王媛媛　　曹建　　萬(wàn)建華

[摘要] 目的 探討間隙性低氧環(huán)境下，磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/內(nèi)皮型一氧化氮合酶信號(hào)通路（PI3K-Akt-eNOS）在大鼠心肌缺血/再灌注損傷中的作用機(jī)制。 方法 64只大鼠隨機(jī)分為4組，假手術(shù)組（n=16）、缺血/再灌注組（n=16）、缺血/再灌注組-間歇性低氧組（n=16）、間歇性低氧-缺血/再灌注-磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑組（n=16）。采用球囊結(jié)扎冠狀動(dòng)脈方法制作心肌缺血再灌注動(dòng)物模型，將老鼠暴露在低氧循環(huán)制作間隙性低氧動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)處理結(jié)束后，通過(guò)TUNEL 法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，Western-Blot方法檢測(cè)磷酸化AKT蛋白（p-Akt）、磷酸化eNOS（p-eNOS）蛋白表達(dá)。 結(jié)果 與缺血/再灌注組比較，間歇性低氧+缺血/再灌注組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)為（21.73±4.56）%，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)減少，磷酸化AKt蛋白及磷酸化eNOS蛋白分別為（1.228±0.269）、（1.427±0.375），表達(dá)均升高，各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與間歇性低氧+缺血/再灌注組比較，間歇性低氧-缺血/再灌注組大鼠+磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑組大鼠心肌為（30.84±3.65），凋亡指數(shù)升高，磷酸化AKt蛋白及磷酸化eNOS蛋白分別為（0.624±0.146）、（0.842±0.246），表達(dá)均降低，各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 在間歇性低氧狀態(tài)下，PI3K-Akt-eNOS信號(hào)通路可以減少心肌細(xì)胞凋亡，在心肌缺血/再灌注損傷中具有保護(hù)機(jī)制。

[關(guān)鍵詞] 磷酯酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B/內(nèi)皮型一氧化氮合酶；間歇性低氧；心肌缺血/再灌注

[中圖分類(lèi)號(hào)] R541 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）27-0035-03

Effect of PI3K-Akt-eNOS signaling pathway on reducing myocardial ischemia-reperfusion injury after intermittent hypoxia in rats

WANG Yuanyuan1 CAO Jian2 WAN Jianhua3

1.Department of Cardiology， Nanchang Third Hospital， Nanchang 330009， China； 2.Department of Anesthesiology， Nanchang University Second Affiliated Hospital， Nanchang 330001， China； 3.Department of Anesthesiology， Jingdezhen Hospital of TCM in Jiangxi Province， Jingdezhen 333000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of phosphatidylinositol-3 kinase/protein kinase B/endothelial nitric oxide synthase （PI3K-Akt-eNOS） signaling pathway on reducing myocardial ischemia-reperfusion injury after intermittent hypoxia in rats. Methods 64 rats were randomly divided into 4 groups： sham operation group（n=16）， ischemia-reperfusion group（n=16）， ischemia-reperfusion-intermittent hypoxia group（n=16）， intermittent hypoxia-ischemia-reperfusion-phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor group（n=16）. The animal model of myocardial ischemia and reperfusion was established by balloon ligation of coronary artery. The rats were exposed to hypoxic circulation to produce intermittent hypoxic animal models. After the end of the experiment， the apoptotic index of myocardial cells was detected by TUNEL method， and the expression of phosphorylated Akt protein （p-Akt） and phosphorylated eNOS （p-eNOS） protein was detected by Western-Blot method. Results Compared with ischemia-reperfusion group， the apoptotic index of myocardial cells was（21.73±4.56）% in intermittent hypoxia+ischemia-reperfusion group. The myocardial cell apoptosis index was decreased， and phosphorylated Akt protein and phosphorylated eNOS protein were（1.228±0.269）， （1.427±0.375） respectively. The expressions were all increased， and the differences between groups were statistically significant（P<0.05）； compared with intermittent hypoxia+ischemia-reperfusion group， the myocardium of rats was（30.84±3.65）% in intermittent hypoxia+ischemia-reperfusion group+phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor group. The apoptosis index was increased， and the phosphorylated AKt protein and phosphorylated eNOS protein were（0.624±0.146）， （0.842±0.246） respectively. The expressions were all decreased and the differences between groups were statistically significant（P<0.05）. Conclusion Under the status of intermittent hypoxia， PI3K-Akt-eNOS signaling pathway can reduce myocardial ischemia-reperfusion injury by reducing the apoptosis of myocardial cells.endprint

[Key words] Phosphatidylinositol-3 kinase/protein kinase B/endothelial nitric oxide synthase （PI3K-Akt-eNOS）； Intermittent hypoxia； Myocardial ischemia-reperfusion

缺血的心肌再灌注時(shí)會(huì)起一系列心臟及其血管的惡性事件，例如嚴(yán)重的再灌注心律失常、組織水平無(wú)復(fù)流及心肌舒縮功能障礙等不良事件。對(duì)急性心肌梗死預(yù)后有直接影響的就是心肌缺血/再灌注損傷。缺血/再灌注損傷發(fā)生可能與炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、氧反常、鈣反常、pH 反常等原因有密切關(guān)系[1-3]，尋求再灌注治療時(shí)保護(hù)心肌的新靶點(diǎn)至關(guān)重要。目前研究表明，間歇性低氧對(duì)心肌缺血/再灌注損傷有保護(hù)作用，可以通過(guò)增加心臟對(duì)缺血、缺氧的耐受性來(lái)達(dá)到心臟保護(hù)的目的，在抗心肌缺血/再灌注損傷中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)擬討論在間歇性低氧狀態(tài)下，磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/內(nèi)皮型一氧化氮合酶（PI3K-Akt-eNOS）信號(hào)通路在大鼠心肌缺血/再灌注損傷中的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑

本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審查，許可證號(hào)[SCXK（贛）2009-0001]。選取8～10周健康清潔級(jí)SD大鼠64只，雌雄各半，體重（200±20）g，由南昌大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。磷酯酰肌醇-3激酶抑制劑（Wortmannin）渥曼青霉素購(gòu)自天津藥業(yè)焦作有限公司，Tunel 凋亡試劑檢測(cè)盒購(gòu)自德國(guó)Roche公司；小鼠p-eNOSp-Akt單克隆抗體、p-Akt抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；蛋白濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自普利萊公司；兔抗小鼠辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及模型建立

64只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組，制作大鼠缺血/再灌注損傷模型，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，10%水合氯醛麻醉大鼠，通過(guò)氣管插管、人工呼吸，然后開(kāi)胸結(jié)扎冠脈左前降支，收緊結(jié)扎線，30 min 后輕拉松結(jié)線，擴(kuò)開(kāi)血管，縫合[4]。通過(guò)低氧循環(huán)制作大鼠間歇性低氧模型：每日4次在低氧氧艙分別接受減壓低氧處理，每次接受2 min 6%～8%低氧，然后3 min再行氧和處理，循環(huán)5次，在低氧氧艙進(jìn)行間歇性低氧處理14 d，對(duì)照組選取含氧量正常的老鼠。假手術(shù)組（n=16），選取尾靜脈注射生理鹽水，絲線穿過(guò)冠狀動(dòng)脈左室支，不結(jié)扎；缺血/再灌注組（對(duì)照組，I/R）（n=16），制作大鼠缺血/再灌注模型。間歇性低氧+缺血/再灌注組（n=16，IH+I/R）：建立間歇性低氧動(dòng)物模型后，制作缺血/再灌注損傷模型；間歇性低氧+缺血/再灌注+PI3K抑制劑組（n=16，IH+I/R+PI3K抑制劑），建立間歇性低氧模型，制作缺血/再灌注模型時(shí)，在冠狀動(dòng)脈左前降支閉塞15 min前注射磷脂酰肌醇酯3激酶抑制劑（渥曼青霉素）（24 μg/kg，ip）。

1.3 TUNEL 法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡

依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)。使用標(biāo)記液做陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照選取脫氧核糖核酸酶處理切片。隨機(jī)在每張切片上選取10 個(gè)視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)。心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)/所有細(xì)胞個(gè)數(shù)的百分比。

1.4 通過(guò)Western blot法檢測(cè)p-eNOS、p-Akt蛋白表達(dá)

動(dòng)物模型制備結(jié)束后，處死存活大鼠。選取各組缺血區(qū)左心室全層心肌組織約20 mg，添加蛋白裂解液，隨后按步驟勻漿、裂解、提取總蛋白。各組提取蛋白樣品，先通過(guò)SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)膜，室溫下5%封閉2 h，再與稀釋的Actin抗體、p-Akt、p-eNOS在4℃孵育過(guò)夜（稀釋比例為1∶1000）。洗膜后孵育2 h（稀釋比例為1∶3000）；再次洗膜，通過(guò)電化學(xué)發(fā)光顯色曝光、拍照。以Actin作為內(nèi)對(duì)照，通過(guò)BIORAD 軟件分析蛋白條帶。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)

TUNEL 試劑盒檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，與假手術(shù)組比較，缺血/再灌注組可見(jiàn)較多TUNEL陽(yáng)性凋亡細(xì)胞，凋亡指數(shù)明顯升高（38.46±0.82）%；間歇性低氧處理后，心肌凋亡細(xì)胞明顯減少、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)下降（21.73±4.56）%；間歇性低氧+缺血/再灌注組+ PI3K抑制劑（渥曼青霉素）組處理后，凋亡指數(shù)增加（29.84±3.65）%，各實(shí)驗(yàn)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1及表2。

2.2心肌組織p-Akt、p-eNOS蛋白水平表達(dá)

Western blot 法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組Akt、p-eNOS蛋白表達(dá)，與假手術(shù)組比較，p-Akt、p-eNOS表達(dá)升高（P<0.05）；與IH+I/R組比較，IH+I/R+PI3K抑制劑組p-Akt、p-eNOS蛋白表達(dá)下降（P<0.05）。見(jiàn)表1、表2及封三圖4。

3 討論

目前缺血性心臟病的發(fā)病率位于原發(fā)性心臟病之首，其中心肌缺血再灌注損傷約占50%，是冠狀動(dòng)脈內(nèi)溶栓、冠脈搭橋以及介入治療中常見(jiàn)的嚴(yán)重并發(fā)癥[4-6]，如何減少心肌缺血/再灌注損傷已成為心肌保護(hù)的研究建立熱點(diǎn)之一。低氧是心肌缺血的主要因素，基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)研究所關(guān)注的熱點(diǎn)是如何通過(guò)增加心臟對(duì)低/缺氧及對(duì)缺血耐受性而達(dá)到保護(hù)心臟的目的。研究認(rèn)為通過(guò)長(zhǎng)期（如慢性低氧適應(yīng)）或短期缺血預(yù)適應(yīng)可以對(duì)心臟缺血出現(xiàn)保護(hù)作用[7]。但是對(duì)于相關(guān)信號(hào)通路、受體途徑以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等深層次的作用機(jī)制研究較少。

蘇氨酸激酶/磷脂酰肌醇-3激酶-絲氨酸（PI3K-Akt）可以抑制細(xì)胞凋亡，參與細(xì)胞增殖分化，是細(xì)胞生存的一種重要信號(hào)通路之一，在心肌缺血再灌注損傷機(jī)制中發(fā)揮重要作用。PI3K活化底物PI-3，4，5- P3（PIP3）與Akt結(jié)合，Akt被磷酸化而激活生成P-Akt，磷酸化的Akt具有抗凋亡、促細(xì)胞生存及促蛋白合成及等活性[8-10]。eNOS是合成NO的限速酶，含1203個(gè)氨基酸，其分子量為133 kDa，是由位于人類(lèi) 7號(hào)染色體7q35～7q36的NOS3基因編碼的蛋白，是p-Akt下游的重要底物之一，可激活蛋白激酶及線粒體ATP敏感性鉀離子通道，通過(guò)抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開(kāi)放，降低線粒體膜通透性。還通過(guò)抑制鈣超載，同時(shí)抑制線粒體釋放下游Caspase-9等凋亡因子的表達(dá)，改善線粒體功能，并促進(jìn)Bcl-2等抗凋亡因子的表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡[11-13]。同時(shí)eNOS是Akt下游的重要底物之一，有研究者認(rèn)為Akt磷酸化位點(diǎn)激活，是一氧化氮的重要來(lái)源，一氧化氮在血管舒張、血管重構(gòu)及生成及創(chuàng)傷愈合等方面發(fā)揮作用。在缺氧情況下，NO可通過(guò)磷脂酰肌醇3激酶或絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK） 信號(hào)通路誘導(dǎo)HIF-1產(chǎn)生，促進(jìn)新生血管，干擾代謝性適應(yīng)反應(yīng)以重新適應(yīng)缺血的生理環(huán)境[14]。還發(fā)現(xiàn)eNOS源性的一氧化氮可以減輕血小板和白細(xì)胞和血小板在細(xì)胞壁的粘附，減少細(xì)胞凋亡[15]。eNOS的高表達(dá)可參與血流的調(diào)節(jié)，減少炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)及抑制血管痙攣、防止細(xì)胞內(nèi)鈣超載等再灌注損傷。endprint

本實(shí)驗(yàn)建立了缺血/再灌注損傷及間歇性低氧模型，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過(guò)間歇性低氧預(yù)處理，PI3K-Akt信號(hào)途徑激活，心肌細(xì)胞凋亡降低，p-Akt及eNOS蛋白表達(dá)增加。在使用PI3K抑制劑后，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)增加，-Akt及eNOS蛋白表達(dá)降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示間歇性低氧處理后，激活PI3K-Akt信號(hào)途徑被激活，p-AKt表達(dá)增加，與此同時(shí)下游底物eNOS蛋白表達(dá)增加，減輕心肌細(xì)胞凋亡，這一效應(yīng)可被PI3K特異性抑制劑渥曼青霉素拮抗，提示在間歇性低氧狀態(tài)下，通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路，激活P-Akt及活化內(nèi)皮型一氧化氮合酶，這些下游底物可能通過(guò)提高抗凋亡蛋白表達(dá)，抑制促凋亡蛋白等機(jī)制降低心肌細(xì)胞凋亡率，從而在缺血/再灌注損傷中起到保護(hù)作用。

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（收稿日期：2017-06-15）endprint