王文瓊，張?zhí)m威，2*，韓雪*

1(哈爾濱工業(yè)大學(xué) 化工與化學(xué)學(xué)院，食品科學(xué)與工程系，黑龍江 哈爾濱，150090) 2(中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島，266100)

酪氨酸酶催化乳清蛋白聚合耦聯(lián)超濾的效果研究

王文瓊1，張?zhí)m威1，2*，韓雪1*

1(哈爾濱工業(yè)大學(xué) 化工與化學(xué)學(xué)院，食品科學(xué)與工程系，黑龍江 哈爾濱，150090) 2(中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島，266100)

采用酪氨酸酶催化乳清蛋白聚合，酪氨酸酶催化蛋白的條件為pH 7.0，溫度50 ℃，時間為3 h，酶活添加量為1 000 U/g蛋白時，相對于沒有通過酶處理的樣品，蛋白的膜回收效率和膜通量明顯提高。膜通量與對照組相比提高20%。蛋白回收率與對照組相比提高27%左右。乳糖的截留率降低8%左右。此時，膜總阻力Rt和膜孔阻力Rp與對照組相比分別降低16%和33%。膜污染模型分析結(jié)果顯示，酪氨酸酶催化蛋白膜過濾符合標準堵塞模型和餅層過濾模型。

酪氨酸酶；乳清蛋白；聚合；超濾

乳清是干酪生產(chǎn)的副產(chǎn)物，干酪乳清中含有牛乳干物質(zhì)質(zhì)量的一半，乳清中蛋白質(zhì)的含量為0.6%～1%。目前有一半多干酪乳清經(jīng)處理用作動物飼料和食物，但仍然有40%～50%乳清作為廢水排放，這不僅浪費了食物資源，還會造成嚴重的環(huán)境污染。傳統(tǒng)的乳清蛋白處理方式有加熱沉淀、酸堿沉淀、殼聚糖和海藻吸附沉淀以及化學(xué)試劑(如聚丙烯和三氯乙酸)沉淀等，在處理過程中消耗大量的能量，而且無法實現(xiàn)蛋白的回收再利用[1]。膜技術(shù)的出現(xiàn)給乳清蛋白的回收開辟了新的途徑，利用膜回收乳清蛋白不會改變蛋白的性狀和營養(yǎng)價值，回收的過程沒有相變的發(fā)生，能耗小，沒有有害物質(zhì)的參與[2-4]。乳品廠加工廢水的回收利用已經(jīng)不僅僅局限在傳統(tǒng)化學(xué)方法和單一膜技術(shù)的回收，多種技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用是未來食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展方向。由于乳清蛋白經(jīng)過酶催化聚合后，聚合蛋白的表面電荷和粒徑的變化會改變蛋白與蛋白、蛋白與膜之間的相互作用，進而影響蛋白的膜回收效果[5]。

酪氨酸酶(tyrosinase,E.C. 1.14.18.1) 是一種單加氧酶，同時也是多酚氧化酶的一種，催化一元酚鄰位羥基化生成二元酚，進一步氧化生成苯醌，苯醌具有較高的活性可以進一步和巰基、氨基發(fā)生反應(yīng)，在蛋白質(zhì)中形成二酪氨酸、酪氨酸-半胱氨酸、酪氨酸-賴氨酸，導(dǎo)致蛋白質(zhì)之間發(fā)生交聯(lián)。因此酪氨酸酶催化β-乳球蛋白發(fā)生交聯(lián)主要是依賴于其中的酪氨酸。ERCILI-CURA[6]采用酪氨酸酶和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)β-乳球蛋白，通過SDS-PAGE、CD、界面流動性和表面壓力對交聯(lián)后蛋白進行了分析。在沒有任何熱處理的條件下，酪氨酸酶對β-乳球蛋白沒有作用，當進行40 ℃熱處理時，酪氨酸酶可以交聯(lián)β-乳球蛋白。THALMANN[7]采用酪氨酸酶交聯(lián)乳清蛋白，在咖啡酸的存在下，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分別發(fā)生聚合，根據(jù)聚合條件的不同所發(fā)生的聚合度不同。但當咖啡酸不存在時，只有α-乳白蛋白發(fā)生聚合，聚合體大于300 kDa。酶催化蛋白聚合可產(chǎn)生具有一定功能性的蛋白添加劑，改善產(chǎn)品特定功能。目前，對于蛋白酶催化后耦聯(lián)膜超濾效果的相關(guān)研究尚未見到，本研究考察了酪氨酸酶在一定條件下催化乳清蛋白聚合后的過濾效果，并且通過膜阻力分析和膜污染模型分析，初步闡述了酶催化聚合蛋白耦聯(lián)超濾的效果和機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

酪氨酸酶(570 U/g,CAS:78830)和福林酚購自Solarbio；酒石酸鉀鈉和硫酸銅購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；聚醚砜超濾膜(10 kDa)，購自美國Sepro公司。

1.2儀器與設(shè)備

紫外分光光度計，SPECORD200，Analytikjena；美國Millpore 超濾設(shè)備。

1.3方法

1.3.1 酪氨酸酶催化蛋白聚合超濾蛋白含量的測定

采用Lowery法測定蛋白含量[8-9]。

① 1 mL 1% CuSO4·5H2O，1 mL 2%酒石酸鉀鈉和100 mL 2% Na2CO3試劑混合備用。② 將標準蛋白BSA溶解于1 mol/L NaOH，配制成1 mg/mL的蛋白溶液。③ 取0.5 mL不同濃度的蛋白至10 mL離心管中。④ 向蛋白溶液中加入5 mL上述混合液，攪動10 min。⑤ 加入0.5 mL 1 mol/L福林酚試劑反應(yīng)30 min后，于660 nm處測定吸光值，繪制標準曲線。同時采用濃縮因子(VCF)來衡量蛋白質(zhì)回收效率。

(1)

式中：Cp和Cf分別表示透過液和原液中蛋白含量(mg/mL)。

1.3.2 酶催化蛋白聚合超濾乳糖量測定

采用Luff schoorl 法測定截留液和透過液中乳糖含量。

① 檸檬酸50 g溶解于50 mL去離子水中；② 碳酸鈉143.7 g，溶解于400～500 mL去離子水中；③ 將上述兩種溶液混合冷卻備用；④ 25 g硫酸銅溶解于100 mL 蒸餾水中，然后加入上述溶液中，定容至1 000 mL。制成Luff試劑；⑤ 乙酸0.4 mol/L：取乙酸24 mL定容至1 000 mL；⑥ 碘0.1 mol/L：1.27 g碘+3 g碘化鉀溶于100 mL水中。⑦ 鹽酸0.75 mol/L：73 g鹽酸蒸餾水定容至1 000 mL；⑧ 硫代硫酸鈉0.1 mol/L；⑨ 可溶性淀粉指示劑：2 g可溶性淀粉溶于100 mL蒸餾水中；⑩ 移取25 mL Luff試劑于300 mL平底燒瓶中，加入25 mL樣品，加熱冷凝回流10 min，迅速冷卻；冷卻后加入50 mL乙酸，再加入25 mL碘，再加入55 mL鹽酸，充分混合后加入6～8滴淀粉指示劑，然后采用0.1 mol/L硫代硫酸鈉溶液滴定至淡藍色為終點。采用乳糖作為標準物繪制標準曲線：配制乳糖溶液質(zhì)量濃度分別為：1、2、3、4、5 mg/mL；樣品乳糖含量測定：取樣品0.5 mL加入24.5 mL蒸餾水，即稀釋50倍。按照上述步驟測定代入標準曲線計算乳糖含量。

(2)

式中：Cp和Cf(mg/mL) 分別表示透過液和原液中乳糖含量。

1.3.3 酶催化蛋白聚合超濾回收乳清膜通量變化的測定

膜通量變化按式(3)計算：

(3)

式中：J，膜通量；V，透過液體積，mL；A，有效膜面積,cm2；Δt，時間變化，min。

1.3.4 酪氨酸酶催化蛋白聚合回收乳清蛋白膜的阻力分析

(4)

Rt=Rm+Rc+Rp

(5)

式中：J，膜通量，L/(m2·h)；Δp，膜兩側(cè)壓力差，kPa；μ，濾液動力學(xué)黏度，Pa·s；Rt，膜過濾總阻力，m-1；Rm，膜自身阻力，m-1；Rc，泥餅層阻力，m-1；Rp，膜孔污染阻力，m-1。

1.3.5 酶催化乳清蛋白膜過濾模型分析

(6)

式中：n=0，濾餅過濾；n=1，中間堵塞；n=3/2，標準堵塞；n=2，完全堵塞；t，過濾時間，s；V，濾液體積；K為過濾常數(shù)。

表1 死端過濾過程中不同污染機理的經(jīng)驗公式

注：J，通量；J0， 初始通量；V，過濾體積；t過濾時間；A，B，C和D是常數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1酪氨酸酶催化乳清蛋白聚合耦聯(lián)超濾膜通量變化研究

由于酪氨酸酶催化乳清蛋白聚合效果已有相關(guān)研究，因此在文獻研究的最佳酶催化條件基礎(chǔ)上，進行乳清蛋白的酪氨酸酶催化聚合后超濾，考察膜過濾過程中，膜通量的變化。分組和酶催化條件為：對照組為無酶處理乳清超濾；實驗組為酪氨酸酶催化乳清蛋白聚合超濾，酶催化條件為：酶活添加量為1 000 U/g蛋白，同時加入咖啡酸1 mmol/L，pH 7.0水浴50 ℃，3 h。

由于檢驗統(tǒng)計量為-4.748639，小于顯著性水平(5%)的臨界值-3.6736，可認為估計殘差序列E為平穩(wěn)序列，進而變量LTTL和LGDP具有協(xié)整關(guān)系，即具有長期均衡關(guān)系。

圖1可知，隨著膜超濾時間的增加，膜通量逐漸降低。說明隨著超濾時間的增加，蛋白質(zhì)吸附在膜表面形成膜阻，導(dǎo)致膜通量降低。酶對乳清蛋白聚合后的過濾膜通量高于對照組。研究顯示，膜過濾過程中粒徑和形狀對過濾的效果影響顯著，當濾液中的物質(zhì)為方塊或者針型，過濾的速率會大大增加，當濾液中的物質(zhì)為圓形時，過濾速率會減小，主要是因為方形和針型兩種形狀所形成的餅層可以增加過濾速度[10]。由于乳清蛋白中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白兩個蛋白為球型蛋白，在蛋白聚合酶的作用下聚合形成不規(guī)則形狀，在膜表面形成疏松的餅層，增加了過濾的速度，膜通量增加。因此，酪氨酸酶催化聚合乳清蛋白后膜過濾，可以提高膜通量。但是隨著過濾時間的延長，尤其是60 min后，酶聚合蛋白過濾組和對照組膜通量小差異不顯著，主要是因為隨著過濾時間的增加，在一定的跨膜壓力下，粒徑較大的蛋白在膜孔表面形成的疏松餅層的塌縮效應(yīng)引起蛋白分子間的孔隙率降低，蛋白在膜表面形成餅層阻力，降低了膜通量。而對照組，低分子蛋白在過濾的初期，迅速形成膜孔堵塞，降低膜通量，之后蛋白在膜表面堆積，疏松餅層的形成和部分膜孔中的蛋白進入透過液中使其在30 min 時，膜通量增加，之后由于低分子量蛋白的塌縮速度高于大分子蛋白，因此使得蛋白膜通量迅速下降[11]。

圖1 酶催化乳清蛋白聚合耦聯(lián)超濾膜通量變化結(jié)果Fig.1 Flux changes of enzyme catalysis whey protein aggregation coupling ultrafiltration

2.2酪氨酸酶催化乳清蛋白過濾效果的研究

超濾75 min結(jié)束后，采用Lowery法測定透過液和濃縮液中蛋白含量，計算出蛋白回收率和蛋白截留率，同時通過濃縮體積比計算濃縮因子VCF，考察膜濃縮蛋白效果。

(a)蛋白回收率和蛋白截留率；(b)濃縮因子(VCF)；(c)乳糖截留率圖2 酪氨酸酶催化聚合乳清蛋白膜過濾效果Fig.2 Tyrosine catalytic whey protein polymerization coupling membrane filtration effect

由圖2(a)所示，以沒有進行酶催化處理的乳清作為對照組，對照組的具有較高的蛋白截留率，但其蛋白回收率較低，主要是因為，對照組中大量低分子量乳清蛋白堵塞在膜孔，以及形成較為堅固的餅層所導(dǎo)致膜通量下降，大量蛋白堵塞和吸附在膜表面，導(dǎo)致蛋白回收率降低，酪氨酸酶催化蛋白聚合后蛋白回收率高于對照組。由于蛋白與膜的相互作用影響因素復(fù)雜，除了粒徑大小，粒徑的形狀以還有聚合后蛋白的表面電荷的多少，也會影響過濾速率。不同酶催化蛋白聚合形成的蛋白聚合物表面電荷不同，形狀不同，在膜表面形成的餅層疏松情況不同，最終影響蛋白的回收率和濃縮因子VCF。由圖2(b)可知，酶催化聚合蛋白超濾濃縮因子VCF也相對較高，即在此濃度下，蛋白的截留率增加的同時，蛋白的回收率也提高，說明在此濃度下催化過濾，在膜表面沉積的蛋白量少，大部分進入到截流液中，也間接說明了膜污染的降低。乳清蛋白的聚合程度不同，所形成的蛋白聚合物的表面電荷，聚合體的形狀，以及表面電荷的變化都會影響蛋白與膜表面的相互作用，隨著超濾時間的增加，聚合后的大分子蛋白在膜表面形成疏松的餅層，增加了低分子蛋白的截留，同時提高膜通量，降低乳糖分子的截留率。由圖2(c)可知，酪氨酸酶催化聚合后超濾，與對照組相比溶液中的乳糖截留率減低，主要是蛋白聚合物的體積增加，在膜表面形成疏松的餅層，導(dǎo)致部分蛋白流入透過液中，乳糖留率降低。另外，隨著超濾時間的增加，跨膜壓力的不斷作用，部分蛋白被壓入透過液中，導(dǎo)致蛋白截留率下降。因此，適當?shù)牡鞍酌复呋酆显谀け砻嫘纬傻娘瀸涌梢栽黾拥鞍椎幕厥章省?/p>

2.3酪氨酸酶催化蛋白膜過濾阻力分析

根據(jù) Darcy 公式，測定不同通量條件下的過膜壓力并進行回歸，計算出膜自身阻力Rm；膜過濾結(jié)束時，結(jié)合此刻的過膜壓力，通量以及濾液黏度，計算膜的總阻力Rt；將膜組件從反應(yīng)器中，用自來水沖洗掉表面泥餅層，測定清水通量及相應(yīng)的過膜的壓力，獲得Rm和Rp阻力之和；在此基礎(chǔ)上，減去阻力Rm，得到膜孔污染阻力Rp；將總阻力Rt減去Rm和Rp得到泥餅層阻力Rc[12-13]。

圖3 酪氨酸酶催化蛋白聚合膜過濾阻力分析Fig.3 Membrane filtration resistance analysis of tyrosine catalysis protein cross-linking coupling ultrafiltration

由圖3可知，酶催化乳清蛋白聚合后超濾過程中，與對照組相比酪氨酸酶催化蛋白聚合后過濾，膜總阻力Rt下降，膜孔阻力與對照組差異不顯著，膜餅層阻力降低，低于對照組，主要是疏松的膜餅層阻力的形成使大部分蛋白截流的同時，也加快了膜過濾的速度，對照組由于蛋白堵塞膜孔以及堅硬的膜餅層的形成，導(dǎo)致膜通量迅速下降，膜阻力增加。餅層阻力的增加也說明，部分蛋白保留在膜表面，這也是為什么酪氨酸酶催化后過濾膜通量增加，但是蛋白的回收率降低的原因，由酪氨酸酶催化乳清蛋白聚合偶聯(lián)超濾，膜總阻力和膜孔阻力降低，膜餅層阻力增加，說明酪氨酸酶催化乳清蛋白過濾過程中蛋白質(zhì)分子聚合，粒徑增加，導(dǎo)致膜餅層阻力增加，餅層阻力的增加，增加了低分子量蛋白的截留，同時也降低了低分子量蛋白在膜孔的堵塞。因此大部分蛋白被回收，蛋白回收率和膜通量同時提高。經(jīng)過酪氨酸酶催化聚合的乳清蛋白在超濾過程中對超濾膜的污染顯著降低，沒有經(jīng)過酶催化聚合的乳清蛋白的膜孔阻力明顯高于酶催化后過濾時的膜孔阻力，是由于沒有經(jīng)過酶催化后的低分子量的乳清蛋白在膜堵塞膜孔，導(dǎo)致膜通量迅速下降，由圖3也可以看出膜孔阻力相對酶聚合后蛋白過濾時較低，主要是餅層的形成導(dǎo)致膜孔阻力較低與DACRY和CARMAN-KOZENY所提出的方程理論是一致的[14]。

2.4酪氨酸酶催化蛋白膜過濾模型研究

膜污染的發(fā)生是由于顆粒物在膜表面或者膜孔內(nèi)的沉積，涉及4種不同的堵塞機理：完全堵塞模型，中間堵塞模型，濾餅層過濾模型及標準過濾模型如圖4所示。完全堵塞模型是假設(shè)經(jīng)典的過濾模型，用來表征顆粒物完全堵塞孔道阻止水流的通過，顆粒不是在膜表面成層分布的，而是只沉積了一層。中間堵塞模型跟完全堵塞是相似的，但是中間過濾模型假設(shè)一部分顆粒堵塞膜孔，另一部分顆粒在膜表面聚集。濾餅層過濾模型是指均一的濾餅層在膜表面形成，污染層是可滲透的允許水流通過。標準過濾模型是指顆粒物在膜孔內(nèi)聚集粘附到膜孔的內(nèi)壁上，膜孔體積的減少跟濾液的體積成比例。

(a)完全堵塞模型；(b)標準堵塞模型；(c)中間堵塞模型； (d)餅層過濾模型圖4 膜污染機理示意圖 Fig.4 Membrane filtration models

圖5 采用(a)完全堵塞模型、(b)中間堵塞模型、(c)餅層過濾模型、(d)標準堵塞模型擬合比較對照組原乳清過濾(1)和酪氨酸酶催化耦聯(lián)膜過濾通量下降曲線(2)Fig.5 Four fouling models:(1) Cake filtration (2) Complete blocking (3) Intermediate blocking and (4) Standard blocking,respectively

采用4種過濾模型模擬乳清蛋白在酶膜反應(yīng)器中的過濾過程。由于PES膜表面固定化酶以后，膜表面的親水性增強，為排除固定化酶膜本身對乳清過濾效果的影響，采用雙對照的方式，兩個對照組分別為PES膜過濾乳清蛋白和固定化酶膜未催化蛋白直接過濾過程。比較酶膜反應(yīng)器催化乳清蛋白聚合過濾過程。由圖5可知，標準過濾模型可以較好地擬合PES膜過濾乳清和固定化酶膜未催化蛋白過濾過程，說明大量的蛋白堵塞在膜孔，形成不可逆轉(zhuǎn)的污染，膜通量迅速下降。而餅層過濾模型和標準過濾模型都可以較好的擬合酶膜反應(yīng)器中的乳清蛋白過濾過程，因此，可知酶膜反應(yīng)器催化蛋白聚合后過濾在膜表面形成了疏松的餅層，因此膜空堵塞減少，由于疏松的餅層比較容易清理，在一定的流體沖刷下會進入截流液中，整個固定化酶膜的污染降低。在BOURCIER等人的研究中發(fā)現(xiàn)立方體和針型結(jié)構(gòu)即圓柱形結(jié)構(gòu)在過濾的過程中形成多孔的餅層，使過濾速度增加，而片狀和球形結(jié)構(gòu)過濾速度比較慢，另外，就是粒徑大的物質(zhì)過濾速度大于粒徑小的溶液[10]。因此經(jīng)過酶膜催化聚合后形成的類似針型的聚合物增加了過濾速度，同時酶聚合物使蛋白的粒徑增加，也會增加整體溶液的過濾速度。

3 結(jié)論

研究了酶催化低濃度蛋白聚合耦聯(lián)超濾回收廢水中的蛋白，改變蛋白質(zhì)分子與膜之間的相互作用，降低膜污染，提高蛋白回收率。采用酪氨酸酶催化乳清蛋白聚合，酪氨酸酶催化蛋白的條件為pH 7.0，溫度50 ℃，時間為3 h以及酶活添加量為1 000 U/g蛋白時，相對于沒有通過酶處理的樣品，蛋白的膜回收效率和膜通量明顯提高。膜通量與對照組相比提高20%。蛋白回收率與對照組相比提高27%左右。乳糖的截留率降低8%左右。此時，膜總阻力Rt和膜孔阻力Rp顯著降低。膜污染模型分析結(jié)果顯示，酪氨酸酶催化蛋白膜過濾符合標準堵塞模型和餅層過濾模型。

本研究實現(xiàn)了蛋白催化與膜分離回收的同時進行，不僅僅回收了廢水中的蛋白還降低了膜污染，提高了膜運行周期，同時產(chǎn)生的酶聚合蛋白具有一定的功能特性可以應(yīng)用于食品和化工領(lǐng)域。此外，還深入研究了酶聚合蛋白在過濾過程中蛋白與膜，蛋白與蛋白之間的相互作用能，分析蛋白過濾機理，為蛋白膜過濾提供理論基礎(chǔ)。因此，該項研究成果具有推廣應(yīng)用前景。

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Tyrosinasecatalyzewheyproteincross-linkingcouplingultrafiltration

WANG Wen-qiong1,ZHANG Lan-wei1,2*,HAN Xue1*

1(Department of Food Science and Engineering,School of Chemistry and Chemical Engineering, Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China) 2(College of Food Science and Engineering,Ocean Univerisity of China,Qingdao 266100,China)

Changing the interactions between protein and membrane for reducing membrane fouling and increasing protein recovery rate becomes a new challenge in low concentration of protein recovery field. Tyrosinase was used to catalyze whey protein polymerization. The enzyme catalysis condition was incubated at 40 ℃, pH 7.0 for 3 h. The enzyme content was 1 000 U/g protein. At this condition, protein recovery rate and membrane flux were obviously increased compared with sample without enzyme treatment. The membrane flux increased 20% compared with control. Protein recovery rate increased about 27% compared with control. The retention rate of Lactose was reduced about 8%. At this time, the total membrane resistanceRtand membrane pore resistanceRpwere reduced 16% and 33%, respectively. The results of membrane fouling model showed that tyrosinase catalysis on protein cross-linking coupling ultrafiltration conformed to standard block model and the cake filtration model.

tyrosinase; whey protein; cross-linking; ultrafiltration

博士研究生(張?zhí)m威教授、韓雪副教授為通訊作者，E-mail：zhanglw@hit.edu.cn，xhan@hit.edu.cn)。

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃課題：乳制品加工膜技術(shù)應(yīng)用研究與產(chǎn)業(yè)化示范——乳品加工廠廢水的回收利用(2013BAD18B05-05)

2017-03-15，改回日期：2017-05-23

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014320