游見(jiàn)明，呂開(kāi)斌，曹新志

（四川理工學(xué)院生物工程系，四川自貢643000）

米曲霉菌株NJ132液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)孢子條件初步篩選

游見(jiàn)明，呂開(kāi)斌，曹新志

（四川理工學(xué)院生物工程系，四川自貢643000）

對(duì)影響米曲霉菌株NJ132分生孢子生成的因素進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，NJ132菌株液態(tài)發(fā)酵分生孢子產(chǎn)生的適宜條件為：馬鈴薯培養(yǎng)基添加10 mg/L混合無(wú)機(jī)鹽作為培養(yǎng)基，用容積300 mL的三角瓶裝瓶裝培養(yǎng)基120 mL，搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min，在溫度25℃下暗培養(yǎng)5 d，第6天轉(zhuǎn)入20℃、光照/黑暗循環(huán)（4 h周期）條件下培養(yǎng)至第7天。

米曲霉；分生孢子；液態(tài)發(fā)酵；發(fā)酵條件

對(duì)傳統(tǒng)的白酒生產(chǎn)工藝的改革中，節(jié)能、減排、提高原料淀粉的利用率、增加出酒率等，一直以來(lái)都是行業(yè)不懈追求的目標(biāo)。如對(duì)發(fā)酵原料進(jìn)行膨化預(yù)處理來(lái)提升淀粉類物質(zhì)的糖化率，在某些酒類產(chǎn)品（如啤酒、酒精[1]）生產(chǎn)上，已獲得進(jìn)展，在白酒的生產(chǎn)上也在進(jìn)行類似的研究[2]。在進(jìn)行膨化操作過(guò)程中，將糖化菌孢子添加到原料中，通過(guò)膨化操作過(guò)程，使菌種孢子充分混于發(fā)酵原料內(nèi)部，有利于糖化操作環(huán)節(jié)的進(jìn)行，利于原料淀粉的降解。

本文基于該過(guò)程對(duì)糖化菌孢子的需求，以馬鈴薯培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，對(duì)As.oryzae菌株NJ132液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)分生孢子的適宜條件進(jìn)行選擇，為開(kāi)展大量獲得菌株孢子的研究工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

以四川省自貢市光大街菜市場(chǎng)民間作坊制作的甜酒曲為原料分離獲得的耐熱糖化酶菌株，屬米曲霉，菌株號(hào)NJ132，由四川理工學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基[3]。

1.1.3 儀器與試劑

THZ-100恒溫?fù)u瓶培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LED雙目顯微鏡：麥克奧迪儀器公司；JB5374-91電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SYQ-DSX-280B手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；MT-250恒溫培養(yǎng)箱：上海和羽良電子有限公司；血球計(jì)數(shù)板：玉環(huán)縣五金光學(xué)儀器廠。

硫酸鐵、氯化鋅、氯化錳、硫酸鎂：分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 孢子計(jì)數(shù)

用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)孢子懸液中的孢子數(shù)[4]。

1.2.2 孢子懸液制備

接種NJ132于PDA培養(yǎng)基上，于25℃培養(yǎng)7 d，待霉菌產(chǎn)生大量分生孢子后，在平板中加入10 mL 0.1%的tween-80溶液，用接種環(huán)刮取分生孢子，分離懸液，于10 000 r/min離心10 min，沉降物用5 mL無(wú)菌生理鹽水充分振蕩將孢子制成懸液，再稀釋成1×107個(gè)/mL孢子懸液備后續(xù)試驗(yàn)接種用。

1.2.3 單因素試驗(yàn)[5-6]

影響NJ132產(chǎn)生孢子的因素包括培養(yǎng)基成分、pH值、培養(yǎng)溫度、通氣、光照等。

在300 mL的三角瓶中加入100 mL培養(yǎng)液，接種1 mL孢子懸浮液，進(jìn)行以下單因素培養(yǎng)試驗(yàn)，培養(yǎng)時(shí)間為7 d，無(wú)光照，對(duì)產(chǎn)孢子情況進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。

1.2.3.1 培養(yǎng)基成分試驗(yàn)

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加無(wú)機(jī)鹽等培養(yǎng)基構(gòu)成成分以觀察培養(yǎng)基構(gòu)成成分對(duì)孢子形成的影響情況。碳源選用葡萄糖，添加量為10 g/L；無(wú)機(jī)鹽包括：FeSO4、MnCl2、ZnCl2、MgSO4，添加量為 10 mg/L。接種后于 25 ℃恒溫條件下培養(yǎng)。

1.2.3.2 培養(yǎng)條件試驗(yàn)

pH值影響：前期培養(yǎng)試驗(yàn)表明，菌株培養(yǎng)較適宜的pH值在6.0在左右。本試驗(yàn)中，用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)基礎(chǔ)培養(yǎng)基pH值為6.0，接種后于25℃條件下培養(yǎng)。

溫度影響：基礎(chǔ)培養(yǎng)基接種后，于25℃恒溫條件下培養(yǎng)至5天后，改變培養(yǎng)溫度為20℃。

通氣供氧影響：基礎(chǔ)培養(yǎng)基接種后，將搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定為80 r/min，于25℃條件下培養(yǎng)。

光照影響：基礎(chǔ)培養(yǎng)基接種后，于25℃恒溫培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第6天開(kāi)始，用3 W熒光燈20 cm進(jìn)行光照處理，處理過(guò)程為光照/黑暗交替，變換頻率為4 h，處理2天后結(jié)束培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行觀察比較以明確光照是否對(duì)產(chǎn)孢有影響。

試驗(yàn)對(duì)照培養(yǎng)為：在300 mL的三角瓶中加入100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)液，接種1 mL孢子懸浮液，于25℃暗培養(yǎng)7 d，對(duì)產(chǎn)孢子情況進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。

1.2.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇與菌株產(chǎn)孢子的影響顯著的光照、溫度、無(wú)機(jī)鹽、搖床轉(zhuǎn)速4個(gè)因子，進(jìn)行四因素三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。見(jiàn)表1。

表1 NJ132產(chǎn)孢子正交試驗(yàn)Table 1 The orthogonal test of spore production of NJ132

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照，就可能影響菌株分生孢子產(chǎn)生的各因素分別進(jìn)行的對(duì)比試驗(yàn)情況如下。

2.1.1 培養(yǎng)基成分的影響

以基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)作為對(duì)照，對(duì)比添加各種無(wú)機(jī)鹽對(duì)孢子生成的影響情況，借助DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行平均數(shù)student t檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 培養(yǎng)基成分對(duì)孢子產(chǎn)生的影響Table 2 Effects of medium composition on spore production

從添加的幾種無(wú)機(jī)鹽的結(jié)果可以看出，無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株產(chǎn)孢子有顯著影響，從平均數(shù)數(shù)據(jù)看，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基之上添加無(wú)機(jī)鹽對(duì)孢子生成具有促進(jìn)作用。進(jìn)一步就個(gè)不同不同無(wú)機(jī)鹽之間的影響情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在這幾種無(wú)機(jī)鹽之間，MnCl2與ZnCl2之間存在顯著差異（DPS統(tǒng)計(jì)軟件分析，p=0.031 9），而其余的各種無(wú)機(jī)鹽之間不存在差異。根據(jù)這種情況，試驗(yàn)中將多種無(wú)機(jī)鹽等量混合后添加于基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.2 培養(yǎng)條件對(duì)孢子生成的影響

改變各種培養(yǎng)條件對(duì)菌株產(chǎn)孢子的影響情況見(jiàn)表3。

表3 培養(yǎng)條件對(duì)孢子產(chǎn)生的影響Table 3 Effects of culture conditions on the spore production

根據(jù)表中顯示的結(jié)果可以看出，在所選擇的幾種可能對(duì)菌株產(chǎn)孢子有影響的因素中，pH值在所選的情況下，對(duì)孢子形成沒(méi)有顯著影響。溫度條件和通氣狀況及光照因素的影響最為顯著。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

單因素的試驗(yàn)結(jié)果表明，在NJ132菌株產(chǎn)孢子培養(yǎng)過(guò)程中，對(duì)產(chǎn)分生孢子具有顯著影響的因素有無(wú)機(jī)鹽添加、溫度刺激、光照刺激、通氣條件。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of orthogonal test

正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析顯示，在對(duì)菌株產(chǎn)孢子具有影響的幾個(gè)因素中，溫度是最重要的，其次是添加無(wú)機(jī)鹽，通氣狀況和光照影響依次為第三和第四影響因素。根據(jù)各因素的優(yōu)選水平為初步確定的培養(yǎng)方案為：在培養(yǎng)周期的后階段（5 d開(kāi)始）將溫度由原來(lái)的25℃降為20℃；在馬鈴薯培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，復(fù)合無(wú)機(jī)鹽添加量為10 mg/L；通氣量：容積為300 mL的三角瓶中加入100 mL培養(yǎng)液，搖床轉(zhuǎn)速100 r/min；光照：在培養(yǎng)周期前5 d采取黑暗培養(yǎng)，后2 d采用間隔4 h的光照處理。

表5 極差分析Table 5 Range analysis

3 結(jié)論

糖化酶菌株NJ132在馬鈴薯液體培養(yǎng)基上產(chǎn)孢子的能力可以通過(guò)培養(yǎng)條件的控制得到提升。從本試驗(yàn)的情況看，在不考慮碳源、氮源的情況下，添加一定量的無(wú)機(jī)鹽對(duì)孢子生成能力有提升。無(wú)機(jī)鹽在菌株生長(zhǎng)代謝過(guò)程中具有多方面的功能，如調(diào)節(jié)代謝、參與原生質(zhì)結(jié)構(gòu)、平衡滲透壓等。試驗(yàn)中添加的無(wú)機(jī)鹽可能是通過(guò)對(duì)菌株的生長(zhǎng)代謝起到了促進(jìn)作用來(lái)提升包子產(chǎn)生能力的。微生物的孢子生成是由于生長(zhǎng)環(huán)境出現(xiàn)變化，在惡劣的環(huán)境下出現(xiàn)的保護(hù)性適應(yīng)，在培養(yǎng)周期的前階段，環(huán)境條件適合菌株生物量積累。到培養(yǎng)周期后階段時(shí)，環(huán)境條件變化后，不再適合其進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)而轉(zhuǎn)入孢子生成，在這個(gè)階段，人為改變一些環(huán)境因素，在這些刺激因素影響下，菌株產(chǎn)孢子的能力得以促進(jìn)。試驗(yàn)中通過(guò)在培養(yǎng)后期降低培養(yǎng)溫度、利用光線刺激等措施，能夠?qū)崿F(xiàn)菌株產(chǎn)孢子能力的有效提升。

4 討論

影響微生物菌株產(chǎn)孢子能力的因素很多，這方面的文獻(xiàn)較多[4-7]。本次試驗(yàn)設(shè)計(jì)較為粗略，在于對(duì)孢子培養(yǎng)條件進(jìn)行初步探索，實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)該菌株孢子的培養(yǎng)調(diào)控因素具有方向性指示作用，進(jìn)一步的試驗(yàn)將考慮以下因素：對(duì)于無(wú)機(jī)鹽需要進(jìn)行更多種類的選擇；不同的無(wú)機(jī)鹽種類之間可能存在的拮抗關(guān)系。在光照方面，需要將光照強(qiáng)度進(jìn)行量化，同時(shí)還需考慮不同波長(zhǎng)的光照可能帶來(lái)不同的刺激效果；溫度因素中，本次試驗(yàn)選擇的不同水平間跨度較大。同時(shí)，溫度變化的時(shí)間點(diǎn)控制上還有待更為準(zhǔn)確的試驗(yàn)加以確認(rèn)；至于溶氧控制方面，在培養(yǎng)周期不同階段對(duì)溶氧量的控制，對(duì)孢子生成能力的影響情況都還需要進(jìn)一步試驗(yàn)確認(rèn)。本試驗(yàn)雖然只是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的小規(guī)模試驗(yàn)，但對(duì)進(jìn)一步深入研究和大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)都具有一定的指導(dǎo)意義。

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Preliminary Screening of the Fermentation Conditions of Spore Producing by Liquid Fermentation of the As.oryzae NJ132

YOU Jian-ming，Lü Kai-bin，CAO Xin-zhi
（College of Bio-engineering，Sichuan University of Science and Engineering，Zigong 643000，Sichuan，China）

The factors affecting the production of NJ132 from As.oryzae were compared.The results showed that the suitable conditions for the production of conidia by liquid fermentation of NJ132 strain were：the potato medium was added with 10 mg/L mixed inorganic salt and 120 mL of the culture medium into triangular bottle，the rotate speed was 100 r/min，at a temperature of 25℃for 5 days in the dark；from the 6th day to the 7th，cultivating under the condition of light/dark cycle of cultivation（cycling per 4 hours）at 20 ℃.

As.oryzae；conidia；liquid fermentation；fermentation condition

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.035

釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目（NJ2013-13）

游見(jiàn)明（1966—），男（漢），教授，碩士，從事生物技術(shù)教學(xué)、科研工作。

2017-01-13