劉道奇，陳守文，李俊輝，陳雄，王志*

1(湖北工業(yè)大學，發(fā)酵工程教育部重點實驗室，湖北省工業(yè)發(fā)酵協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北省工業(yè)微生物重點實驗室，湖北 武漢，430068)2(湖北大學 生命科學學院，湖北 武漢，430062) 3(綠康生化股份有限公司，福建 蒲城，353400)

混合碳源對地衣芽孢桿菌發(fā)酵合成桿菌肽的影響

劉道奇1，陳守文2，李俊輝3，陳雄1，王志1*

1(湖北工業(yè)大學，發(fā)酵工程教育部重點實驗室，湖北省工業(yè)發(fā)酵協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北省工業(yè)微生物重點實驗室，湖北 武漢，430068)2(湖北大學 生命科學學院，湖北 武漢，430062) 3(綠康生化股份有限公司，福建 蒲城，353400)

在10 L發(fā)酵罐水平研究了地衣芽孢桿菌批發(fā)酵、補料(葡萄糖、乳糖)批發(fā)酵對細胞生長以及溢流代謝和桿菌肽合成的影響。批發(fā)酵過程中，細胞28 h達到峰值(91×108CFU/mL)后自溶，桿菌肽效價32 h達到峰值(960 U/mL)后逐漸降解。20～28 h流加葡萄糖批發(fā)酵的峰值生物量(24 h)為115×108CFU/mL，比對照提高了26%。但是，流加葡萄糖后桿菌肽合成速率(20～40 h)是17.2 U/(mL·h)，僅為補料前(20 h之前)的53%?；咸砑尤樘桥囵B(yǎng)的峰值生物量(32 h)為110×108CFU/mL，比分批發(fā)酵提高了20.6%，并與流加葡萄糖批發(fā)酵接近。同時，桿菌肽以29 U/(mL·h)的速率持續(xù)合成至40 h的1 143 U/mL，比分批發(fā)酵效價提高了19%。

地衣芽孢桿菌；桿菌肽；葡萄糖；乳糖；溢流代謝

桿菌肽具有抗菌譜廣泛，排泄短，藥物殘留量少，安全評估性好，無抗藥性等優(yōu)良特性，是目前世界上銷量最大的畜禽用抗生素之一[1-3]。桿菌肽特有的優(yōu)勢使其應用和研究得到了迅速發(fā)展，如：曾新年等[4]基于地衣芽孢桿菌桿菌肽發(fā)酵前期(4 h)溶氧跌零，考察了發(fā)酵中期流加H2O2對細胞生長代謝的影響，降低了細胞自溶度，增加了糖耗速率，效價達到1 021 U/mL，比對照提高了10%。鮑帥帥等[5]研究了谷氨酸對桿菌肽合成的影響，谷氨酸增加了還原型煙酰胺嘌呤二核苷酸(NADH)的消耗，降低了揮發(fā)酸的生成，放罐效價達到1 020 U/mL，發(fā)酵周期縮短約4 h。WANG等[6]研究了乙偶姻還原酶的活性對地衣芽孢桿菌合成桿菌肽的影響，發(fā)現(xiàn)提高該酶活性可以明顯減低胞內NADH/NAD+的比率，最高效價達到1 076 U/mL，比對照提高了11.6%。

葡萄糖是芽孢桿菌補料批培養(yǎng)常用的碳源，如：葡萄糖和有機氮源混合補料策略[7]；葡萄糖、氨基酸和磷酸鹽補料策略[8]，但是關于桿菌肽發(fā)酵補糖優(yōu)化的報道卻不多。因此，筆者研究了補料碳源(葡萄糖和乳糖等)對細胞生長以及溢流代謝和桿菌肽合成的影響，探尋速效碳源和遲效碳源在發(fā)酵過程中的作用機制差異，為工業(yè)化應用打下基礎。

1 材料與方法

1.1菌株

地衣芽孢桿菌LC(BacilluslicheniformisLC)為高產(chǎn)桿菌肽菌株，產(chǎn)生豐富的淀粉酶、蛋白酶等，生長繁殖迅速，由湖北大學綠康生物工程研究所提供。

1.2培養(yǎng)基

茄子瓶斜面培養(yǎng)基：酵母浸膏20 g/L， NaCl 5 g/L，瓊脂20 g/L，調pH至7.5。

種子培養(yǎng)基：豆粕50 g/L，玉米淀粉20 g/L，輕質CaCO34 g/L，(NH4)2SO41 g/L，玉米漿2.5 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：豆粕90 g/L，淀粉40 g/L，CaCO34 g/L，(NH4)2SO40.7 g/L，蛋白胨10 g/L。

1.3培養(yǎng)方法

1.3.1 種子活化

用無菌竹簽轉接-80 ℃保藏甘油管菌液至茄子瓶斜面，在恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.3.2 種子培養(yǎng)

向長滿菌苔的茄子瓶斜面中加50 mL無菌水，用竹簽刮洗菌苔后倒入裝有玻璃珠的無菌空三角瓶中，搖勻。取4 mL菌懸液于種子搖瓶中(250 mL三角瓶裝25 mL種子培養(yǎng)基)，并在37 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，得到種子液。

1.3.3 搖瓶發(fā)酵

取3 mL菌懸液于發(fā)酵搖瓶(250 mL三角瓶裝25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基)，并在37 ℃、200 r/min培養(yǎng)約46 h。

1.3.4 10 L罐發(fā)酵

基料5 L，接種量的體積分數(shù)為10%，通氣量450 L/h，轉速450 r/min，37 ℃培養(yǎng)40 h左右。

1.3.5 葡萄糖溶液的流加

周期取樣，采用DNS法測定發(fā)酵上清液中葡萄糖含量，及時調整罐上補料控制系統(tǒng)的參數(shù)，包括補料頻率和開度參數(shù)，控制15%葡萄糖溶液流加速率，使發(fā)酵液中葡萄糖質量濃度在20～28 h維持在7～10 g/L之間。

1.4分析方法

1.4.1 總糖和葡萄糖的測定

采用硫酸蒽酮法測定總糖[9]。DNS法測定葡萄糖的含量[4]。

1.4.2 桿菌肽效價測定

流動相配制：配制pH為6.0的磷酸鹽緩沖溶液，甲醇∶乙腈∶磷酸鹽緩沖溶液的體積比為64∶1∶35。

檢測條件：Ultimate 3000高效液相色譜；AclaimTM的C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測波長254 nm；柱溫30 ℃，流速1 mL/min；進樣量為25 μL。

精密稱取15 mg桿菌肽標準品(效價為65.8 U/mg)，用40 g/L的EDTA溶液溶解并定容5 mL，上清液用0.22 μm的微孔濾膜過濾，濾液為桿菌肽標品溶液，其效價為197.4 U/mL。經(jīng)高效液相色譜測定，獲得該標品的峰面積(As)。

將5 mL發(fā)酵液樣品在8 000 r/min離心10 min，取上清液。取1 mL上清液并加入50%乙醇溶液定容至5 mL(相當于稀釋5倍)，置磁力攪拌器上攪拌5 min，以10 000 r/min離心5 min，取上清液用0.22 μm的微孔濾膜過濾，濾液用于高效液相色譜測定，獲得樣品的桿菌肽峰面積A。桿菌肽效價(U/mL)=5×197.4×A/As。

1.4.3 離線測定揮發(fā)性有機酸含量

檢測條件：安捷倫7890B型，氫火焰離子化FID檢測器。HP-INNOWax 型毛細管柱(30 m×0.53 mm×1 μm)；程序升溫條件：40 ℃保留5 min，后以20 ℃ /min升到120 ℃，再以10 ℃ /min 升到220 ℃，220 ℃ 保留3 min。分流比是15∶1，流速 5 mL/min，進樣口溫度250 ℃，檢測器溫度280 ℃。

2 結果與分析

2.110L發(fā)酵罐批次培養(yǎng)地衣芽孢桿菌LC的發(fā)酵特點

發(fā)酵過程乙偶姻、乙酸、丙酸、異丁酸含量的變化趨勢圖1B所示：乙偶姻和丙酸的趨勢一致，12～16 h開始積累，分別達到最大值為1.66 g/L和0.97 g/L，28 h被消耗殆盡；異丁酸質量濃度20 h達到最大的1.98 g/L，并在32 h被消耗殆盡。乙酸24 h的峰值質量濃度3.42 g/L，比其他揮發(fā)酸醇高。這與地衣芽孢桿菌LC發(fā)酵生產(chǎn)桿菌肽過程中，細胞通過溢流代謝產(chǎn)生揮發(fā)性有機酸醇來維持NADH/NAD+代謝平衡[11]的報道一致。

圖1 地衣芽孢桿菌LC桿菌肽發(fā)酵過程(數(shù)據(jù)為平均值±標準偏差)Fig.1 Time course of bacitracin fermentation byB.licheniformis LC (Means±standard deviation)

2.2變速流加15%的葡萄糖對桿菌肽合成的影響

發(fā)酵24 h后發(fā)酵液中總糖濃度降到2%以下(圖2A)，發(fā)酵液中碳源不足影響了菌體活性和桿菌肽的合成效率。由于24～32 h總糖維持在9 g/L左右，維持桿菌肽的合成效率(圖1A)。因此，通過蠕動泵變速流加15%葡萄糖溶液，使20～28 h發(fā)酵液還原糖質量濃度維持在7～10 g/L之間，以考察流加葡萄糖對菌體的生長和代謝活性的影響。

如圖2A所示：16 h的葡萄糖質量濃度為6.3 g/L，于是在20～28 h啟動流加模式。12～20 h，菌體生長和桿菌肽合成與對照組相差無幾；流加葡萄糖后，20～40 h桿菌肽合成速率僅為17.2 U/(mL·h)，是補料前(12～20 h)合成速率32.3 U/(mL·h)的53%，40 h達到峰值701 U/mL，僅為對照組的73%，隨后開始降解。

24 h峰值生物量為115×108CFU/mL，比對照組峰值提高26%。同時，36 h出現(xiàn)明顯的二次生長現(xiàn)象，生物量93×108CFU/mL。42 h放罐pH 8.25，低于對照的8.51，進一步反映了葡萄糖的流加增加了碳代謝供給，促進了發(fā)酵后期細胞的生長，減少了自溶和氮源的脫氨基催化。

圖2 流加葡萄糖對桿菌肽發(fā)酵過程的影響(數(shù)據(jù)為平均值±標準偏差)Fig.2 The effect of glucose-feeding on bacitracin fermentation by B.licheniformis LC (Means±standard deviation)

圖2B所示：乙偶姻、丙酸(16 h)和異丁酸(20 h)的峰值濃度是1.75 、1.1 和2.06 g/L，與對照組相(圖1)近。之后乙偶姻和丙酸分別在24 h和28 h出現(xiàn)二次峰值，為1.52 和0.65 g/L。乙酸在28 h的峰值為4.41 g/L，36 h仍高位維持在2.57 g/L。葡萄糖的流加明顯增加了揮發(fā)性有機酸醇的含量，直到40 h才消耗殆。

顯然，葡萄糖溶液的流加，導致初級代謝旺盛，而次級代謝減弱，桿菌肽合成受到抑制，對發(fā)酵產(chǎn)生了不利的影響。因此，需要考察添加遲效碳源來減弱碳通量，避免葡萄糖流加帶來的負面影響。

2.3添加不同種類的碳源對桿菌肽合成的影響

由圖1和圖2所示：桿菌肽發(fā)酵中后期，碳源是不足的，而且流加葡萄糖對桿菌肽合成也沒有正效果。因此，需要考慮添加遲效碳源，當細胞處于糖限制狀態(tài)時，補加的遲效性碳源能持續(xù)地為細胞供應能量和前體，可能會促進桿菌肽分子持續(xù)合成。

葡萄糖和乳糖的混合碳源發(fā)酵表現(xiàn)為細菌碳分解代謝阻遏效應，乳糖作為遲效性碳源可以在細胞處于糖限制狀態(tài)時，持續(xù)地為細胞供應能量和前體。甘油作為細菌常用的碳源，因其跨膜轉運效率遠低于葡萄糖[12]，可能也起到遲效碳源的作用。另外，PW310是水溶性酵母葡聚糖，以具有β-1，3糖苷鍵為特征[13]。地衣芽孢桿菌菌株具有產(chǎn)生葡聚糖酶的能力[14]。因此，當細胞處于糖限制狀態(tài)時，存在的PW310可能會誘導細胞產(chǎn)生葡聚糖酶，并持續(xù)的為細胞供應碳源，可能也會促進桿菌肽的合成。乙酸是細菌常見的溢流代謝產(chǎn)物，并可被重新利用(圖2)。直接流加乙酸會對發(fā)酵液pH影響顯著，因此，添加乙酸鈉可能會在發(fā)酵后期碳源不足時用于菌體的生長和代謝，并促進桿菌肽的合成。基于以上考慮，我們在搖瓶水平上研究了4種不同類型的碳源(乳糖、甘油、乙酸鈉和可溶性葡聚糖PW310)對細胞桿菌肽合成的影響，如圖3所示。

圖3 碳源添加對桿菌肽合成的影響(平均值±標準偏差)Fig.3 Effects of carbon resource addition on bacitracin producion (Means±standard deviation)

當乳糖添加量為1.5%時，桿菌肽效價最高為725 U/mL，比對照組(660 U/mL)提高了9.84%。添加量0.5%、1.0%和2.0%都促進了桿菌肽合成，但是不如1.5%的明顯。說明乳糖做為遲效性碳源，其在葡萄糖耗盡后能持續(xù)、溫和地為細胞提供碳源和能源，并最終促進了桿菌肽的合成。

添加甘油對桿菌肽合成發(fā)生抑制作用，而且濃度越高，抑制作用越明顯。甘油加入搖瓶后增加了培養(yǎng)基的黏度，引起發(fā)酵環(huán)境滲透壓和供氧效率的改變，搖瓶發(fā)酵結束時，pH值在7.3～7.4，遠低于對照搖瓶pH在8.0～8.1的水平(資料未顯示)并呈現(xiàn)出其對桿菌肽的抑制效應。后續(xù)研究可以考慮流加的方法考察其對細胞生長代謝的影響。

添加酵母可溶性葡聚糖PW310時，會抑制桿菌肽的合成，且濃度越高，抑制作用越明顯。這可能與酵母葡聚糖的糖苷鍵為β-1,3-1,6型[13]，與地衣芽孢桿菌的葡聚糖酶(β-1,3-1,4糖苷鍵型)[14]專一性不匹配有關。另外，PW310為安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)的的水溶性產(chǎn)品，其1.5%～2.0%的水溶液pH值在pH 4.5～5.0之間，加入培養(yǎng)基后改變了發(fā)酵的初始pH值，這影響了細胞的生長和代謝，并對桿菌肽合成產(chǎn)生了抑制作用。后續(xù)研究可以考慮在發(fā)酵罐上采用PW310溶液調pH至中性后流加的方法，考察其對細胞生長代謝的影響。

當乙酸鈉添加量為1.0%時，桿菌肽效價最高為688 U/mL，比對照略有提高，而1.5%和2.0%添加量對桿菌肽合成表現(xiàn)出抑制作用。乙酸可以經(jīng)乙酸激酶-磷酸轉乙酰酶生成乙酰-CoA[15]進入三羧酸循環(huán)而被利用，而1分子外源乙酸根的活化需要額外消耗1分子的ATP，這可能加重了細胞的供能負擔；另外在葡萄糖限制條件下，由于糖酵解途徑的下調導致草酰乙酸的回補效率下降可能也會導致乙酰CoA進入三羧酸循環(huán)代謝的效能降低，而且外源乙酸鈉添加濃度越高(如1.5%的添加量)，這種矛盾就越明顯，能量供應不足影響了桿菌肽分子前體——氨基酸的活化，并最終對桿菌肽合成產(chǎn)生了抑制作用，而且顯示出高外源乙酸濃度抑制相關性。

基于以上分析，初步確定了乳糖對桿菌肽發(fā)酵合成的促進作用，因此選擇乳糖進行后續(xù)實驗，而甘油和PW310將在以后的研究中分別在發(fā)酵罐上采用流加和中性pH流加的策略加以展開，以確定其對細胞的生長、代謝以及桿菌肽合成的影響。

2.410L罐基料添加1.5%乳糖對細胞生長和桿菌肽合成的影響

根據(jù)細菌對葡萄糖和乳糖的利用方式[16]，乳糖可以在基礎料中添加以簡化發(fā)酵補料工藝，其對地衣芽孢桿菌LC生長和代謝的影響如圖4所示。

圖4 10 L罐基料添加1.5%乳糖對細胞生長和桿菌肽合成的影響Fig.4 Effects of lactose addition (1.5%) on cell growth and bacitracin production in 10 L bioreactor

如圖4A所示：菌體峰值生物量(32 h)110×108CFU/mL，比對照組(91×108CFU/mL，圖1)提高20.6%，36 h細胞自溶近一半。40 h也出現(xiàn)了二次生長，其生物量為104×108CFU/mL，之后細胞再次自溶。

基料添加乳糖后，桿菌肽效價持續(xù)合成至40 h的1 143 U/mL，比對照組的峰值效價(960 U/mL，圖1A)提高19%。同樣的，pH呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，增長速度和流加葡萄糖實驗組(圖2)相當，42 h放罐pH 8.27。

添加乳糖后，乙偶姻、丙酸、異丁酸的濃度在20 h積累至一次峰值，分別是2.09、1.83和3.51 g/L(圖4B)。28 h揮發(fā)性有機酸醇的含量二次積累。發(fā)酵后期溢流分子作為主要儲備碳源，維持細胞的生長，并在40 h徹底地消耗殆盡。乙酸是含量最多的溢流代謝產(chǎn)物之一，它與其他揮發(fā)酸醇的含量變化趨勢不同，12～32 h乙酸質量濃度維持在3.62～4.73 g/L之間，它的代謝時間明顯要比其他揮發(fā)酸醇要長，是后期碳源不足時主要的氧化供能分子，這和KABISCH等[17]的報道一致。

3 討論與結論

3.1討論

地衣芽孢桿菌LC高密度發(fā)酵生產(chǎn)桿菌肽的過程中，存在溢流代謝(圖1B，圖2B和圖4B)和溢流物質被重新利用的現(xiàn)象，這是芽孢桿菌碳分解代謝阻遏的具體表現(xiàn)形式[18]。VOIGT等[19]通過蛋白質組學研究了衣芽孢桿菌的生理狀態(tài)，也確定只要培養(yǎng)過程中有足夠的葡萄糖，以乙酸為主要代表的溢流代謝產(chǎn)物就會大量合成。DAUNER等[15]發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌在葡萄糖消耗殆盡后，乙酸可以經(jīng)乙酸激酶-磷酸轉乙酰酶生成乙酰-CoA進入三羧酸循環(huán)而被利用。另外，圖1(20～24 h)、圖2(24～28 h)和圖4(28～32 h)中，當乙偶姻含量下降時，乙酸卻在積累，說明該周期內可能存在乙偶姻向乙酸的轉化，這與WIEGAND等人[20]關于地衣芽孢桿菌中存在乙偶姻→乙酰-CoA→乙酰磷酸→乙酸代謝途徑的報道一致。

葡萄糖溶液的流加，主要促進了菌體生長，導致初級代謝旺盛，而桿菌肽合成受到抑制，對發(fā)酵產(chǎn)生了不利的影響。SILVA等[21]利用流式細胞儀進行了地衣芽孢桿菌的代謝組學分析，揭示了碳源種類、末端代謝產(chǎn)物對細胞的生理狀態(tài)的影響。在含有乳糖和葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)中，細胞代謝活力和膜完整性好于只含葡萄糖的對照組。

基料添加乳糖(1.5%)也影響了揮發(fā)性有機酸醇的代謝，遲效碳源-乳糖的添加雖然沒有消除細胞自溶(32 h，圖4A)，但是自溶時間比對照(28 h，圖1A)延后了4 h，也比流加葡萄糖(24 h，圖2A)延后了8 h。溢流分子明顯地促進了細胞在發(fā)酵后期的二次生長，細胞利用混合碳源的生長過程比對照延長了12 h(圖4A)，而且桿菌肽合成時間延長了8 h(對照為32 h，圖1A)。乳糖代謝后生成的葡萄糖和半乳糖在發(fā)酵中后期被利用，同樣產(chǎn)生溢流代謝，而且24 h乙酸濃度的回升是乳糖開始被利用的信號。說明在后期碳源不足時，乙酸作為碳源、能源儲備分子用于菌體生長代謝而發(fā)揮重要功能。

3.2結論

研究了混合碳源對地衣芽孢桿菌LC生長、代謝特征和對桿菌肽合成的影響，具體結論如下：

(1)地衣芽孢桿菌LC高密度發(fā)酵生產(chǎn)桿菌肽的過程存在碳代謝阻遏效應，溢流分子作為儲備碳源在發(fā)酵中后期被重新利用。

(2)發(fā)酵中后期菌體自溶和桿菌肽降解是由碳源不足造成的，而且乙酸是桿菌肽發(fā)酵后期主要的供能分子，這為下一步基于pH的補料工藝優(yōu)化提供了明確的窗口信息。

(3)發(fā)酵中期流加葡萄糖促進了細胞二次生長和溢流分子的產(chǎn)生，卻抑制桿菌肽的合成效率，葡萄糖不是桿菌肽補料發(fā)酵的最適碳源。

(4)基料添加乳糖(1.5%)延長細胞的生長周期、維持了桿菌肽的合成速率，顯著提高了桿菌肽的效價，是更有利于桿菌肽合成的補料碳源。

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EffectsofthemixedcarbonresourceadditiononbacitracinbiosynthesisbyBacilluslicheniformis

LIU Dao-qi1,CHEN Shou-wen2,LI Jun-hui3,CHEN Xiong1,WANG Zhi1*

1(Key Laboratory of Engineering (Ministry of Education),Hubei Collaborative Innovation Center for Industrial Fermentation, Hubei Key Laboratory of Industrial Microbiology,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China) 2(College of Life Sciences,Hubei University,Wuhan 430062,China) 3(Lifecome Biochemistry Co.LTD.,Pucheng 353400,China)

The effects of batch culture and glucose/lactose fed-batch culture on cell growth and bacitracin production byB.licheniformiswere studied in 10 L bioreactor. In the process of batch culture (the control), the maximum biomass and bacitracin production was 91×108CFU/mL at 28 h and 960 U/mL at 32 h, respectively. Glucose-fed batch culture from 20 h to 28 h facilitated the second growth, the peak biomass was 115×108CFU/mL at 24 h, which was 26% higher than that of the control. Nevertheless, the bacitracin synthesis efficiency was 17.2 U/(mL·h), which was only 53% of that before glucose feeding. Lactose addition in the production medium enhanced the maximum biomass to 110×108CFU/mL at 32 h, which was 20.6% higher than that of the control and was nearly the same as that of the glucose-fed batch culture. Meanwhile, bacitracin synthesis efficiency was maintained at 29 U/(mL·h) to 40 h, thus elevating bacitracin production to 1 143 U/mL that was 19% higher than the control.

Bacilluslicheniformis；bacitracin；glucose；lactose；overflow metabolism

碩士研究生(王志副教授為通訊作者，E-mail:476462848@qq.com)。

2017-03-07，改回日期：2017-05-24

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014242