郭躍平，徐廣偉，韋何雯，章銀軍，沈雪亮

（1.金華市食品藥品檢驗檢測研究院，浙江金華321000；2.浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江杭州310014）

利用咖啡豆渣酶法制備甘露低聚糖的研究

郭躍平1，徐廣偉1，韋何雯1，章銀軍2，*，沈雪亮2

（1.金華市食品藥品檢驗檢測研究院，浙江金華321000；2.浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江杭州310014）

充分利用水提綠原酸所剩的咖啡豆渣，酶法制備高附加值的產(chǎn)品甘露低聚糖（mannan-oligosaccharides，MOS），并對其成分進(jìn)行分析研究。利用市場上現(xiàn)有的兩種不同來源的β-甘露聚糖酶（來源于枯草芽孢桿菌的酶，稱為酶A；來源于黑曲霉的酶，稱為酶B）對咖啡豆渣酶解處理制備甘露低聚糖，通過單因素試驗以及正交試驗，對加酶量、酶解溫度、酶解pH值和酶解時間進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳工藝條件。利用酶A制備MOS得率為（52.76±0.11）%，利用酶B制備MOS得率為（61.01±0.12）%，測得酶A和酶B處理后的酶解液平均聚合度（DP值）分別為7.52和7.46。酶B處理的酶解液經(jīng)1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生化后進(jìn)行液相色譜（HPLC）分析，確定甘露低聚糖的組成成分為：甘露糖為42.78%，半乳糖為42.58%，阿拉伯糖14.64%。DP值為7.46符合功能性低聚糖的制備要求，分析低聚糖成分中甘露糖含量較高，符合功能性低聚糖為甘露低聚糖的要求，為利用咖啡豆渣制備高附加值產(chǎn)品提供了技術(shù)支持。

咖啡豆渣；甘露低聚糖；β-甘露聚糖酶A；β-甘露聚糖酶B；平均聚合度

甘露低聚糖又稱甘露寡聚糖、低聚甘露糖，廣泛存在于魔芋粉、瓜兒豆膠、田菁膠及多種微生物細(xì)胞壁內(nèi)，其作為雙歧桿菌增殖因子，具有甜味，所以往往被用作糖替代劑，而且對腸道保護(hù)和免疫力的提高等作用，已被廣泛地用作食品和飼料添加劑[1-5]。酶法水解魔芋、瓜爾膠、椰子、刺槐豆膠等原料制備甘露低聚糖，是現(xiàn)今生產(chǎn)常用的方法，而且研究表明不同來源的β-甘露聚糖酶對β-甘露多糖具有不同的水解能力。對于瓜膠半乳甘露聚糖，枯草桿菌K-50所產(chǎn)的β-甘露聚糖酶的水解率為5%，而源于黑曲霉的β-甘露聚糖酶水解率為12%；對于咖啡豆半乳甘露聚糖，它們的水解率分別為36%和58%[6-12]。

研究表明，魔芋中葡甘聚糖的含量在40.77%～72.84%[13]，椰子殼中甘露聚糖含量為51.8%[14]，咖啡豆渣中甘露聚糖含量為24.12%[15]。β-甘露聚糖酶酶解咖啡豆渣多糖中主要成分半乳甘露聚糖時，只對主鏈上的β-1，4-糖苷鍵進(jìn)行酶切，而對α-1，6-糖苷鍵不起作用，因此酶解產(chǎn)物是帶有D-半乳糖側(cè)鏈的小分子甘露低聚糖。柱層析法[16-17]和膜分離法均可分離得到2～10聚合度的甘露低聚糖，但膜分離法具有節(jié)能、環(huán)保、高效且保留生物活性成分等特點[18]，尤其適用于工業(yè)化大生產(chǎn)?？Х榷乖写嬖诤控S富的多糖物質(zhì)，酶法制備甘露低聚糖，在低聚糖成分分析時，由于單糖極性強(qiáng)，且結(jié)果相近和缺乏光學(xué)活性，所以人們常用柱前或柱后衍生化的方法處理水解后的多糖，來進(jìn)行色譜分離和檢測。這樣的方法具有分離選擇性好和檢測靈敏度高等優(yōu)點[19-20]。

本文以水提法提取綠咖啡豆中綠原酸后所剩的咖啡豆渣為原料，用市場上現(xiàn)有的兩種不同來源的β-甘露聚糖酶水解咖啡豆渣制備甘露低聚糖，通過單因素試驗及L9（34）正交試驗進(jìn)行條件優(yōu)化，確定甘露低聚糖制備的最佳工藝，采用膜分離法對甘露低聚糖進(jìn)行分離純化，為利用咖啡豆渣制備甘露低聚糖工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

綠咖啡豆（Coffee arabica）：由浙江天草生物科技有限公司提供；單糖標(biāo)準(zhǔn)品（L-鼠李糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-半乳糖醛酸）、標(biāo)準(zhǔn)分子量葡聚糖：Aladdin公司；咖啡豆渣：綠咖啡豆中綠原酸提取后所剩的廢渣；枯草芽孢桿菌所產(chǎn)的β-甘露聚糖酶（5 000 U/g，酶A）、黑曲霉所產(chǎn)的β-甘露聚糖酶（10 000 U/g，酶B）：湖北遠(yuǎn)成賽創(chuàng)科技有限公司；氯仿、甲醇、冰醋酸、無水硫酸鈉、三氟乙酸、鹽酸、氫氧化鈉、乙醇、十二水合磷酸氫二鈉、一水合檸檬酸、濃硫酸、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）：均為國產(chǎn)分析純；液相色譜儀、Waters1525泵、Waters2414示差檢測器、Waters2487紫外檢測器：美國Waters公司；Welch C18色譜柱：上海月旭科技股份有限公司；UV-2450紫外可見分光光度計：日本SHIMADZU公司；CT14RD高速冷凍離心機(jī)：日本日立公司；Hei-VAP旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：德國Heidolph公司。

1.2 方法

1.2.1 甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取甘露糖0.1 g，溶解于蒸餾水中，振蕩搖勻，定容于100 mL容量瓶中，配制成1 mg/mL甘露糖溶液，稀釋成 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL 等梯度濃度的甘露糖溶液6個標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別取1 mL甘露糖溶液，加1 mL蒸餾水，再加2 mL DNS緩沖液，沸水浴5 min后，定容至10 mL，振蕩搖勻，在λ=520 nm條件下，檢測不同甘露糖濃度的OD值，繪制甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 咖啡豆渣的酶解工藝

工藝流程：緩沖液中咖啡豆渣酶解→過濾→酶解液→測酶解液還原糖→酶解液水解→測總糖含量

1.2.3 單因素試驗設(shè)計

采用酶A和酶B對咖啡豆渣水解制備甘露低聚糖，通過對料液比（1 ∶50、2 ∶50、3 ∶50、4 ∶50、5 ∶50、6 ∶50 g/mL），酶解溫度（40、45、50、55、60 ℃），酶解 pH值（4、5、6、7、8），酶解時間（2、4、6、8、10 h），加 酶量（100、150、200、250、300 U/g）等條件的優(yōu)化，確定酶 A和酶B制備甘露低聚糖得率最高時的條件范圍。

1.2.4 酶A和酶B制備甘露低聚糖正交試驗

用正交試驗對加酶量、酶解溫度、酶解pH值和酶解時間等四因素進(jìn)行條件優(yōu)化，設(shè)計正交因素水平表1和表2，分別通過L9（34）正交試驗表，9組試驗，確定酶A和酶B水解咖啡豆渣制備甘露低聚糖的最佳工藝條件組合。

表1 正交試驗設(shè)計因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交試驗設(shè)計因素及水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.5 酶解液中總糖的測定及得率和平均聚合度的計算

酶法處理咖啡豆渣制備甘露低聚糖，酶解液中總糖含量的測定方法：準(zhǔn)確量取過濾后的咖啡豆渣酶解液5 mL，于20 mL具塞試管內(nèi)，加5 mL超純水和0.4 mL濃硫酸，振蕩搖勻，100℃水浴水解2 h，室溫冷卻后，用NaOH中和。將中和溶液倒入100 mL容量瓶中定容，振蕩搖勻，后取1.0 mL溶液，加1.0 mLDNS緩沖液，沸水浴5 min顯色反應(yīng)，之后迅速冷卻至室溫，加蒸餾水定容至10 mL刻度處。以空白為對照，用紫外-可見分光光度計檢測測其在520 nm下的OD值，依據(jù)甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算單位體積總糖量，計算總糖和DP（平均聚合度）值，公式如下：

式中：D為1 mL為酶解液中總糖量，mg/mL；Z為量取酶解液中總糖量，mg；V為量取酶解液體積，mL；H為1 mL酶解液測定相應(yīng)的還原糖含量，mg/mL；DP為甘露低聚糖平均聚合度，重復(fù)單數(shù)；V0為酶解液總體積，mL；M為咖啡豆渣質(zhì)量，mg；C為咖啡豆渣中甘露聚糖含量，24.12%；L為低聚糖得率，%。

1.2.6 甘露低聚糖膜分離法

咖啡豆渣水解后的酶解液，通過12 000 r/min離心10 min除去咖啡豆渣和蛋白等雜質(zhì)后，用超濾膜過濾濃縮甘露低聚糖溶液，然后再用1 kDa和3 kDa反滲透膜分離，收集過濾液，測定過濾液的平均聚合度DP值。

1.2.7 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）衍生化法檢測多糖組分

酶解液過濾后，12 000 r/min離心10 min，吸取離心后的酶解上清液400 μL，于10 mL具塞試管中，加入400 μL 4 mol/L三氟乙酸，封口后置于110℃烘箱中水解2 h得水解液，定容至800 μL，振蕩搖勻，后取200 μL，加 400 μL 0.3 mol/L NaOH 溶液，再加配制好的PMP衍生劑，旋轉(zhuǎn)搖勻，后70℃水浴加熱30 min，冷卻后，加400 μL 0.3 mol/L的鹽酸溶液和1.0 mL氯仿萃取，于離心機(jī)在12 000 r/min下離心6 min，每組樣品都重復(fù)3次上述操作，且每次都除去下層溶液，之后取上清液待進(jìn)樣檢測。

1.2.8 PMP衍生化法HPLC檢測

采用高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）檢測經(jīng)PMP衍生化的糖含量。檢測條件：色譜柱為 Welchrom Cloumn（4.6 mm×250 mm）C18柱；流動相為乙腈：乙酸銨（0.10 mol/L，pH=5.5，用冰醋酸調(diào)節(jié)其pH值）=22∶78；流速為1 mL/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為10 μL；檢測波長為250 nm。

取7種單糖標(biāo)準(zhǔn)品（L-鼠李糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-半乳糖醛酸），分別稱取少量的單糖標(biāo)準(zhǔn)品，通過PMP衍生化，檢測單糖標(biāo)準(zhǔn)品。分別稱取1 mol的7種單糖標(biāo)，混合溶解稀釋后，配制成 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L 等梯度的5個混糖標(biāo)，衍生化后檢測混糖標(biāo)準(zhǔn)品。

2 結(jié)果與討論

2.1 甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

不同梯度濃度的甘露糖溶液，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式：y=1.596 29x-0.098 87，R2=0.999 1，結(jié)果如圖 1。

圖1 甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of mannose

2.2 酶解工藝條件對兩種酶法制備甘露低聚糖得率的影響

2.2.1 不同料液比對兩種酶法制備甘露低聚糖得率的影響

料液比優(yōu)化試驗結(jié)果見圖2，酶A水解咖啡豆渣（法A）制備甘露低聚糖最佳水解料液比為3∶50（g/mL），而酶B水解咖啡豆渣（法B）制備甘露低聚糖最佳水解料液比為4∶50（g/mL），使獲得甘露低聚糖得率最高。

2.2.2 酶解溫度對兩種酶法制備甘露低聚糖得率的影響

法A和法B的酶解溫度試驗結(jié)果見圖3。

圖2 料液比對甘露低聚糖得率的影響Fig.2 Effect of solid to liquid ratio on yield of mannan oligosaccharides

圖3 酶解溫度對甘露低聚糖得率的影響Fig.3 Temperature on yield of mannan oligosaccharides

法A的最佳酶解溫度范圍為40℃～50℃，法B的最佳酶解溫度范圍為40℃～50℃，此時制備甘露低聚糖得率最高。

2.2.3 酶解pH值對兩種酶法制備甘露低聚糖得率的影響

法A和法B酶解時不同pH值試驗結(jié)果見圖4，法A最佳酶解pH值范圍為5～7，法B最佳酶解pH值范圍為 6～8。

圖4 酶解pH值對甘露低聚糖得率的影響Fig.4 pH value on yield of mannan oligosaccharides

2.2.4 酶解時間對兩種酶法制備甘露低聚糖得率的影響

法A和法B酶解咖啡豆渣不同時間對比試驗結(jié)果見圖5，為獲得較高的甘露低聚糖得率，法A的最佳酶解時間范圍為6 h～10 h，而法B的最佳酶解時間范圍為 4 h～8 h。

圖5 酶解時間對甘露低聚糖得率的影響Fig.5 Time and enzyme amount on yield of mannan oligosaccharides

2.2.5 加酶量對兩種酶法制備甘露低聚糖得率的影響

法A和法B酶解咖啡豆渣不同加酶量結(jié)果見圖6，為獲得較高的甘露低聚糖得率，法A的最佳加酶量范圍為200 U/g～300 U/g，法B的最佳加酶量范圍為200 U/g～300 U/g。

圖6 加酶量對甘露低聚糖得率的影響Fig.6 Enzyme amount on yield of mannan oligosaccharides

2.3 法A和法B的正交對比試驗

通過單因素試驗顯著性分析，確定加酶量、酶解溫度、酶解pH值和酶解時間影響顯著的四因素進(jìn)行正交試驗。

2.3.1 法A制備甘露低聚糖正交試驗

法A制備甘露低聚糖正交試驗見表3。

結(jié)果如表3所示，法A制備甘露低聚糖，正交試驗得出最優(yōu)組合：A3B3C1D2時，檢測得率最大。最佳組合條件為：酶A加酶量300 U/g、酶解反應(yīng)溫度50℃、酶解液中pH值6和酶解反應(yīng)時間8 h。依據(jù)得出的最優(yōu)組合進(jìn)行3次重復(fù)驗證試驗，計算MOS得率為（52.76±0.11）%。

表3 正交試驗設(shè)計Table 3 Orthogonal design of experiments

2.3.2 法B制備甘露低聚糖正交試驗

法B制備甘露低聚糖正交試驗見表4。

表4 正交試驗設(shè)計Table 4 Orthogonal design of experiments

2.4 甘露低聚糖膜分離

結(jié)果如表4所示，法B制備甘露低聚糖，正交試驗出最優(yōu)組合：A3B2C3D2時，得率值最大。最佳組合條件為：加酶量300 U/g、酶解溫度45℃、酶解pH值7和酶解時間6 h。依據(jù)得出的最優(yōu)組合進(jìn)行3次重復(fù)驗證試驗，計算MOS得率為（61.01±0.12）%。

法A和法B制備甘露低聚糖，酶解液通過12 000 r/min離心10 min，去除咖啡豆渣和其它雜質(zhì)，之后用1 kDa和3 kDa反滲透膜分離，分離之后，檢測甘露低聚糖的DP值，用DNS法檢測濾液得總糖和還原糖含量，計算DP值。結(jié)果顯示，法A和法B測得的濾液（1 kDa～3 kDa）DP值分別為7.52和7.46。

2.5 PMP衍生化多糖組分分析

7種單糖混標(biāo)HPLC檢測結(jié)果見圖7，根據(jù)混糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度和對應(yīng)的峰面積，分別計算出7種單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如表5。

圖7 混糖PMP衍生化液相色譜圖Fig.7 Mixed sugar PMP derivatization HPLC

表5 7種單糖PMP衍生化標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 5 The standard curve of seven kinds of PMP derivatized monosaccharide standard curve

上述單糖和混糖標(biāo)，計算單糖PMP衍生化公式，用法B制備甘露低聚糖，酶解液過濾和離心后，取上清液進(jìn)行PMP衍生化，HPLC檢測顯示，酶解液中甘露低聚糖組成成分為：甘露糖為42.78%，半乳糖為42.58%，阿拉伯糖14.64%。

3 結(jié)論

法A和法B水解咖啡豆渣后酶解液的DP值分別為7.52和7.46，但酶B制備MOS得率為（61.01±0.12）%，比酶A制備MOS得率更高，而且酶B酶解所得酶解液，經(jīng)PMP衍生化后HPLC分析，分子量及單糖組成測定結(jié)果符合功能性低聚糖組成成分要求，為處理水提綠原酸后所剩的咖啡豆渣充分利用生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品提供了數(shù)據(jù)支持，確定了利用咖啡豆渣酶法制備甘露低聚糖高附加值產(chǎn)品的最佳工藝，實現(xiàn)咖啡豆渣的充分利用。

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Study on Preparation of Manno-oligosaccharides by Enzymatic Process of Coffee Bean Dregs

GUO Yue-ping1，XU Guang-wei1，WEI He-wen1，ZHANG Yin-jun2，*，SHEN Xue-liang2
（1.Insititute for Food and Drug Inspection and Testing of Jinhua，Jinhua 321000，Zhejiang，China；2.College of Biotechnology and Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，Zhejiang，China）

This study took the full use of the coffee bean dregs after water extraction using chlorogenic acid，made high value-added mannan-oligosaccharides（MOS）using enzymatic preparation method and analyzed its composition.Coffee bean dregs were hydrolyzed by enzyme to mannan oligosaccharides usig two market-available beta mannase from different sources：enzyme A from Bacillus subtilis，enzyme B from Aspergillus niger.The optimum process conditions（the optium enzyme amount，hydrolysis temperature，pH and enzymolysis time）were obtained through single-factor and orthogonal experiments.The yield of MOS prepared was（52.76±0.11）%by enzyme A and（61.01 ± 0.12）%by enzyme B.The average degree of polymerization（DP）of enzymatic hydrolysate treated with enzyme A and B was about 7.52 and 7.46 respectively.The hydrolysate solution treated with enzyme B was derivative reacted with 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone（PMP）before liquid chromatography（HPLC）analysis.The composition of mannan oligosaccharides was determined：galactose 42.78%，mannose 42.58%，Arabia sugar 14.64%.The DP of 7.46 satisfied the requirements for preparing functional oligosaccharides.The content of manoligosaccharides was highest，satisfing the requirement that the functional oligosaccharides should be manoligosaccharides.This study will provide technical support for making high value added products from coffee bean dregs.

coffee bean dregs；mannan-oligosaccharides；β-mannanase A；β-mannanase B；average degree of polymerization

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.012

金華市科學(xué)技術(shù)局農(nóng)業(yè)類重點項目（2016-2-006）

郭躍平（1984—），男（漢），工程師，碩士研究生，研究方向：食品研究及質(zhì)量安全。

*通信作者：章銀軍（1978—），男，高級工程師，研究方向：生物催化。

2017-02-28