from induced damage of mitochondria by ascorbic acid/ divalent irons（Vc/Fe2+）and decrease the content of the lipid oxidation product malondialdehyde（MDA）.

glutinous protein；selenium；antioxidant activity

S511.2

A

2017-05-08

吉林省教育廳“十二五”科學技術研究項目（2015-405）；吉林市科技創(chuàng)新發(fā)展計劃項目（20166030）；吉林醫(yī)藥學院大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（2016028）

隋春紅（1977-），女，黑龍江省哈爾濱市人，副教授，研究方向：食品催化化學。

※為本文通訊作者

責任編輯：吳艷玲