南 瓊 唐景春*,2,3 何若竹 胡羽成 吳 濤

1(南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300071)2(環(huán)境污染過程與基準(zhǔn)教育部重點實驗室，天津 300071)3(天津市城市環(huán)境污染診斷與修復(fù)技術(shù)工程中心，天津 300071) 4(天津市水利科學(xué)研究院，天津 300061)

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測土壤中兩種抗生素呋喃唑酮和氟苯尼考

南 瓊1唐景春*1,2,3何若竹1胡羽成4吳 濤4

1(南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300071)2(環(huán)境污染過程與基準(zhǔn)教育部重點實驗室，天津 300071)3(天津市城市環(huán)境污染診斷與修復(fù)技術(shù)工程中心，天津 300071)4(天津市水利科學(xué)研究院，天津 300061)

建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC/MS/MS)檢測土壤中多種環(huán)境基質(zhì)下呋喃唑酮和氟苯尼考的方法。提取液采用磷酸鹽緩沖溶液(pH=3)-乙腈(3∶7，V/V)，經(jīng)過SPE固相萃取小柱SAX-HLB串聯(lián)富集，使用Waters BEH C18色譜柱(2.1×100 mm)進(jìn)行分離，UPLC/MS/MS在多反應(yīng)監(jiān)測模式下進(jìn)行定性與定量分析。以3倍信噪比確定方法檢出限，以10倍信噪比確定方法定量限。結(jié)果表明，本方法在5 min內(nèi)即可分離兩種物質(zhì)，呋喃唑酮和氟苯尼考的檢出限分別為1.19和0.41 μg/kg; 定量限分別為3.40和1.37 μg/kg。50 μg/L加標(biāo)水平的呋喃唑酮和氟苯尼考的回收率分別為92%和79%; 200 μg/L加標(biāo)水平下呋喃唑酮與氟苯尼考的回收率分別為96%和86%。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜; 呋喃唑酮; 氟苯尼考; 固相萃取

2016-11-28收稿; 2017-09-04接受

本文系水體污染控制與治理科技重大專項(No. 2015ZX07203-011-06)、天津市水務(wù)局局科研項目(No. KY2015-01)和863成果轉(zhuǎn)化項目(No. 14RCHZSF00144)資助

* E-mail: tangjch@nankai.edu.cn

1 引 言

肉類、牛奶、蜂蜜和其它動物源性食物的抗生素殘留對人類健康以及環(huán)境均存在不可忽視的風(fēng)險。其中硝基呋喃類抗生素是常有的抗生素，由于其對人具有一定的毒副作用，許多國家已經(jīng)禁止硝基呋喃類抗生素在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用[1]。氯霉素(CAP)對人類具有潛在的致死作用，并且可以使人類容易患上諸如白血病、再生障礙性貧血和灰色嬰兒綜合征等疾病[2～4]。歐盟規(guī)定CAP在食品中的最高殘留限量(MRPL)值為0.3 μg/kg[5]。硝基呋喃類抗生素的抗菌活性主要來源于5位碳上的硝基基團(tuán)，其被廣泛應(yīng)用于奶牛的乳腺炎以及家禽家畜的雞瘟、球蟲病、豬腸炎的治療[6～8]。1990年，日本首次將氟苯尼考用于漁業(yè)養(yǎng)殖中，韓國、美國以及歐洲的一些國家隨后也開始使用氟苯尼考治療魚類疾病，1999年我國批準(zhǔn)使用氟苯尼考[9～11]。由于呋喃唑酮(FZD)和氟苯尼考抗菌效果好，經(jīng)常作為飼料直接喂養(yǎng)家禽以及魚蝦[12]，使用量日益增大，導(dǎo)致其環(huán)境殘留也愈來愈多，造成抗生素污染。

目前，呋喃唑酮與氟苯尼考的檢測方法主要有比色法、薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法等。Kaniou等[13]使用高效液相色譜-紫外-可見光二極管陣列方法檢測了雞蛋中的硝基呋喃類抗生素; Wilhelmus等[14]借助紫外可見光二級陣列管檢測技術(shù)檢測了卵中呋喃唑酮的含量，回收率為86%; Fernando等[15]使用高效液相色譜-二極管陣列檢測器檢測了組織結(jié)合的硝基呋喃類代謝物。然而，由于呋喃唑酮母體的復(fù)雜性、不穩(wěn)定性以及其代謝產(chǎn)物的存在，使得高效液相色譜法檢測呋喃唑酮的效果不佳，并且呋喃唑酮在動物體內(nèi)代謝快，不穩(wěn)定，難以長時間存留[14]，所以檢測呋喃唑酮主要是通過檢測呋喃唑酮的代謝物，但尚未見超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-MS/MS)檢測呋喃唑酮的方法。Cornejo等[16]使用液相色譜-串聯(lián)級質(zhì)譜聯(lián)用方法檢測了肉雞羽毛中氟苯尼考含量; Ryan等[7]建立了液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測土壤中氟苯尼考的方法，回收率在60.2%120.3%之間; Lee等[17]開發(fā)了一種通過UPLC-MS/MS測定羅非魚片中氟苯尼考?xì)埩艏捌浯x物氟苯尼考胺的方法; Orlando等[18]使用液相色譜-加熱電噴霧離子化(HESI)和大氣壓化學(xué)電離(APCI)串聯(lián)質(zhì)譜對白尾鹿組織中氟苯尼考進(jìn)行了定性和定量分析。謝愷舟等[19]使用高效液相色譜熒光檢測法檢測了雞肉中的氟苯尼考，分離時間為18 min; 郭霞等[20]使用高效液相色譜法檢測了魚肉中的氟苯尼考，分離時間為22 min。目前使用UPLC-MS/MS檢測土壤中的呋喃唑酮與氟苯尼考的方法鮮有報道。與HPLC相比，UPLC分析速度更快，分離能力更好，能夠同時分離檢測多種有機(jī)物質(zhì)。本研究采用UPLC結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測土壤中的呋喃唑酮與氟苯尼考，不受復(fù)雜基質(zhì)干擾，5 min內(nèi)即可完全分離兩種目標(biāo)物，對土壤中的抗生素的檢測有更廣闊的應(yīng)用前景。

2 材料與方法

2.1儀器與試劑

TYXH-I渦旋儀(中國上海豫明儀器有限公司); ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1×100 mm, 1.7 μm)、Xevo TQS超高效液相色譜質(zhì)譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Waters公司);Lab-1A-50E冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司); 3H16RI高速離心機(jī)(湖南赫西儀器裝備有限公司); SBEQ-CR1027固相萃取真空裝置、DC12氮氣濃縮儀、HLB固相萃取柱、SAX固相萃取柱(中國上海安普科技有限公司);XPE電子分析天平(梅特勒托利多儀器有限公司);PB-10精密pH計(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品(純度99%)、呋喃唑酮標(biāo)準(zhǔn)品(純度99%)購自Dr.Ehrenstorfer公司; 甲醇、乙腈(99.99%，HPLC級，上海安普科技有限公司); 其它試劑均為國產(chǎn)分析純。實驗用水為蒸餾水。

2.2實驗方法

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)儲備液與工作液的配制標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱量0.01 g的氟苯尼考和呋喃唑酮，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶，配制成1000 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)儲備液，20℃下保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：取10 μL 1000 mg/L的氟苯尼考、呋喃唑酮標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶，配制成1000 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

配制0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、100.0和200.0 μg/L系列氟苯尼考和呋喃唑酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

磷酸鹽緩沖溶液(pH=3.0， 4.6 g/L Na+)-乙腈(3∶7，V/V)(簡稱A液); EDTA-McIlvaine緩沖溶液(pH=4.0，檸檬素緩沖溶液-0.1 mol/L四乙酸二乙胺二鈉，1∶1，V/V)-甲醇(1∶1，V/V)配制成EDTA-McIlvaine提取液(簡稱B液); 0.5 mol/L草酸-乙腈(1∶1，V/V，簡稱C液); 甲醇-檸檬酸緩沖溶液(pH=4.0)-EDTA溶液(3∶2∶1，V/V，pH 5．0，簡稱D液)。

2.2.2提取方法空白土壤樣品經(jīng)過冷凍干燥，研磨，過40目篩，備用。稱取1 g備用空白土壤樣品，添加氟苯尼考和呋喃唑酮標(biāo)準(zhǔn)工作儲備液，使土壤中抗生素含量為50 μg/kg。稱取經(jīng)抗生素處理過的土壤1 g，加入0.2 g乙二胺四乙酸二鈉， 10 mL A提取液，渦旋混合1 min，超聲10 min， 8000 r/min離心15 min，上清液轉(zhuǎn)移至另一個離心管中。再提取兩次，合并上清液，用蒸餾水稀釋至400 mL。串聯(lián)SAX小柱與HLB小柱，先后用6 mL甲醇、6 mL蒸餾水活化、淋洗。400 mL提取稀釋液經(jīng)固相萃取小柱萃取，萃取完畢后用蒸餾水清洗固相萃取小柱，真空干燥30 min，棄去SAX小柱，僅留下富集有抗生素的HLB小柱。用甲醇洗脫HLB小柱，高純氮氣吹至盡干，用甲醇定容至1 mL，供UPLC-MS/MS檢測。

2.3色譜分析條件

Waters BEH C18色譜柱，柱溫50℃，流動相為0.5%甲酸(A)與乙腈(B)。流速0.4 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式，串聯(lián)質(zhì)譜檢測。梯度洗脫程序: 0～1.5 min, 10% B; 1.5～2.0 min, 16% B; 2.0～2.5 min, 18% B; 2.5～3.0 min, 20% B; 3.0～4.0 min, 22% B; 4.0～5.5 min, 35% B; 4.5～6.5 min, 60% B; 6.5～7.0 min, 95% B; 7.0～10.0 min, 10% B，質(zhì)譜條件見表1。

表1 質(zhì)譜工作參數(shù)

Table 1 Mass spectrometric conditions for qualitative and quantitative analyses

抗生素Antibiotics離子化方式Ionizationmethod離子對Ionpair(m/z)錐孔電壓Conevoltage(V)碰撞電壓Fragmentorvoltage(V)呋喃唑酮Furazolidone(FZD)正離子模式Positiveionmode226．07/67．08/122．064620/22氟苯尼考Florfenicol(FFC)負(fù)離子模式Negativeionmode356．03/185．05/336．00188/8

圖1 不同提取液對呋喃唑酮和氟苯尼考的回收率A: 磷酸緩沖液/乙腈; B: EDTA-McIlvaine; C: 草酸/乙腈; D: 甲醇/檸檬酸緩沖溶液/EDTA溶液Fig.1 Recovery of furazolidone (FZD) and florfenicol (FFC) using different extraction solutionsA: Phosphate buffer-acetonitrile; B: EDTA-McIlvaine; C: oxalic acid-acetonitrile; D: methanol-citric acid buffer-EDTA.

3 結(jié)果與討論

3.1提取液的選擇

[21～23]方法，對比磷酸鹽緩沖液-乙腈、EDTA-McIlvaine、草酸-乙腈、甲醇-檸檬酸緩沖溶液-EDTA溶液4種提取液， 分別簡稱為A、B、C、D提取液。采用經(jīng)檢測不含有抗生素的土壤，制備成呋喃唑酮和氟苯尼考的濃度為50 μg/kg的土壤加標(biāo)樣品，采用4種提取液提取，A提取液對呋喃唑酮的氟苯尼考的提取效率最高，回收率分別達(dá)到96%和93%; B、 C、 D 3種提取液對呋喃唑酮的提取率較高， 回收率在74%～91%之間，但是對氟苯尼考的回收率僅為47%～54%(圖1)。綜合考慮，選擇A提取液對呋喃唑酮和氟苯尼考進(jìn)行提取效果更好。李曉晶等[24]研究土壤中磺胺類提取效果時，也發(fā)現(xiàn)乙腈的提取效果優(yōu)于甲醇; Pfenning等[21]認(rèn)為這與乙腈良好的溶劑性能有關(guān)，也可能與提取液的pH值有關(guān); 馬麗麗等[25]研究表明，2%甲酸-乙腈溶液并不能有效提取氟喹諾酮類抗生素，50%乙腈-磷酸鹽緩沖溶液對氟喹諾酮類抗生素回收率高于80%，這可能與氟喹諾酮類抗生素的pKa有關(guān)，在酸性條件下，氟喹諾酮類抗生素更加穩(wěn)定。

3.2pH值對抗生素提取效果的影響

在不同的pH值條件下，抗生素的穩(wěn)定性與存在形態(tài)不同。李曉晶等[24]在pH=3的酸性條件下提取四環(huán)素類抗生素; 而磺胺類抗生素在pH=5酸性條件下提取[26]?？疾炝颂崛∵秽蛲头侥峥嫉淖顑?yōu)pH條件， 每個樣品設(shè)置3個平行樣，提取液采用A液，使用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值。由圖2可見，隨著pH值升高，回收率呈下降趨勢，在pH=3.0時，呋喃唑酮的回收率為94%～97%，氟苯尼考的回收率為90%～93%。酸堿環(huán)境會影響抗生素的離子形態(tài)及穩(wěn)定性，在堿性條件下,大部分抗生素容易堿性水解，而某些抗生素如紅霉素在酸性條件下易酸解。呋喃唑酮與氟苯尼考為酸性化合物[14,15]，在酸性條件下更加穩(wěn)定，在中性或者偏堿性條件下易水解，造成損失。

3.3HLB洗脫液體積對抗生素提取效果的影響

在確定最佳提取液和pH值后，進(jìn)一步探究洗脫液體積對抗生素提取效果的影響。洗脫液為甲醇，考察甲醇體積為3、5、8和10 mL時的洗脫效果。結(jié)果如圖3所示，隨著甲醇洗脫液體積的增加，抗生素的回收率增加。相比之下，呋喃唑酮的提取效果更好，提取液體積為8與10 mL時，呋喃唑酮和氟苯尼考的提取回收率差異較小，因此確定洗脫液最佳體積為8 mL。

圖2 不同pH條件下FZD和FFC回收率Fig.2 Recovery of FZD and FFC under different pH values

圖3 HLB洗脫液體積對FZD和FFC回收率的影響Fig.3 Recovery of FZD and FFC with different volume of eluent

3.4線性范圍及檢出限

用甲醇將標(biāo)準(zhǔn)儲液稀釋成1000、500、250、100、50、25、10、5、1.0、0.5和0.1 μg/L目標(biāo)物的混合標(biāo)準(zhǔn)系列濃度，根據(jù)每個濃度下的峰面積進(jìn)行線性回歸，根據(jù)3倍信噪比確定檢出限，10倍信噪比確定定量限。表2為FZD和FFC的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限。

表2 方法的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限

Table 2 Regression equation, correlation coefficient, LOD and LOQ of the proposed method

抗生素Antibiotics回歸方程Regressionequation線性范圍Linearityrange(μg/kg)相關(guān)系數(shù)Correlationcoefficient(R2)檢出限LOD(μg/kg)定量限LOQ(μg/kg)FZDy=2210．7x+559．70．1～10000．99971．193．40FFCy=180．1x-170．80．1～10000．99970．411．37

在優(yōu)化的實驗條件下，呋喃唑酮和氟苯尼考被很好地分離檢測，圖4為呋喃唑酮、氟苯尼考的二級質(zhì)譜圖，圖5為分離色譜圖。可見， 本方法能夠很好地分離復(fù)雜基質(zhì)中多組分物質(zhì)。

圖4 呋喃唑酮(A)和氟苯尼考(B)的二級質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectra (MS2) of (A) FZD and (B) FFC

3.5方法回收率

采用2.2.2實驗方法檢測加標(biāo)水平為50和200 μg/kg呋喃唑酮和氟苯尼考的土壤樣品，每個樣品平行測定3次，兩個加標(biāo)濃度下的呋喃唑酮與氟苯尼考的回收率見表3。

圖5 呋喃唑酮與氟苯尼考分離色譜圖Fig.5 Separation chromatogram of FZD and FFC

表3 FZD, FFC的回收率

Table 3 Recovery (n=3) of FZD and FFC

抗生素Antibiotics加標(biāo)量Added50μg/L回收率Recovery(%，n=3)RSD(%)200μg/L回收率Recovery(%，n=3)RSD(%)FZD9210．39612．3FFC795．68615．1

3.6實際樣品分析

對華北地區(qū)某水庫底泥的37個采樣點進(jìn)行呋喃唑酮和氟苯尼考含量檢測，呋喃唑酮含量在5.0～330.2 μg/kg， 平均值為73.2 μg/kg。氟苯尼考含量在0～4.5 μg/kg范圍內(nèi)，平均值為0.7 μg/kg。其中呋喃唑酮檢出率為100%，污染比較嚴(yán)重; 氟苯尼考檢出率73%，但檢出量均較低，多在0.5 μg/kg左右，表明此地區(qū)氟苯尼考污染風(fēng)險較小。

4 結(jié) 論

建立了一種UPLC/MS/MS檢測底泥中呋喃唑酮和氟苯尼考的方法，采用磷酸鹽緩沖液-乙腈(3∶7，V/V)提取，在酸性條件(pH=3)下,呋喃唑酮和氟苯尼考的提取效果更好，洗脫液為8 mL甲醇，本方法前處理步驟簡單，檢測速度快，回收率高。本研究為UPLC-MS/MS方法檢測各種復(fù)雜基質(zhì)中抗生素殘留以及有機(jī)物質(zhì)的分析檢測提供了參考。

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DeterminationofFurazolidoneandFlorfenicolinSoilbyUltraPerformanceLiquidChromatography-TandemMassSpectrometry

NAN Qiong1, TANG Jing-Chun*1,2,3, HE Ruo-Zhu1, HU Yu-Cheng4, WU Tao4
1(CollegeofEnvironmentalScienceandEngineering,NankaiUniversity,Tianjin300071,China)2(KeyLaboratoryofPollutionProcessesandEnvironmentalCriteria,MinistryofEducation,Tianjin300071,China)3(TianjinEngineeringCenterofEnvironmentalDiagnosisandContaminationRemediation,Tianjin300071,China)4(TianjinHydranlicResearchInsitute,Tianjin300061,China)

A detection method for furazolidone and florfenicol in soil with various environmental matrices was established using ultra performance liquid chromatography-tandem spectrometry (UPLC/MS/MS) technique. Extracting solution of a mixture of phosphate buffer (pH=3) and acetonitrile (3∶7,V/V) was used in this experiment. The extracted water samples were enriched by SAX-HLB solid phase extraction column before the process of nitrogen blowing (high purity nitrogen). The enriched antibiotics were desalted with 8 mL of methanol. Waters BEH C18(2.1 × 100 mm) column was used for the sample separation. UPLC/MS/MS was carried out for qualitative and quantitative analysis under multi-reaction monitoring mode. The detection limit of the method was determined by 3 times of signal-to-noise ratio, and the limit of determination of the method was determined by 10 times of signal-to-noise ratio. The results showed that the detection limits of furazolidone and florfenicol were 1.19 and 0.41 μg/kg, respectively, and the limits of quantitation of furazolidone and florfenicol were 3.40 and 1.37 μg/kg, respectively. Besides, recovery experiment showed that, for the soil samples spiked with 50 μg/L furazolidone and florfenicol, the recoveries were 79% for florfenicol and 92% for furazolidone. Similarly, for the soil samples spiked with 200 μg/L furazolidone and florfenicol, the recoveries were 96% for furazolidone and 86% for florfenicol.

Ultra performance liquid chromatography-tandem spectrometry; Furazolidone; Florfenicol; Solid phase extraction

28 November 2016; accepted 4 September 2017)

10.11895/j.issn.0253-3820.160870