譚鵬，鄧雯韜，田宇，蘇益，藺萬煌*

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商陸與擬南芥//家族基因的比較分析

譚鵬1,2，鄧雯韜1,2，田宇1,2，蘇益1,2，藺萬煌1,2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物激素與生長(zhǎng)發(fā)育湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙 410128；2.南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長(zhǎng)沙 410128)

為探明商陸高親和性K+轉(zhuǎn)運(yùn)體基因()的結(jié)構(gòu)、功能及商陸耐低鉀的原因，分析比較了商陸和擬南芥家族基因中15個(gè)基因編碼的高親和性鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體氨基酸序列、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其理化性質(zhì)。結(jié)果表明：基因家族編碼蛋白均定位于細(xì)胞膜上，含有多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)且跨膜結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域；PaHAK1與AtKUP3的跨膜結(jié)構(gòu)十分相似，低鉀脅迫下和的高表達(dá)與其高親和鉀轉(zhuǎn)運(yùn)吸收功能密切相關(guān)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，PaHAK1與擬南芥基因家族中AtKUP8親緣關(guān)系最近，其氨基酸序列相似度為76.98%，推測(cè)還可能通過維持細(xì)胞內(nèi)高水平鉀量在水分脅迫下發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

商陸；擬南芥；；；高親和性鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體；生物信息學(xué)分析

鉀離子對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育及維持細(xì)胞滲透壓有重要作用。中國(guó)土壤和作物中的鉀素含量普遍偏低[1–2]。利用已獲得的K+吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因，可以改善作物的鉀素營(yíng)養(yǎng)性狀，提高對(duì)環(huán)境中鉀素的利用率[3]。嚴(yán)蔚東等[4]在利用異源基因資源改良作物鉀素營(yíng)養(yǎng)特性領(lǐng)域進(jìn)行了探索，其將和導(dǎo)入水稻，獲得的轉(zhuǎn)基因植株在低鉀和高鉀條件下的鉀累積能力都有所提高。GUPTA等[5]從水稻中克隆到27個(gè)鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體家族基因，為通過基因工程的方法提高作物中這些基因的表達(dá)水平和改良鉀營(yíng)養(yǎng)性狀打下了基礎(chǔ)。商陸(Roxb)吸收和富集鉀的能力非常突出，特定環(huán)境中其含鉀量最高可達(dá)到植株干物質(zhì)質(zhì)量的10%以上，又能在K+濃度極低(微摩爾水平)的土壤中正常生長(zhǎng)發(fā)育[6]。為深入探討商陸基因功能，本研究中將獲得的商陸基因與擬南芥家族基因進(jìn)行比較分析，旨在揭示商陸鉀素高效吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制，利用商陸高親和性K+吸收轉(zhuǎn)運(yùn)基因進(jìn)行作物鉀素營(yíng)養(yǎng)性狀遺傳改良，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1　商陸HAK1及擬南芥HAK/KUP/KT基因家族基因的獲得

商陸基因由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物激素與生長(zhǎng)發(fā)育湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室克隆并提供相關(guān)信息[7]。擬南芥基因家族的mRNA序列以及編碼的蛋白質(zhì)序列從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm. nih.gov/)獲得。

1.2　擬南芥HAK/KUP/KT基因家族染色體定位及基因結(jié)構(gòu)分析

從NCBI中獲取染色體定位信息，利用MapDraw V 2.1進(jìn)行染色體定位作圖。

1.3　商陸HAK1及擬南芥HAK/KUP/KT基因家族基因蛋白質(zhì)序列生物信息學(xué)分析

采用在線工具Protparam(http://web.expasy.org/ protparam/)對(duì)商陸及擬南芥基因編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的氨基酸序列、數(shù)量、等電點(diǎn)、分子量[8]。亞細(xì)胞定位采用在線軟件PSORT(http://www.genscript. com/tools/psort/)進(jìn)行預(yù)測(cè)。應(yīng)用結(jié)構(gòu)域在線分析軟件SMART(http://smart.embl.de/)對(duì)保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行驗(yàn)證和功能注釋?？缒そY(jié)構(gòu)采用在線軟件TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM–2.0/)進(jìn)行分析。蛋白跨膜結(jié)構(gòu)模型采用PROTTER(http://wlab. ethz.ch/protter/start/)建立[9]。

1.4　商陸HAK1及擬南芥HAK/KUP/KT基因家族基因系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

使用Clustal X 軟件對(duì)擬南芥中已知的15個(gè)基因家族蛋白及商陸基因編碼蛋白進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果通過MEGA6軟件生成進(jìn)化樹。進(jìn)化樹的構(gòu)建采用最大簡(jiǎn)約法(maximum parsimony，MP)，Bootstrap值設(shè)置為1 000[10]。

2　結(jié)果與分析

2.1　HAK/KUP/KT家族基因染色體定位及基因結(jié)構(gòu)分析

從表1可以看出，所有基因都包含6個(gè)以上的內(nèi)含子，其長(zhǎng)度表現(xiàn)出較大差異，外顯子數(shù)不同，因此擬南芥基因家族基因的結(jié)構(gòu)存在較大差異。對(duì)已獲取的基因信息利用MapDraw V 2.1進(jìn)行染色體定位作圖，結(jié)果(圖1)表明，基因家族在擬南芥1~5號(hào)染色體上均有分布，其中，4號(hào)染色體有6個(gè)基因家族基因，2號(hào)染色體有4個(gè)，1號(hào)和5號(hào)染色體各有2個(gè)，3號(hào)染色體上只有1個(gè)。

表1　擬南芥HAK鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的基本信息及結(jié)構(gòu)

圖1　擬南芥HAK/KUP/KT基因家族染色體定位

2.2　HAK/KUP/KT基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

基因編碼蛋白的基本理化性質(zhì)以及亞細(xì)胞定位見表2。PSORT預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，編碼一個(gè)含有771個(gè)氨基酸的蛋白，其分子式為C3980H6199N1003O1092S34，分子量為86 662.11，等電點(diǎn)為7.54，包含帶正電殘基(Arg + Lys)72個(gè)，帶負(fù)電殘基(Asp + Glu)71個(gè)。進(jìn)一步分析得到該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為38.46，脂肪系數(shù)為107.94，說明編碼蛋白為穩(wěn)定蛋白，且在不同環(huán)境中穩(wěn)定性較好；平均親水性系數(shù)為0.269，大于0，說明該蛋白屬于疏水蛋白。基因編碼蛋白的氨基酸殘基數(shù)為593~880，最長(zhǎng)的KT5含有880個(gè)氨基酸殘基，最短的KUP1只含有592個(gè)氨基酸殘基?；蚣易宕蠖鄶?shù)蛋白質(zhì)都屬于疏水蛋白，只有KT1、KT2/3和KT5為親水性蛋白。擬南芥基因家族中有9個(gè)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好，只有KT2、KT3、KUP3、KUP6、KUP7、KUP10在不同環(huán)境中穩(wěn)定性較差。

表2　HAK/KUP/KT基因編碼蛋白的基本理化性質(zhì)分析

2.3　HAK/KUP/KT基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)域分析

采用SMART和TMHMM預(yù)測(cè)基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域及跨膜結(jié)構(gòu)域的結(jié)果(圖2)表明，商陸和擬南芥基因家族成員的蛋白含有多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，除以外，其他的成員都只有跨膜結(jié)構(gòu)。對(duì)比保守結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域可以看出，商陸以及擬南芥基因家族中的跨膜結(jié)構(gòu)是蛋白保守結(jié)構(gòu)。

保守結(jié)構(gòu)域中藍(lán)色示跨膜結(jié)構(gòu)(transmembrane region)；黃色cNMP示與蛋白質(zhì)結(jié)合的環(huán)核苷酸(cyclic nucleotide–monophosphate binding domain)；綠色ANK示錨定蛋白重復(fù)序列(ankyrin repeats)；紫色示低復(fù)雜性區(qū)域(low complexity region)?？缒そY(jié)構(gòu)域中紅色示跨膜結(jié)構(gòu)(transmembrane region)；藍(lán)色示細(xì)胞內(nèi)(intracellular)；紫色示細(xì)胞外(extracellular)。

2.4 HAK/KUP/KT基因編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)模型

對(duì)基因編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果(圖3)顯示，不同蛋白跨膜次數(shù)有一定差異，但結(jié)構(gòu)類似。16個(gè)HAK蛋白跨膜結(jié)構(gòu)可初步分為3種模型：第1種模型，在第2和第3個(gè)跨膜區(qū)之間擁有一個(gè)較長(zhǎng)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(圖3–A)，共有11個(gè)蛋白具有這種結(jié)構(gòu)；第2種模型，在第1和第2個(gè)跨膜區(qū)之間擁有一個(gè)較長(zhǎng)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(圖3–B)，PaHAK1和AtKUP3屬于此種模型；第3種模型，沒有明顯的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(圖3–C)，AtKT2/3、AtKUP1屬于此種模型。

2.5　HAK/KUP/KT基因編碼蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

采用鄰接法和最小進(jìn)化法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹具有一樣的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建的系統(tǒng)樹也具有類似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，但由于Bootstrap值有的低于70，所以采用了最大似然法(maximum likelihood，ML)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)由圖4可知，Bootstrap的值都大于70%，構(gòu)建的進(jìn)化樹可靠。

進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，PaHAK1與AtKUP8、AtKUP6親緣關(guān)系最近，其氨基酸序列相似度分別為76.98%、73.15%。從結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)PaHAK1和AtKUP8蛋白結(jié)構(gòu)也相似。PaHAK1與AtKT1、AtKT2–3、AtKT5親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)，從序列比對(duì)結(jié)果看相似度均小于15%。

圖4 擬南芥及商陸鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3　結(jié)論與討論

基因家族是H+/K+同向轉(zhuǎn)運(yùn)載體，主要負(fù)責(zé)植物根部細(xì)胞對(duì)K+的高親和吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)[11–13]，作為最大的K+吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)功能基因家族，基因家族已被證實(shí)參與調(diào)控植物體多種生理過程。前人的研究結(jié)果顯示，的關(guān)鍵作用是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鉀離子的積累[14]?；虺嗽谥参锔斜磉_(dá)外，在植物其他器官中都有特定表達(dá)，這表明K+轉(zhuǎn)運(yùn)體基因不僅在根中介導(dǎo)K+吸收，同時(shí)也與植物體內(nèi)K+的轉(zhuǎn)運(yùn)、維持細(xì)胞內(nèi)外K+動(dòng)態(tài)平衡相關(guān)[15]。在外界環(huán)境K+濃度較低時(shí)，在介導(dǎo)擬南芥根部吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)K+的過程中發(fā)揮著重要的作用。具有雙親和K+轉(zhuǎn)運(yùn)功能；基因是低親和K+轉(zhuǎn)運(yùn)體基因，可以參與調(diào)控細(xì)胞的伸長(zhǎng)和生長(zhǎng)[16]；基因在根毛細(xì)胞中有特異表達(dá)，可以調(diào)節(jié)擬南芥根部K+的吸收，缺失該基因會(huì)使植物根系喪失向下生長(zhǎng)的特性[17]。本研究結(jié)果表明，PaHAK1氨基酸序列與AtKUP8同源性非常高，KUP6和KUP8參與擬南芥根系鉀離子外流、平衡鉀穩(wěn)態(tài)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和干旱脅迫反應(yīng)中的滲透調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用[18]。由此推測(cè)PaHAK1是通過平衡鉀穩(wěn)態(tài)對(duì)水分脅迫、干旱脅迫發(fā)揮滲透調(diào)節(jié)作用。

本研究結(jié)果表明，商陸PaHAK1是一個(gè)疏水蛋白，含有11個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，具有鉀離子吸收轉(zhuǎn)運(yùn)體的普遍特征。商陸耐低鉀能力強(qiáng)，這與植物在低鉀條件下的強(qiáng)吸鉀能力密不可分。是高親和性鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體，基因的表達(dá)受到鉀離子濃度的影響, 隨著鉀離子濃度升高, 其表達(dá)量降低, 缺鉀和低鉀都能誘導(dǎo)基因在根中高表達(dá)[19]。有研究[7]表明，商陸中在根中的表達(dá)量受環(huán)境中鉀離子濃度的影響，環(huán)境中鉀離子濃度低時(shí)能誘導(dǎo)的高表達(dá)。另外，在商陸的莖葉中也有少量表達(dá)，其在莖葉中的表達(dá)量不會(huì)因?yàn)榄h(huán)境中的鉀離子濃度變化而變化，因此推測(cè)主要參與商陸根部鉀離子的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)。

本研究結(jié)果表明，PaHAK1與AtKUP3的跨膜結(jié)構(gòu)十分相似，在第1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)與第2個(gè)的跨膜結(jié)構(gòu)之間有一個(gè)比較長(zhǎng)的非結(jié)構(gòu)域部分，這一部分會(huì)形成一個(gè)較長(zhǎng)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這與其他的擬南芥基因家族蛋白結(jié)構(gòu)的第2和第3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)之間有環(huán)狀結(jié)構(gòu)不同。KIM等[20]的研究結(jié)果表明，在受到低鉀脅迫時(shí)，在根中的表達(dá)量轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，推測(cè)在低鉀脅迫下商陸和擬南芥的高表達(dá)與其高親和鉀轉(zhuǎn)運(yùn)吸收功能相關(guān)。

植物根系對(duì)植物獲取環(huán)境中的K+起決定性作用。商陸能夠在低鉀的條件下正常生長(zhǎng)發(fā)育與鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體基因相關(guān)。在商陸根部能高表達(dá)，且具有高效的K+吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。在根中的表達(dá)量受環(huán)境中鉀離子濃度的影響，環(huán)境中K+濃度低時(shí)能誘導(dǎo)的高表達(dá)，并介導(dǎo)對(duì)K+的高效吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)。

[1] 陳防，魯劍巍，萬運(yùn)帆，等．長(zhǎng)期施鉀對(duì)作物增產(chǎn)及土壤鉀素含量及形態(tài)的影響[J]．土壤學(xué)報(bào)，2000，37(2)：233–241．

[2] 冀宏杰，張懷志，張維理，等．我國(guó)農(nóng)田土壤鉀平衡研究進(jìn)展與展望[J]．中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，25(6)：920–930．

[3] 王毅，武維華．植物鉀營(yíng)養(yǎng)高效分子遺傳機(jī)制[J]．植物學(xué)報(bào)，2009，44(1)：27–36．

[4] 嚴(yán)蔚東，王校常，何鍶潔，等．利用外源鉀通道基因改良水稻鉀素營(yíng)養(yǎng)[J]．中國(guó)水稻科學(xué)，2002，16(1)：77–79．

[5] GUPTA M，QIU X，WANG L，et al．potassium transporters gene family and their whole–life cycle expression profile in rice ()[J]. Molecular Genetics and Genomics，2008，280(5)：437–488．

[6] 胡篤敬，董任瑞，葛旦之．植物鉀營(yíng)養(yǎng)的理論與實(shí)踐[M]．長(zhǎng)沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社，1993．

[7] 藺萬煌，馬立英，蘇益，等．商陸高親和性K+轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的克隆與表達(dá)分析[J]．植物生理學(xué)報(bào)，2011，47(1)：91–96．

[8] ARTIMO P，JONNALAGEDDA M，ARNOLD K，et al. ExPASy：SIB bioinformatics resource portal[J]．Nucleic Acids Research，2012，40 (1)：597–603．

[9] BACEVATVIS A D，OUELILETTE B F F．生物信息學(xué)——基因和蛋白質(zhì)分析的實(shí)用指南[M]．李衍達(dá)，孫之榮，譯．北京：清華大學(xué)出版社，2000．

[10] TAMURA K，STECHER G，PETERSON D，et al. MEGA6：molecular evolutionary genetics analysis version 6．0[J]．Molecular Biology and Evolution，2013，30 (12)：2725–2729．

[11] SU Y，LUO W，LIN W，et al．Model of cation transportation mediated by high–affinity potassium transporters () in higher plants[J]．Biological Procedures Online，2015，17(1)：9–13．

[12] HE C，CUI K，DUAN A，et al．Genome–wide and molecular evolution analysis of the poplarpotassium transporter gene family[J]．Ecology & Evolution，2012，2(8)：1996–2004．

[13] AHN S J，SHIN R，SCHACHTMAN D P．Expression ofgenes inand the role of root hairs in K+uptake[J]．Plant Physiology，2004，134(3)：1135–1145．

[14] GIERTH M，SCHRODER J I．The potassium transporterfunctions in K+deprivation–induced high– affinity Kuptake andK+channel contribution to K+uptake kinetics inroots[J]．Plant Physiology, 2005，137(3)：1105–1114．

[15] SONG Z Z，YANG Y，MAR J，et al．Transcription of potassium transporter genes offamily in peach seedlings and responses to abiotic stresses[J]. Biologia Plantarum，2015，59(1)：65–73．

[16] ELUMALAI R P，NAGPAL P，REED J W．A mutation in thepotassium transporter gene affects shoot cell expansion [J]．Plant Cell，2002，14(1)：119–131．

[17] RIGAS S，HATZOPOULOS P．encodes a potassium transporter required for tip growth inroot hairs [J]．Plant Cell，2001，13(1)：139–151．

[18] OSAKABE Y，ARINAGA N，UMEZAWA T，et al. Osmotic stress responses and plant growth controlled by potassium transporters in[J]．Plant Cell，2013，25(2)：609–624．

[19] SU Y，LUO W，ZHAO X，et al．Functional analysis of a high–affinity potassium transporterfromby overexpression in eukaryotes[J]. Plant and Soil，2015，397(1)：1–11．

[20] KIM E J，KWAK J M，UOZUMI N，et al．：Angene encoding high–affinity potassium transport activity[J]．Plant Cell，1998，10(1)：51–62．

責(zé)任編輯：尹小紅

英文編輯：梁和

Comparative analysis ofgene family inandin

TAN Peng1,2, DENG Wentao1,2, TIAN Yu1,2, SU Yi1,2, LIN Wanhuang1,2*

(1.Hunan Provincial Key Laboratory of Phytohormones and Growth Development, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2.Southern Regional Collaborative Innovation Center for Grain and Oil Crops in China, Changsha 410128, China)

In order to explore the structure and function of the high affinity potassium transporter gene ofRoxb() and analyze the reasons of toleranceto low potassium inRoxb, the amino acid sequences and protein structures and physicochemical properties of 15 high affinity potassium ion transporters ingene family ofandofRoxb were comparedThe results showed that all coding proteins were orientated on cell membrane, and they contained multiple transmembrane domain with conserve amino acid sequences. The transmembrane structure of PaHAK1 was very similar to that of AtKUP3, and the high expression ofandunder low potassium stress was closely related to the high affinity potassium transport and absorption function. Phylogenetic analysis showed that PaHAK1 had the closest evolutionary relationship with AtKUP8 ingene families. Their amino acid sequences similarity was 76.98%. It is suggested thatalso plays an important regulatory role under water stress by maintaining a high level of intracellular potassium.

Roxb;;;; high–affinity K+transporter; bioinformatics analysis

Q943.2

A

1007-1032(2017)05-0490-06

2017–04–10

2017–09–15

湖南省教育廳高校創(chuàng)新平臺(tái)開放基金資助項(xiàng)目(15K061)

譚鵬(1991—)，女，湖南望城人，碩士研究生，主要從事植物礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究，695313374@qq.com；*通信作者，藺萬煌，博士，教授，主要從事植物生長(zhǎng)發(fā)育與礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究，linwhat@163.com

投稿網(wǎng)址：http://xb.hunau.edu.cn