劉秀斌，湯敏娜，黃嘉璐，曾建國(guó)*

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基于生源合成途徑代謝產(chǎn)物質(zhì)證黃花菜中含秋水仙堿

劉秀斌1a,2，湯敏娜1b#，黃嘉璐2，曾建國(guó)1a,2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)a.園藝園林學(xué)院；b.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；2.湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長(zhǎng)沙410128)

基于已解析的秋水仙中秋水仙堿生源合成途徑，采用–四級(jí)桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC–Q/TOF MS)方法，檢測(cè)黃花菜和秋水仙樣本中秋水仙堿生源合成途徑中的中間代謝產(chǎn)物(以下簡(jiǎn)稱中間代謝物)。結(jié)果從黃花菜樣本中未檢出中間代謝物和終產(chǎn)物秋水仙堿，而在秋水仙樣本中均能檢出中間代謝物和秋水仙堿，其中的中間代謝物秋水仙胺(Cp5)、去乙?；锼蓧A(Cp6)和終產(chǎn)物秋水仙堿(Cp7)已進(jìn)一步經(jīng)對(duì)照品確證，因此認(rèn)為食用黃花菜中不存在秋水仙堿的生源合成途徑，也不含秋水仙堿。

黃花菜；秋水仙堿；生源合成途徑；中間代謝產(chǎn)物

黃花菜(Baroni)又稱忘憂草、金針菜、檸檬萱草，屬于百合科萱草屬植物。有報(bào)道[1]認(rèn)為新鮮黃花菜中含有秋水仙堿，如果加工處理不當(dāng)，食用新鮮黃花菜后會(huì)出現(xiàn)頭痛、惡心、嘔吐、腹瀉等癥狀。本課題組前期采用HPLC–Q/ TOF MS方法，對(duì)采集于9個(gè)不同產(chǎn)地的食用黃花菜不同部位的新鮮樣、凍干樣和烘干樣(共156個(gè)樣品)進(jìn)行分析，均未檢出秋水仙堿，已初步證實(shí)了食用黃花菜中不含秋水仙堿[2]。

NASREEN等[3–7]的研究表明，秋水仙堿在秋水仙植株內(nèi)最初是由多巴胺和4–羥基苯丙醛縮合反應(yīng)生成Autumnaline (秋麗堿，Cp1)，再經(jīng)過(guò)Isoandro- cymbine(Cp2)→–Methylandrocymbine(Cp3)→– Formyldemecolcine(–甲酰秋水仙胺，Cp4)→ Demecolcine(秋水仙胺，Cp5)→Deacetylcolchicine (去乙?；锼蓧A，Cp6)→Colchicine (秋水仙堿，Cp7)的生源途徑合成，得到終產(chǎn)物秋水仙堿。

根據(jù)已解析的秋水仙中秋水仙堿生源合成途徑，可以清楚了解秋水仙堿生源合成前體化合物的結(jié)構(gòu)。若黃花菜中存在秋水仙堿，則應(yīng)該存在對(duì)應(yīng)的秋水仙堿生源合成途徑，那么黃花菜中參與秋水仙堿生源合成的中間代謝物必然會(huì)在植物體內(nèi)留下印跡而被儀器所檢識(shí)。本試驗(yàn)中采用靈敏度高、專(zhuān)屬性強(qiáng)的HPLC–Q/TOF MS檢測(cè)方法，對(duì)黃花菜樣品中的秋水仙堿生源合成中間代謝物進(jìn)行檢識(shí)，旨在從生源合成途徑的角度進(jìn)一步探尋黃花菜中是否存在秋水仙堿。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑及儀器設(shè)備

試驗(yàn)材料：黃花菜(Baroni，沖里花，湖南祁東)的花蕾；秋水仙(Pleniflorum，玫瑰重瓣秋水仙，英國(guó))的球莖。另外有四川渠縣、甘肅大慶、陜西大荔、山西大同、湖南長(zhǎng)沙、遼寧沈陽(yáng)、德國(guó)、江蘇等不同產(chǎn)地的黃花菜不同部位(根、莖、葉、花)的156個(gè)試驗(yàn)材料，其詳細(xì)信息見(jiàn)文獻(xiàn)[2]。

對(duì)照品：秋水仙胺(Cp5，Toronto Research Chemicals，批號(hào)為D230785)；去乙?；锼蓧A(Cp6，Toronto Research Chemicals，批號(hào)為D198920)；秋水仙堿(Cp7，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為101176–201202)。

主要試劑：甲醇、超純水、乙腈(色譜級(jí)，默克化工技術(shù)(上海)有限公司)；無(wú)水乙醇(分析純，安徽安特生物化學(xué)有限公司)；甲酸(色譜級(jí)，美國(guó)天地有限公司(上海))。

主要儀器設(shè)備：超高效液相色譜–四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀(1290–6530，安捷倫科技有限公司，美國(guó))；冷凍干燥機(jī)(18N，寧波新芝生物科技股份有限公司，浙江)；冷凍離心機(jī)(5430R，艾本德公司，德國(guó))；超純水制備儀(Milli–Q Advantage A10 系統(tǒng)，密理博公司，美國(guó))；粉碎機(jī)(YS–02，北京燕山正德機(jī)械設(shè)備有限公司，北京)；超聲波清洗器(KQ– 5200DE，昆山市超聲儀器有限公司，浙江)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG–9246A型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，上海)；分析天平(梅特勒–托利多儀器有限公司，上海)；色譜柱(Xaqua C18，華譜新創(chuàng)科技有限公司，浙江)；無(wú)菌注射器(5 mL，圣光醫(yī)用制品有限公司，河南)；0.22 μm有機(jī)相/水相通用針式濾器及樣品瓶(北京八方世紀(jì)科技有限公司，北京)；移液槍(艾本德公司，德國(guó))。

1.2　方法

1.2.1對(duì)照品溶液的制備

用分析天平分別精密稱取秋水仙胺、–去乙?；锼蓧A、秋水仙堿對(duì)照品各0.005 00 g，分別置于25 mL棕色容量瓶中，用甲醇超聲溶解冷卻至室溫后定容至刻度，搖勻，即得0.2 mg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別取50 μL秋水仙胺、–去乙?；锼蓧A、秋水仙堿儲(chǔ)備液至10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得1 μg/mL 對(duì)照品溶液，備用。

1.2.2供試品溶液的制備

取新鮮的試驗(yàn)材料30 g，經(jīng)液氮預(yù)冷后粉碎，即刻用分析天平精確稱取5.000 g，置于具塞磨口錐形瓶中，加入85%乙醇35 mL，密塞封膜并振蕩均勻，在25 ℃下超聲提取2 h(功率250 W，頻率50 kHz)后靜置2 min，取10 mL上清液至具塞離心管中，用冷凍離心機(jī)離心(25 ℃，6 700 r/min)10 min，隨后用無(wú)菌注射器吸取2 mL上清液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，濾液置于液相小瓶中，備用[2]。

1.2.3HPLC–DAD–Q/TOF MS檢測(cè)[2]

色譜條件：色譜柱，華譜X–aqua C18(2.1 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相，水相(A)為0.1%甲酸，有機(jī)相(B)為0.1%甲酸乙腈；梯度洗脫程序?yàn)?～3 min，90%～85% A，3～8 min，85%～70% A，8～16 min，70%～35% A，16～21 min，35%～5% A，21～25 min 5% A，25.1~30 min 90% A；柱溫35 ℃；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜條件：離子源為Dual AJS ESI源；采用正離子全掃描模式；掃描范圍100~1 000；鞘氣溫度350 ℃；鞘氣流速11.0 L/min；干燥氣溫度345 ℃；干燥氣壓力0.31 MPa；干燥氣流速10 L/min；毛細(xì)管電壓4 000 V；碎裂電壓135 V；干燥氣和鞘氣均為高純氮?dú)狻?/p>

1.2.4數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采集、處理軟件為Agilent MassHunter Workstation Software (B.05.00)。數(shù)據(jù)處理方法：在樣品的總離子流色譜圖(TIC)中分別提取秋麗堿(Cp1)、Isoandrocymbine(Cp2)、–Methylandrocymbine (Cp3)、–甲酰秋水仙胺(Cp4)、秋水仙胺(Cp5)、–去乙?；锼蓧A(Cp6)、秋水仙堿(Cp7)的[M+H]+理論精確分子量()374.196 2、372.180 5、386.196 2、400.175 5372.180 5、358.164 9、400.175 5，質(zhì)量偏差范圍為0.002 5。

若能在樣品TIC中提取出Cp5、Cp6和Cp7的離子色譜峰(EIC)，且EIC中保留時(shí)間()與Cp5、Cp6和Cp7的對(duì)照品的保留時(shí)間一致，EIC中的精確分子量與Cp5、Cp6和Cp7的對(duì)照品的精確分子量一致，則認(rèn)為樣品中存在秋水仙胺、–去乙?；锼蓧A和秋水仙堿；反之，則不存在。

若樣品中能提取Cp1、Cp2、Cp3和Cp4離子色譜峰(EIC)，對(duì)EIC中一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的高分辨質(zhì)量數(shù)采用Masshunter軟件中Genreate Formulas From Spectrum Peaks功能生成分子式，若生成的分子式與理論分子式一致，且同位素豐度和高分辨質(zhì)量數(shù)匹配分?jǐn)?shù)大于90，則認(rèn)為樣本中可能存在該化合物；反之，則不存在。

2　結(jié)果與分析

2.1　對(duì)照品HPLC–DAD–Q/TOF MS定性分析結(jié)果

秋水仙胺(Cp5)、–去乙?；锼蓧A(Cp6)、秋水仙堿(Cp7)對(duì)照品按1.2.1制備，并按1.2.3中色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行LC–MS檢測(cè)，Cp5、Cp6、Cp7對(duì)照品總離子流色譜圖及質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

2.2　秋水仙樣本中秋水仙堿生源合成中間代謝產(chǎn)物的HPLC–Q/TOF MS定性分析

秋水仙樣本按1.2.2制備成供試液，并按1.2.3色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行LC–MS檢測(cè)，按照1.2.4進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果(圖2)顯示，從秋水仙球莖樣本總離子流圖中能提取出中間代謝產(chǎn)物秋麗堿(Cp1)、Isoandrocymbine (Cp2)、–Methylandrocymbine (Cp3)、–甲酰秋水仙胺(Cp4)、秋水仙胺(Cp5)、去乙酰基秋水仙堿(Cp6)及終產(chǎn)物秋水仙堿(Cp7)的[M+H]+精確分子量的提取離子色譜峰，中間代謝物Cp1、Cp2、Cp4、Cp5、Cp6及終產(chǎn)物 Cp7均存在同分異構(gòu)體色譜峰，其中Cp5、Cp6和Cp7進(jìn)一步經(jīng)對(duì)照品保留時(shí)間和精確質(zhì)量數(shù)確證，分別是保留時(shí)間為9.08、8.70、11.29 min的色譜峰。另外，中間代謝物Cp1、Cp2、Cp3、Cp4檢出的EIC質(zhì)譜圖中的目標(biāo)高分辨質(zhì)量數(shù)生成分子式分別為C21H27NO5、C21H25NO5、C22H27NO5、C22H25NO6，且匹配分?jǐn)?shù)均大于95，與文獻(xiàn)[4–6]報(bào)道的分子式一致。以上試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明秋水仙樣本中存在秋水仙堿生源合成途徑中直接前體Cp6和中間體Cp5，還很有可能存在秋水仙堿生源合成的其他前體化合物Cp1、Cp2、Cp3、Cp4。

2.3　黃花菜中秋水仙堿生源合成途徑中間代謝產(chǎn)物的HPLC–Q/TOF MS定性分析

結(jié)果(圖3)顯示，從黃花菜新鮮花樣本總離子流圖中沒(méi)有提取出中間代謝物秋麗堿(Cp1)、Isoandrocymbine(Cp2)、–Methylandrocymbine (Cp3)、–甲酰秋水仙胺(Cp4)、秋水仙胺(Cp5)、去乙酰基秋水仙堿(Cp6)及終產(chǎn)物秋水仙堿(Cp7)精確分子量的提取離子色譜峰，說(shuō)明在黃花菜新鮮花樣本中未能檢出已報(bào)道秋水仙堿生源合成途徑中的中間代謝產(chǎn)物。另外對(duì)本課題組前期報(bào)道的來(lái)源于9個(gè)不同產(chǎn)地的156個(gè)食用黃花菜不同部位的新鮮樣、凍干樣和烘干樣[2]進(jìn)行秋水仙堿生源合成中間代謝物分析，結(jié)果均未檢出秋水仙堿生源合成中間代謝物，說(shuō)明食用黃花菜中不存在秋水仙堿生源合成途徑中的中間代謝產(chǎn)物，亦不存在秋水仙堿的生源合成途徑。

“ND”示未檢出。

3　結(jié)論

筆者采用HPLC–Q/TOF MS分析方法，對(duì)黃花菜樣本中秋水仙堿生源合成中間代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在供試黃花菜樣本中均未檢出已報(bào)道的秋水仙堿生源合成途徑中的中間代謝產(chǎn)物及終產(chǎn)物秋水仙堿，而在秋水仙的球莖樣本中均能檢出這些物質(zhì)。結(jié)合本課題組前期報(bào)道的在大量黃花菜樣本中均未檢出秋水仙堿[2]的結(jié)果，認(rèn)為從秋水仙堿生源合成途徑的角度再一次證明了食用黃花菜中不存在秋水仙堿。

[1] 關(guān)穎．中毒患者血清中秋水仙堿的快速檢驗(yàn)[J]．中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2001(5)：625–626．

[2] 湯敏娜，劉秀斌，黃嘉璐，等．食用黃花菜中含秋水仙堿的質(zhì)證研究[J]．中草藥，2016(18)：3293–3300．

[3] NASREEN A，RUEFFER M，ZENK M H．Cytochrome P–450–dependent formation of isoandrocymbine from autumnaline in colchicine biosynthesis[J]．Tetrahedron Letters，1996，37(45)：8161–8164．

[4] BARKER A C，JULIAN D R，RAMAGE R，et al. Biosynthesis．Part 28．Colchicine：definition of intermediates between–methylandrocymbine and colchicine and studies on speciosine[J]．Journal of the Chemical Society–Perkin Transactions 1，1998(18)：2989–2994．

[5] WOODHOUSE R N，MCDONALDE，RAMAGE R，et al．Biosynthesis．Part 29．Colchicine：studies on the ring expansion step focusing on the fate of the hydrogens at C–3 of autumnaline[J]．Journal of the Chemical Society–Perkin Transactions 1，1998(18)：2995–3001．

[6] SHELDRAKE P W，SUCKLING K E，WOODHOUSE R N，et al．Biosynthesis．Part 30．Colchicine：studies on the ring expansion step focusing on the fate of the hydrogens at C–4 of autumnaline[J]．Journal of the Chemical Society–Perkin Transactions 1，1998(18)：3003–3009．

[7] RUEFFER M，ZENK M H．Microsome–mediated transformation of–methylandrocymbine to demecolcine and colchicine[J]．Febs Letters，1998，438(1/2)：111–113．

責(zé)任編輯：蘇愛(ài)華

英文編輯：梁 和

Based on metabolites of biosynthetic pathway to research on whether day lily(Baroni)contains colchicine

LIU Xiubin1a,2, TANG Minna1b#, HUANG Jialu2, ZENG Jianguo1a,2*

(1.a. College of Horticulture and Landscape; b.College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2.Hunan Collaborative Innovation Center for Utilization of Functional Ingredients from Botanicals, Changsha 410128, China)

Based on parsed colchicine biosynthetic pathway inL.(), the intermediate metabolites of colchicine biosynthetic pathway (IMCBP) were analyzed by HPLC–Q/TOF MS inBaroni () andsamples. The result showed that IMCBP was found inbut notdetected insamples. Demecolcine (Cp5)，deacetylcolchicine(Cp6) and colchicine(Cp7)were confirmed by authentic standard substances. The results support that there are no colchicine biosynthetic pathway and colchicine in

Baroni; colchicine; biosynthetic pathway; metabolite

S644.3

A

1007-1032(2017)05-0485-05

2016–10–24

2017–04–23

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAI29B04)

劉秀斌(1988—)，男，湖南邵陽(yáng)人，博士研究生，主要從事藥用植物功能成分分析研究，xiubin_liu@163.com；#并列第一作者，湯敏娜(1992—)，女，湖南長(zhǎng)沙人，碩士研究生，主要從事食品成分分析，545574941@qq.com；*通信作者，曾建國(guó)，博士，教授，主要從事中藥資源綜合利用研究，zengjianguo@hunau.edu.cn

投稿網(wǎng)址：http://xb.hunau.edu.cn