楊丹，高鵬，李玉霞，凌焱，陳惠鵬

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 科技部，北京 100850；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 衛(wèi)生勤務(wù)與醫(yī)學(xué)情報(bào)研究所，北京 100850

遺傳密碼子擴(kuò)充系統(tǒng)表達(dá)載體及其穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建

楊丹1，高鵬1，李玉霞2，凌焱1，陳惠鵬1

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 科技部，北京 100850；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 衛(wèi)生勤務(wù)與醫(yī)學(xué)情報(bào)研究所，北京 100850

目的：構(gòu)建異源表達(dá)遺傳密碼子擴(kuò)充系統(tǒng)的HeLa細(xì)胞系。方法：用PCR方法擴(kuò)增MmBocRS、PyltRNA基因，定向克隆到Lenti-EF1α-Puro載體中，構(gòu)建Lenti-EF1α-BocRS、Lenti-PyltRNA表達(dá)質(zhì)粒；在HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝，用獲得的慢病毒感染HeLa細(xì)胞，獲得BocRS-tRNACUA穩(wěn)定細(xì)胞株；分別應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR和Western印跡鑒定該穩(wěn)定細(xì)胞系中MmBocRS和PyltRNA的表達(dá)；利用轉(zhuǎn)染EGFP的琥珀突變體驗(yàn)證BocRS-tRNACUA穩(wěn)定細(xì)胞株的功能。結(jié)果：酶切及測(cè)序表明Lenti-EF1α-BocRS和Lenti-PyltRNA質(zhì)粒構(gòu)建正確；實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示BocRS-tRNACUA穩(wěn)定細(xì)胞株中PyltRNA的表達(dá)量顯著提高；Western印跡結(jié)果顯示BocRS-tRNACUA穩(wěn)定細(xì)胞株中MmBocRS基因的表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照；轉(zhuǎn)染EGFP琥珀突變體結(jié)果表明，可以通過(guò)非天然氨基酸來(lái)控制EGFP的表達(dá)。結(jié)論：構(gòu)建了能穩(wěn)定表達(dá)MmBocRS和PyltRNA的BocRS-tRNACUA細(xì)胞株，并實(shí)現(xiàn)了通過(guò)非天然氨基酸控制蛋白表達(dá)，為研究定點(diǎn)插入非天然氨基酸提供了細(xì)胞模型。

遺傳密碼子擴(kuò)充；非天然氨基酸；慢病毒載體；穩(wěn)定細(xì)胞株

遺傳密碼子擴(kuò)充技術(shù)是利用正交性氨酰tRNA合成酶-tRNA（tRNA/aaRS pairs）識(shí)別mRNA上的無(wú)義密碼子，并在其相應(yīng)位點(diǎn)插入非天然氨基酸[1]。一些tRNA/aaRS pairs經(jīng)過(guò)演變已能編碼100多種非天然氨基酸[2]，這些非天然氨基酸通常都具有特殊的物理、化學(xué)或生物特性，因此實(shí)現(xiàn)非天然氨基酸插入的遺傳密碼子擴(kuò)充技術(shù)已在蛋白質(zhì)研究中展現(xiàn)出豐富多樣的應(yīng)用潛質(zhì)。如控制蛋白交聯(lián)反應(yīng)，Chin等[3]在鈣調(diào)蛋白上分別引入含有疊氮基團(tuán)和炔烴的非天然氨基酸，利用click reaction形成一個(gè)交聯(lián)三唑結(jié)構(gòu)。與傳統(tǒng)蛋白環(huán)化形成重組蛋白相比，遺傳密碼子擴(kuò)充技術(shù)可以在蛋白的任意位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)，不再僅限于末端；遺傳密碼子擴(kuò)充可以通過(guò)非天然氨基酸在蛋白的特定位點(diǎn)標(biāo)記任意標(biāo)簽[4]，這些標(biāo)簽可以是熒光探針[5]、核磁共振探針[6]、紅外線探針[7]，甚至可以是一些細(xì)胞毒素類或生物素類的分子[5]，遺傳密碼子擴(kuò)充的優(yōu)勢(shì)在于它可以把對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的干擾降到最小，以避免影響蛋白的功能和定位。

為了方便遺傳密碼子擴(kuò)充技術(shù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行和探究，我們利用慢病毒載體構(gòu)建表達(dá)遺傳密碼子擴(kuò)充系統(tǒng)，并進(jìn)一步得到了能夠?qū)崿F(xiàn)定點(diǎn)插入非天然氨基酸Boc-lysine的穩(wěn)定細(xì)胞株BocRS-tRNACUA，為遺傳密碼子擴(kuò)充的應(yīng)用搭建了一個(gè)平臺(tái)，為遺傳密碼子擴(kuò)充實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展提供了便利，也保證了實(shí)驗(yàn)的時(shí)空一致性。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚腎細(xì)胞293T和人宮頸癌細(xì)胞HeLa（均用含10％胎牛血清和1％青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2d傳代一次），質(zhì)粒 Lenti-EF1α-Puro、pGP、pVSVG 和 pEG?FP-N1為本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)菌株、膠回收試劑盒、細(xì)胞RNA提取試劑盒及Quant One Step qRT-PCR（SYBR Green）試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；Q5超保真DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶BstBⅠ、BamHⅠ、ClaⅠ、XbaⅠ及T4DNA連接酶購(gòu)自NEB公司；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒、Anti Flag-Tag Mouse Monoclonal Antibody、AntiGAPDH MouseMonoclonalAnti?body和 Goat Anti-Mouse IgG（H+L） HRP Conju?gate購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；胎牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、OPTI-MEM、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素均購(gòu)自Gibco公司；TurboFect轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Thermo公司；非天然氨基酸Boc-lysine購(gòu)自Bachem公司；MmBocRS（為方便后續(xù)檢測(cè)，在MmBocRS 5'端連有Flag）、PyltRNA基因序列來(lái)源于古生菌Methanosarcina mazei，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.2 質(zhì)粒載體構(gòu)建及鑒定

PCR擴(kuò)增MmBocRS片段，正向引物為5'-TG ATTCGAATTCGCCGCCACCATGGATAAAAAAC-3'，反向引物為5'-GCGGGATCCTTACAGGTTGGTAG-3'。將回收的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒Lenti-EF1α-Puro分別用BstBⅠ、BamHⅠ酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用DNA膠回收試劑盒純化回收目的產(chǎn)物，再用T4DNA聚合酶連接構(gòu)成重組質(zhì)粒Lenti-EF1α-BocRS，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽(yáng)性克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測(cè)序。

同理構(gòu)建重組質(zhì)粒Lenti-PyltRNA。PCR擴(kuò)增PyltRNA片段，正向引物為5'-CCCATCGATGATT CTTCATGCAATT-3'，反向引物為5'-CTAGTCTAG ACAAGGCTTGACCGAC-3'。用 ClaⅠ、XbaⅠ分別對(duì)回收的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒Lenti-EF1α-EGFP進(jìn)行雙酶切。

1.3 慢病毒包裝

消化293T細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要將適量細(xì)胞鋪至100mm皿中，待細(xì)胞密度達(dá)到 60％～80％時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將0.86μg VSVG、1.72 μgGP、3.44 μg Lenti-EF1α-BocRS、12μL 100μmol/L的PEI一起加入1.33mL PBS中形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物輕微吹打混勻后室溫孵育10min，直接加入鋪種的平皿中，輕輕搖動(dòng)平皿，使轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻分布，將培養(yǎng)板置于 37℃、5％CO2恒溫孵箱培養(yǎng)，6～8h后更換為含5％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。分別于轉(zhuǎn)染后48和72h收集平皿中的培養(yǎng)上清，4℃、1200r/min離心10min除去細(xì)胞碎片，用0.45μm濾器過(guò)濾，過(guò)濾液再用Amicon Ultra-15 50K于4℃、5000r/min離心20min，得慢病毒液Lenti-EF1α-BocRS，分裝后于-80℃保存或立即使用。同樣步驟得到慢病毒液Lenti-PyltRNA。

1.4 慢病毒液感染HeLa細(xì)胞系

感染前1d將HeLa細(xì)胞鋪至12孔板，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80％左右時(shí)，取慢病毒液Lenti-EF1α-BocRS和Lenti-PyltRNA共同感染HeLa細(xì)胞。感染時(shí)，在含有病毒的培養(yǎng)上清中加入聚凝胺（polybrene）至終濃度為6μg/mL以提高病毒感染效率。感染24h后，棄去感染孔中培養(yǎng)基，換上500μL新鮮的完全培養(yǎng)基；感染48h時(shí)進(jìn)行藥篩，把孔內(nèi)培養(yǎng)基換為含嘌呤霉素（終濃度為3μg/mL）的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，將感染并篩選后的細(xì)胞傳代，并繼續(xù)施加嘌呤霉素進(jìn)行維持性篩選培養(yǎng)；連續(xù)篩選并傳3代后，凍存保留BocRS-tRNACUA穩(wěn)定細(xì)胞株。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)PyltRNA的表達(dá)

從細(xì)胞中提取RNA，定量，取10ng RNA為模板，用實(shí)時(shí)定量PCR儀檢測(cè)BocRS-tRNACUA穩(wěn)定細(xì)胞株中PyltRNA的表達(dá)。PCR上游引物為5'-T CATGTAGATCGAACGGAC-3'，下游引物為5'-GA ATCTAACCCGGCTGAA-3'。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，上游引物為5'-TGACTTCAACAGCGACACCC A-3'，下游引物為5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCA AA-3'。用 2-ΔΔCt分析基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 Western印跡檢測(cè)MmBocRS的表達(dá)

棄掉細(xì)胞里的培養(yǎng)基，用PBS洗一次，棄掉，用裂解液裂解，冰浴30min，12 000r/min離心10min，取上清與6×上樣緩沖液混勻，煮沸5min。蛋白經(jīng)10％SDS-PAGE分離后電轉(zhuǎn)移至NC膜，用5％脫脂牛奶封閉液封閉1h；加 入一 抗AntiFlag-Tag Mouse MonoclonalAntibody（1∶2000）、Anti GAPDH Mouse Monoclonal Antibody（1∶2000），室溫溫育2h或4℃溫育過(guò)夜；用TBST洗膜3次，每次10min；加入相應(yīng)的二抗Goat An?ti-Mouse IgG（H+L） HRP Conjugate，室溫溫育 1h；用TBST洗膜3次，每次10min；ECL顯影。

1.7 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染穩(wěn)定細(xì)胞株

將pEGFP-N1質(zhì)粒上39Tyr突變?yōu)殓昝艽a子TAG，正向引物為5'-GCGATGCCACCTAGGGCAA GCTGAC-3'，反向引物為5'-GTCAGCTTGCCCTA GGTGGCATCGC-3'，得到突變體質(zhì)粒pEGFP-N1-UAG。轉(zhuǎn)染前1d將細(xì)胞BocRS-tRNACUA鋪至12孔板，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80％左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將1μg pEGFP-N1-UAG與2μL TurboFect一起加入100μL OPTI-MEM中形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，輕微吹打混勻后室溫孵育10min，直接加入鋪種的平板中，輕輕搖動(dòng)平板，使轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻分布，將培養(yǎng)板置于37℃、5％CO2恒溫孵箱中培養(yǎng)，6h后更換為含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，其中一個(gè)孔含1mmol/L Boc-lysine。

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒載體的構(gòu)建

從連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的平板上挑取重組慢病毒載體的單克隆，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定（圖1），與預(yù)期的全長(zhǎng)基因大小吻合，進(jìn)一步測(cè)序表明重組慢病毒載體Lenti-EF1α-BocRS和Lenti-PyltRNA構(gòu)建成功。

2.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)穩(wěn)定細(xì)胞株中PyltRNA的表達(dá)

利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)BocRS-tRNACUA穩(wěn)定細(xì)胞株中PyltRNA的表達(dá)量。表1結(jié)果顯示，與HeLa細(xì)胞相比，BocRS-tRNACUA穩(wěn)定細(xì)胞的Pyl?tRNA表達(dá)量顯著提高。說(shuō)明穩(wěn)定細(xì)胞株可以穩(wěn)定提供遺傳密碼子擴(kuò)充系統(tǒng)中的正交性tRNA。

2.3 Western印跡檢測(cè)穩(wěn)定細(xì)胞株中BocRS的表達(dá)

將BocRS-tRNACUA穩(wěn)定細(xì)胞和HeLa細(xì)胞分別加入適量裂解液提取蛋白，用上清液進(jìn)行SDSPAGE，Western印跡檢測(cè) BocRS（BocRS 5'端連有Flag）的表達(dá)（圖2），結(jié)果顯示2組細(xì)胞在GAPDH大小處均出現(xiàn)了明顯條帶，穩(wěn)定細(xì)胞株用Flag抗體能檢測(cè)到明顯的特異條帶，而對(duì)照HeLa細(xì)胞無(wú)條帶。說(shuō)明構(gòu)建的穩(wěn)定細(xì)胞株能穩(wěn)定表達(dá)遺傳密碼子擴(kuò)充系統(tǒng)中的正交性氨酰tRNA合成酶。

2.4 驗(yàn)證穩(wěn)定細(xì)胞株插入非天然氨基酸的功能

為檢測(cè)構(gòu)建的BocRS-tRNACUA穩(wěn)定細(xì)胞株是否能通過(guò)添加非天然氨基酸來(lái)控制目的蛋白的表達(dá)，將pEGFP-N1的39Tyr突變?yōu)殓昝艽a子TAG，測(cè)序結(jié)果如圖3。將pEGFP-N1的琥珀突變體轉(zhuǎn)染BocRS-tRNACUA穩(wěn)定細(xì)胞株，6h后將一孔內(nèi)的培養(yǎng)基換為含1mmol/L Boc-lysine的10％胎牛血清DMEM，另外一孔換為新鮮的10％胎牛血清DMEM，轉(zhuǎn)染24h后鏡下觀察結(jié)果。由圖4可知，只有在Boc-lysine存在的情況下pEGFP-N1的琥珀突變體才能表達(dá)綠色熒光蛋白，表明構(gòu)建的BocRS-tRNACUA穩(wěn)定細(xì)胞株確實(shí)可以實(shí)現(xiàn)遺傳密碼子擴(kuò)充。

圖1 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

圖2 Western印跡檢測(cè)BocRS的表達(dá)

3 討論

正交性氨酰tRNA合成酶-tRNA對(duì)于實(shí)現(xiàn)遺傳密碼子擴(kuò)充是必不可少的，通常都是利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)把它們轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)。但瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對(duì)于某些特定細(xì)胞的遞送效率很低甚至不能實(shí)現(xiàn)，而且每次轉(zhuǎn)染受細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞密度及實(shí)驗(yàn)操作者經(jīng)驗(yàn)的影響較大，不利于保證每次試驗(yàn)的時(shí)空一致性。因此，發(fā)展出了病毒載體來(lái)構(gòu)建遺傳密碼子擴(kuò)充系統(tǒng)。使用病毒載體不僅能在常規(guī)的細(xì)胞系中實(shí)現(xiàn)遺傳密碼子擴(kuò)充，甚至能在神經(jīng)元細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞及胚胎成纖維細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)遺傳密碼子擴(kuò)充。Schultz[8]等用桿狀病毒表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)了利用遺傳密碼子擴(kuò)充系統(tǒng)插入非天然氨基酸，雖然桿狀病毒具有大的基因容載量，但慢病毒載體更常見(jiàn)，應(yīng)用更為廣泛。

圖3 pEGFP-N1琥珀突變體測(cè)序結(jié)果

圖4 BocRS-tRNACUA穩(wěn)定細(xì)胞株轉(zhuǎn)染結(jié)果

表1 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)穩(wěn)定細(xì)胞株和HeLa細(xì)胞中PyltRNA表達(dá)水平

遺傳密碼子擴(kuò)充技術(shù)在病毒領(lǐng)域也得到了廣泛應(yīng)用，如Guo[9]探索了在HIV基因組中用遺傳密碼擴(kuò)充技術(shù)制新型疫苗；Chen和Li[10]通過(guò)在丁肝病毒表面插入非天然氨基酸實(shí)現(xiàn)了熒光分子標(biāo)記和示蹤等。由于病毒的特殊性，不同病毒的生活周期差異很大，如果采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)，不好控制正交性氨酰tRNA合成酶-tRNA的表達(dá)和病毒擴(kuò)增之間的時(shí)間關(guān)系，而我們構(gòu)建的BocRS-tRNACUA穩(wěn)定細(xì)胞株可以避免這個(gè)問(wèn)題。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知BocRS-tRNACUA穩(wěn)定細(xì)胞株能穩(wěn)定表達(dá)正交性MmBocRS及正交性Pyl?tRNACUA，并且該穩(wěn)定細(xì)胞株為Boc-lysine依賴，符合遺傳密碼子擴(kuò)充系統(tǒng)的要求。綜上所述，我們構(gòu)建的BocRS-tRNACUA穩(wěn)定細(xì)胞株可以作為遺傳密碼子擴(kuò)充系統(tǒng)應(yīng)用的一個(gè)工具細(xì)胞，為遺傳密碼子技術(shù)的開(kāi)展提供了便利。

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Construction of Genetic Codon Expansion Expression Vec?tor and Stably Transfected Cells

YANG Dan1,GAO Peng1,LI Yu-Xia2,LING Yan1*,CHEN Hui-Peng1*
1.Department of Science and Technology,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850;2.Institute of Health Service and Medical Information,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850;China
*Co-corresponding authors,CHEN Hui-Peng,E-mail:chenhp0909@163.com;LING Yan,E-mail:lingyanbeijing@163.com

Objective:To establish a HeLa cell line heterologous-expressing orthogonal aminoacyl-tRNA synthe?tase/transfer RNA（tRNA） pairs.Methods:MmBocRS and PyltRNA genes were amplified by PCR and cloned into Lenti-EF1α-Puro vector to construct Lenti-EF1α-BocRS and Lenti-PyltRNA expression plasmids.Virus packaging was carried out in HEK293T cells.HeLa cells were infected with the obtained lentivirus to obtain BocRS-tRNACUAstably transfected cells.The expression of MmBocRS and PyltRNA in the stably transfected cells were identified by real-time quantitative PCR and Western blot respectively.The function of BocRS-tRNACUAstably transfected cells was examined by transfected amber mutant of EGFP.Results:Lenti-EF1α-BocRS and Lenti-PyltRNA plas?mids were constructed correctly.The results of RT-PCR showed that the expression of PyltRNA in BocRS-tRNACUAstably transfected cells was enhanced.Western blotting showed that the expression of MmBocRS gene in the stably transfected cells was significantly higher than in the blank control group.Transfection of EGFP amber mutant revealed that EGFP expression was controlled by unnatural amino acids.Conclusion:The BocRS-tRNACUAcell line stably expressing MmBocRS and PyltRNA was constructed and the expression of the protein was con?trolled by unnatural amino acid.It provided a cellular model for studying the insertion of non-natural amino acids.

genetic codon expansion;unnatural amino acids;lentivirus vector;stably transfected cells

Q78

A

1009-0002（2017）04-0410-05

2017-01-24

兩用生物技術(shù)威脅評(píng)估（2016YFC1202400）

楊丹（1992- ），女，碩士研究生，（E-mail）science112233@163.com

陳惠鵬，（E-mail）chenhp0909@163.com；凌焱，（E-mail）lingyanbeijing@163.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.002