宋昊 布文博 倪娜娜 溫斯健 熊競(jìng)舒 戚金亮 徐秀蓮 孫建方

210042南京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所病理科（宋昊、倪娜娜、溫斯健、熊競(jìng)舒、徐秀蓮、孫建方），皮膚外科（布文博）；南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 醫(yī)藥生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（戚金亮）

靶向調(diào)控皮膚惡性黑素瘤潛在致病基因CCL18的miRNA預(yù)測(cè)及表達(dá)相關(guān)性分析

宋昊 布文博 倪娜娜 溫斯健 熊競(jìng)舒 戚金亮 徐秀蓮 孫建方

210042南京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所病理科（宋昊、倪娜娜、溫斯健、熊競(jìng)舒、徐秀蓮、孫建方），皮膚外科（布文博）；南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 醫(yī)藥生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（戚金亮）

目的探討靶向調(diào)控皮膚惡性黑素瘤潛在致病基因CCL18的miRNA。方法 用miRanda和TargetScan在線軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)靶向調(diào)控CCL18基因的miRNA。根據(jù)人基因序列分析構(gòu)建CCL18基因3′UTR雙熒光素酶報(bào)告載體及miRNA載體，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h后裂解細(xì)胞并檢測(cè)熒光素酶活性。其中，CCL18基因3′UTR雙熒光素酶報(bào)告載體分3′UTR突變型組、3′UTR野生型組和空白對(duì)照組，miRNA載體攜帶篩選的miRNA。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)14例黑素瘤新鮮組織及瘤旁正常皮膚組織（對(duì)照）中CCL18和篩選miRNA的表達(dá)，并對(duì)其相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果在線軟件分析顯示，CCL18?3′UTR具有miR?183、miR?128、miR?33a等miRNA的作用靶點(diǎn)。成功構(gòu)建熒光素酶報(bào)告載體及miRNA載體，熒光素酶活性檢測(cè)顯示，miR?183、miR?128的3′UTR突變型組熒光素酶表達(dá)量（11.63±0.42；8.80±0.49）明顯高于3′UTR野生型組（4.86±0.39；5.01±0.54）及空白對(duì)照組（2.41±0.13；2.39±0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），而miR?33a的3′UTR突變型組熒光素酶表達(dá)量與3′UTR野生型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（6.41±0.47比6.16±0.22，P＞0.05）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示，14例黑素瘤腫瘤組織中CCL18基因的相對(duì)表達(dá)量（3.52±1.68）高于對(duì)照組織，而miR?183（0.49 ± 0.32）、miR?128（0.30 ± 0.20）、miR?33a（0.46 ± 0.40）的相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組織。CCL18表達(dá)水平與miR?128表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（rs= ?0.548，P＜ 0.05），而與miR?183、miR?33a表達(dá)水平無相關(guān)性（P＞0.05）。結(jié)論miR?128可能參與調(diào)控皮膚惡性黑素瘤潛在致病基因CCL18。

黑色素瘤；微RNAs；RNA，小分子干擾；趨化因子CCL18

皮膚惡性黑素瘤（MM）的發(fā)展與轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞與腫瘤浸潤(rùn)微環(huán)境通過細(xì)胞因子等分子信號(hào)相互作用的結(jié)果，腫瘤浸潤(rùn)微環(huán)境中的關(guān)鍵分子對(duì)腫瘤的診斷和靶向治療具有重要意義［1］。CCL18是一種半胱氨酸殘基?半胱氨酸殘基型（CC）趨化性細(xì)胞因子，參與多種炎癥和腫瘤的發(fā)病過程［2］。Chen等、Wang等、Lane等研究發(fā)現(xiàn)［3?5］，CCL18在乳腺癌及卵巢癌中均表達(dá)升高，促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，并與預(yù)后不良有關(guān)。本課題組辛崇美等［6］通過細(xì)胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，CCL18促進(jìn)A375黑素瘤細(xì)胞株侵襲，并促進(jìn)腫瘤血管生成。進(jìn)一步研究顯示［7］，CCL18在MM組織中表達(dá)升高，并與腫瘤厚度、轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，表明CCL18在MM中具有促進(jìn)腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的“促癌”作用。miRNA可通過與靶基因的mRNA?3′UTR結(jié)合調(diào)控基因的表達(dá)，多種miRNA參與調(diào)控黑素瘤的發(fā)生發(fā)展［8］。為發(fā)掘可能調(diào)控CCL18基因的miRNA分子，本研究通過生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)可能的miRNA，應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因篩選鑒定，并檢測(cè)其在MM中的表達(dá)。

材料和方法

一、試劑與材料

1.主要試劑：高糖型DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶（美國(guó)Gibco公司），pMD18?T載體（日本Takara公司），T4 DNA連接酶（美國(guó)NEB公司），限制性內(nèi)切酶XbaⅠ（美國(guó)MBI公司），DNA聚合酶、pGL3?promoter載體、Trizol試劑、miRNA載體包裝系統(tǒng)（BLOCK?iT? PolⅡmiR RNAi表達(dá)載體試劑盒）、設(shè)計(jì)合成寡聚單鏈（oligo）DNA和包裝質(zhì)粒（美國(guó)Invitrogen公司），雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)Promega公司），Revert Aid First Strand cDNA Synthesis反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），SYBR Green實(shí)時(shí)PCR試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2.實(shí)驗(yàn)標(biāo)本與細(xì)胞：收集2013—2014年在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院經(jīng)臨床、組織病理學(xué)及免疫組化確診并手術(shù)擴(kuò)大切除的14例（男9例，女5例）MM腫瘤組織，其瘤旁正常皮膚組織作為對(duì)照。同時(shí)，收集患者臨床和病理學(xué)資料，包括年齡、性別、部位、大小、有無潰瘍及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Breslow厚度、Clark分級(jí)和AJCC分期等，14例均為原發(fā)性黑素瘤。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品，293T細(xì)胞株由美國(guó)Life公司保存。

二、方法

1.靶向調(diào)控CCL18基因3′UTR的miRNA預(yù)測(cè)：利 用 miRanda（http：//www.microrna.org/microrna/home.do）、Target Scan（http：//www.targetscan.org/vert_71/）在線軟件預(yù)測(cè)可能調(diào)控人CCL18 mRNA的靶miRNA。結(jié)合其熱力學(xué)穩(wěn)定性（mirSVR score）和保守性（Phast Cons score）等參數(shù)，篩選相關(guān)分?jǐn)?shù)較高的miRNA（miR?183、miR?128和miR?33a）。

2.全基因合成及CCL18基因3′UTR雙熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建：根據(jù)基因庫(kù)檢索人CCL18 mRNA序列，設(shè)計(jì)分別針對(duì)miR?183、miR?128、miR?33a結(jié)合位點(diǎn)的CCL18?3′UTR突變序列。根據(jù)基因序列分析的結(jié)果，分別進(jìn)行單鏈oligo的設(shè)計(jì)及合成，序列見表1。用PCR將合成的oligo拼接成完整的基因序列，將合成好的序列裝入pMD18?T載體并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α，測(cè)序驗(yàn)證重組克隆中插入序列與要求一致?；蚝铣少|(zhì)粒，用XbaⅠ分別將TA克隆質(zhì)粒及pGL3?promoter質(zhì)粒進(jìn)行酶切，電泳并回收目的片段及載體片段，用T4 DNA連接酶連接回收的片段與載體，取10 μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，并對(duì)單克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

表1 針對(duì)各miRNA的CCL18?3′UTR突變序列

3.miRNA載體構(gòu)建：根據(jù)miR ?183、miR?128、miR?33a成熟體序列，分別設(shè)計(jì)miRNA的表達(dá)序列并合成3對(duì)互補(bǔ)oligo DNA，序列見表2。將3對(duì)合成好的寡聚單鏈DNA用ddH2O溶解，互補(bǔ)單鏈混合后分別按一定體系進(jìn)行退火、連接及轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α。序列亞克隆到pcDNA6.2??GW?miR載體中，測(cè)序驗(yàn)證。

表2 各miRNA載體中插入的oligo DNA序列

4.質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞：用胰酶消化293T細(xì)胞后，以5×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔培養(yǎng)板中。在細(xì)胞覆蓋率90%左右時(shí)，以1∶3加入質(zhì)粒pGL3?promoter和 pcDNA6.2?GW/miR，同 時(shí) 加 入lipofectamine 2000稀釋液進(jìn)行瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染。4～6 h后更換完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。實(shí)驗(yàn)分為3′UTR突變型組、3′UTR野生型組和空白對(duì)照組：①3′UTR突變型組：pGL3?promoter載體含針對(duì)特定miRNA結(jié)合位點(diǎn)突變的CCL18?3′UTR序列；②3′UTR野生型組：pGL3?promoter載體含野生型CCL18?3′UTR序列；③空白對(duì)照組：空白pGL3?promoter載體。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。miR?183、miR?128、miR?33a分別進(jìn)行獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

5.熒光素酶活性檢測(cè)：收集轉(zhuǎn)染48 h的293T細(xì)胞，每孔加入600 μl細(xì)胞裂解液，室溫?fù)u動(dòng)裂解15 min。將裂解液移至離心管，12 000 r/min（離心半徑10 cm）離心30 s，留取上清液。測(cè)量皿中加入100 μl熒光素酶檢測(cè)試劑Ⅱ；加入20 μl細(xì)胞裂解液，用移液器混勻，置分光光度計(jì)讀數(shù)值，記錄數(shù)據(jù)；加入100 μl終止試劑，混勻，讀值并記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度。

6.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CCL18及3種miRNA的表達(dá)情況：分別收集14例MM腫瘤組織及正常對(duì)照皮膚新鮮組織標(biāo)本，Trizol法提取組織總RNA，使用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用SYBR Green Real?time PCR試劑盒按其說明書擴(kuò)增目的基因。反應(yīng)體系如下：cDNA引物1 μl，上下游引物各0.4 μl，SYBR Green Mix 10 μl及去離子水8.2 μl，引物序列見表3。反應(yīng)條件：95℃5 min；95 ℃ 10 s；60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60℃1 min，95℃15 s。根據(jù)所得的Ct值，以3磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）或U6為內(nèi)參照，△Ct＝（待測(cè)基因Ct-內(nèi)參基因Ct），△△Ct＝腫瘤組織△Ct-對(duì)照正常皮膚組織△Ct，計(jì)算2-△△Ct，得到腫瘤組織樣品待測(cè)基因相對(duì)于正常皮膚組織的相對(duì)表達(dá)量。

表3 待測(cè)基因及內(nèi)參照的引物序列

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、靶向調(diào)控CCL18基因3′UTR的miRNA預(yù)測(cè)

根據(jù)miRanda和TargetScan對(duì)CCL18 mRNA?miRNA在線預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行整合分析，CCL18基因（NM_002988，439 bp）的3′UTR 具有多條可能的miRNA靶向序列，其中mirSVR score和PhastCons score均較高的為miR?183、miR?128、miR?33a，并作為后續(xù)通過熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)研究其結(jié)合特性的目標(biāo)miRNAs。各miRNA與CCL18 3′UTR的序列示意圖見圖1。

圖1 CCL18 3′UTR和miR?183、miR?128、miR?33a序列結(jié)合示意圖 mirSVR score：熱力學(xué)穩(wěn)定性；PhastCons score：保守性

二、不同miRNA與CCL18 3′UTR結(jié)合的熒光素酶活性檢測(cè)

miR?183（3組相對(duì)熒光強(qiáng)度：11.63± 0.42，4.86±0.39，2.41 ± 0.13）、miR?128（8.80 ± 0.49，5.01 ± 0.54，2.39 ± 0.05）、miR?33a（6.41 ± 0.47，6.16 ± 0.22，2.65 ±0.10）的3′UTR突變型、3′UTR野生型組及空白對(duì)照組間熒光素酶表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為394.94、117.90、94.33，均P＜ 0.001）。兩兩多重比較顯示，miR?183和miR?128的3′UTR突變型組熒光素酶表達(dá)量均顯著高于3′UTR野生型組及空白對(duì)照組（均P＜0.05），而miR?33a的3′UTR突變型和3′UTR野生型組熒光素酶表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。

三、MM中CCL18 mRNA和不同miRNA的表達(dá)及相關(guān)性

14例MM患者的臨床和病理學(xué)資料見表4。14例MM組織標(biāo)本中CCL18 mRNA的表達(dá)高于正常對(duì)照皮膚組織，相對(duì)表達(dá)量為3.52±1.68。miR?183、miR?128、miR?33a

的表達(dá)均低于對(duì)照正常皮膚組織，相對(duì)表達(dá)量分別為0.49±0.32、0.30±0.20、0.46±0.40。經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，14例MM組織中CCL18 mRNA表達(dá)量與miR?128表

達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（相關(guān)系數(shù)rs=-0.548，P＜ 0.05），而與miR?183、miR?33a表達(dá)量相關(guān)性均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（rs分別為-0.367、-0.185，均P＞0.05）。

表4 14例CMM患者的臨床及病理學(xué)資料

討 論

CCL18是一種主要由單核巨噬細(xì)胞及樹突細(xì)胞產(chǎn)生的趨化性細(xì)胞因子，在乳腺癌、卵巢癌、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤等多種腫瘤中發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移的重要作用，并成為疾病診斷、預(yù)后判斷及治療的潛在靶點(diǎn)［2］。本課題組通過人類全基因組表達(dá)譜芯片首次發(fā)現(xiàn)CCL18基因在MM中表達(dá)顯著升高，并通過組織學(xué)及細(xì)胞學(xué)研究證實(shí)CCL18促進(jìn)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移，是MM潛在致病基因之一［6?7］。然而，腫瘤中CCL18基因的調(diào)控機(jī)制尚未明確，未確定其拮抗性受體。Wang等［9］發(fā)現(xiàn)，乳腺癌中上調(diào)miR?181b能抑制CCL18誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，miR?181b可能通過下調(diào)NF?κB的表達(dá)發(fā)揮作用。此外，上調(diào)let7a也可逆轉(zhuǎn)CCL18誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲，let7a可能通過作用于靶基因Lin28 3′UTR發(fā)揮作用［10］。

miRNA是一類長(zhǎng)度為20～22個(gè)核苷酸的非編碼小RNA分子，通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，在黑素瘤中miRNA主要作為癌基因或抑癌基因來調(diào)節(jié)黑素細(xì)胞及黑素瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為、調(diào)節(jié)腫瘤免疫反應(yīng)、影響黑素瘤細(xì)胞增殖及凋亡、遷移及侵襲、表觀遺傳等，如miR?211、miR?196a、miR?210、let?7b、miR?182、miR?205、miR?182、miR?29c等［11?13］。miRNA可通過與靶基因mRNA的3′UTR結(jié)合調(diào)節(jié)某些關(guān)鍵基因的表達(dá)，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Alderman等［14］發(fā)現(xiàn)，miR?15a直接靶向作用于細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白4（CDCA4）基因抑制黑素瘤生長(zhǎng)及侵襲。Xu等［15］發(fā)現(xiàn)，miR?9通過靶向作用于神經(jīng)纖毛蛋白1（NRP1）基因發(fā)揮抑制黑素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲的作用。Hao等［16］發(fā)現(xiàn)，miR?137靶向作用于p21激活激酶2（PAK2）抑制黑素瘤細(xì)胞增殖。

我們用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)驗(yàn)證及在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)MM組織中CCL18 mRNA與miRNA進(jìn)行表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)miR?128能夠靶向作用人MM組織中CCL18基因的3′UTR，并與CCL18表達(dá)具有顯著的負(fù)相關(guān)，提示黑素瘤中miR?128可能通過參與調(diào)控CCL18的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

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Prediction of miRNA regulating the potential cancer?promoting gene CCL18 in cutaneous malig?nant melanoma and correlation analysis between CCL18 mRNA and miRNA expression

Song Hao,Bu Wenbo,Ni Nana,Wen Sijian,Xiong Jingshu,Qi Jinliang,Xu Xiulian,Sun Jianfang
Department of Pathology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Song H,Ni NN,Wen SJ,Xiong JS,Xu XL,Sun JF）;Department of Dermatologic Surgery,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Bu WB）;State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology,School of Life Sciences,Nanjing University,Nanjing 210023,China（Qi JL）

s:Xu Xiulian,Email:xxlqjl@sina.com;Sun Jianfang,Email:fangmin5758@aliyun.com

ObjectiveTo explore the miRNA regulating the potential cancer?promoting gene CCL18 in cutaneous malignant melanoma.MethodsBioinformatics analysis was conducted by using online software miRanda and TargetScan,so as to predict the miRNA targeting CCL18 gene.Three kinds of CCL18 3′UTR dual?luciferase reporter vectors,including mutant 3′UTR vector（mutant 3′UTR group）,wild?type 3′UTR vector（wild?type 3′UTR group）and empty vector（blank control group）,as well as miRNA vectors carring selected miRNAs were constructed according to human gene sequence analysis,and then were used to co?transfect 293T cells.After 48?hour treatment,the cells were lysed for detection of luciferase activity.Real?time fluorescence?based quantitative PCR was performed to measure the expression of CCL18 and selected miRNA in 14 fresh malignant melanoma tissue specimens and 14 paracancerous normal skin tissue specimens（control tissues）,and their correlations were analyzed.ResultsOnline software analysis showed that some miRNAs were identified to target the 3′UTR of CCL18 gene,including miR?183,miR?128 and miR?33a.Luciferase reporter vectors and miRNA vectors were constructed successfully.As luciferase activity assay showed,when miR ?183 and miR?128 were bound to the CCL18 3′UTR,the luciferase activities were significantly higher in their mutant 3′UTR groups（11.63 ± 0.42;8.80 ± 0.49）than in their wild?type 3′UTR groups（4.86 ± 0.39;5.01 ± 0.54;bothP＜ 0.05）and blank control groups（2.41 ± 0.13;2.39 ± 0.05;bothP＜ 0.01）,while there were no significant differences between miR?33a?binding mutant 3′UTR group（6.41 ± 0.47）and miR?33a?binding wild?type 3′UTR group（6.16 ± 0.22,P＞ 0.05）.Real?time fluorescence?based quantitative PCR revealed higher mRNA expression of the CCL18 gene（3.52 ± 1.68）,but lower expression of miR?183（0.49 ± 0.32）,miR?128（0.30 ± 0.20）and miR?33a（0.46 ± 0.40）in the malignant melanoma tissues compared with the control tissues.The mRNA expression of the CCL18 gene was negatively correlated with the expression of miR?128（rs=-0.548,P＜ 0.05）,but showed no significant correlations with the expression of miR?183 and miR?33a（bothP＞ 0.05）.ConclusionmiR?128 may play a role in regulating the potential malignant melanoma?promoting gene CCL18.

Melanoma;MicroRNAs;RNA,small interfering;Chemokine CCL18

徐秀蓮，Email：xxlqjl@sina.com；孫建方，Email：fangmin5758@aliyun.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.09.003

國(guó)家自然科學(xué)基金（81772916）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK2012505、BK20171132）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81772916）;Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK2012505,BK20171132）

2016?10?24）

（本文編輯：周良佳 顏艷）