王唯嘉 康曉靜 王朋 普文靜 于世榮 趙娟 梁俊琴 梁勝男

830000烏魯木齊，新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚性病科（王唯嘉、康曉靜、王朋、于世榮、趙娟、梁俊琴、梁勝男），病理科（普文靜）

哈薩克族毛囊角化病一家系A(chǔ)TP2A2基因突變研究

王唯嘉 康曉靜 王朋 普文靜 于世榮 趙娟 梁俊琴 梁勝男

830000烏魯木齊，新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚性病科（王唯嘉、康曉靜、王朋、于世榮、趙娟、梁俊琴、梁勝男），病理科（普文靜）

目的探討哈薩克族毛囊角化病一家系患者ATP2A2基因突變。方法收集哈薩克族毛囊角化病49人家系的臨床資料，采集44名家系成員和100例無親緣關(guān)系健康人外周血，提取基因組DNA。采用PCR和DNA測序?qū)υ摷蚁颠M(jìn)行ATP2A2基因突變檢測。結(jié)果該家系毛囊角化病遺傳方式屬于常染色體顯性遺傳。家系中11例患者在ATP2A2基因12號外顯子的剪切位點(diǎn)發(fā)生雜合突變（1288?1G→A），即第1288?1位堿基由G突變?yōu)锳，而家系中33例正常成員及100例健康對照均未發(fā)現(xiàn)該突變。結(jié)論該家系毛囊角化病發(fā)病可能是由ATP2A2基因12號外顯子的剪切位點(diǎn)發(fā)生雜合突變（1288?1G→A）所致。

Darier病；DNA突變分析；系譜；基因，ATP2A2；哈薩克族

毛囊角化?。╧eratosis follicularis，KF）又稱Darier病是一種以表皮細(xì)胞角化不良為特征的常染色體顯性遺傳病，皮損多見于前胸、頭、面、頸、四肢屈側(cè)等脂溢性區(qū)域，表面富有油膩性鱗屑，多對稱分布，可伴有掌跖角化以及特征性甲改變，日曬、潮濕和心理壓力可使病情加重［1］。1993年，Bashir等［2］和Craddock等［3］對英國兩個(gè)KF家系行連鎖分析，首次將該病的致病基因定位于12q23?12q24.1上。到目前為止，國內(nèi)外已報(bào)道超過187種ATP2A2基因突變（http：//hgmd.cf.ac.uk），包括錯(cuò)義突變、無義突變、同義突變、剪切位點(diǎn)突變、移碼突變、單個(gè)堿基缺失或插入及動(dòng)態(tài)突變等。KF患者中基因無突變熱點(diǎn)，國外學(xué)者認(rèn)為其突變分布有向ATP2A2基因兩端集中的傾向［4］，目前尚未有哈薩克族KF患者基因突變的報(bào)告。哈薩克族是新疆維吾爾自治區(qū)人口較多的少數(shù)民族之一，與外界的交往較少，世居在草原上，哈薩克人有7代以內(nèi)血緣關(guān)系者不能結(jié)婚，因此很少有近親婚姻關(guān)系，從而減少了近親結(jié)婚帶來的遺傳疾病。我們收集一少見的四代49人哈薩克族KF大家系［5］，應(yīng)用PCR和DNA直接測序?qū)TP2A2基因進(jìn)行突變檢測，分析其與哈薩克族KF的相關(guān)性。

一、資料與方法

（一）臨床資料：先證者（Ⅱ5）為58歲男性，哈薩克族，自10歲起無明顯誘因在胸腹部出現(xiàn)數(shù)個(gè)米粒大皮疹，隨年齡增長皮損逐漸增大，融合成不規(guī)則疣狀物，皮損顏色為暗褐色，表面油膩，有糜爛滲出，伴輕微瘙癢感，夏季加重，冬季緩解，發(fā)病以來未曾診治。入院前2個(gè)月四肢、手背部出現(xiàn)數(shù)個(gè)新發(fā)油膩性黑褐色丘疹，原皮損出現(xiàn)膿性滲出，伴惡臭，指甲增厚、質(zhì)脆易裂。皮膚科檢查：患者軀干四肢對稱分布數(shù)個(gè)米粒至黃豆大小實(shí)性黃褐色毛囊性丘疹，覆蓋油膩性棕色痂皮，部分丘疹可見糠狀鱗屑，丘疹融合成多個(gè)橢圓形和不規(guī)則形疣狀斑塊，略高于皮面，見圖1。腹部皮損組織病理：表皮角化不良伴棘層增厚，可見絨毛、圓體細(xì)胞和谷粒細(xì)胞，真皮淺層炎癥細(xì)胞浸潤（圖2）。先證者母親和女兒也表現(xiàn)出相似的臨床特征。由先證者追溯調(diào)查該家系四代共49人，其中15人患病，家系中無近親婚配史，見圖3。根據(jù)病史、臨床特點(diǎn)、病理學(xué)特點(diǎn)，15例患者均診斷為KF［5］。根據(jù)Sakuntabhai等［6］的診斷標(biāo)準(zhǔn)，將四代哈薩克族KF患者的臨床表現(xiàn)分為輕度、中度和重度，其中4例為輕度（Ⅲ14、Ⅲ16、Ⅳ12、Ⅳ14），3例為中度（Ⅲ3、Ⅲ15、Ⅳ13），4例為重度（Ⅱ5、Ⅲ5、Ⅳ11、Ⅳ16），4例不詳（Ⅰ2、Ⅱ1、Ⅱ3、Ⅲ7）?；颊撷?、Ⅱ5患有冠心病，Ⅲ5患有高血壓。四代中患者發(fā)病年齡均在青少年期，家系中未出現(xiàn)下一代較上一代臨床癥狀更嚴(yán)重的現(xiàn)象。

圖1 患者軀干四肢（1A［5］、1B）可見毛囊性丘疹，覆蓋油膩性棕色痂皮

圖2 皮損組織病理 表皮過度伴角化不全，棘層松解（HE×100）

（二）方法：

1.外周血基因組DNA提?。赫鞯没颊咄夂螅杉_克族家系內(nèi)43人外周血各5.0 ml，其中患者11例，未患病者32人，同時(shí)采集100例無親緣關(guān)系的健康人外周血各5.0 ml，提取基因組DNA作為對照。血樣均經(jīng)2%乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，-80℃保存?zhèn)溆谩２捎肈NA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取基因組DNA。

2.PCR擴(kuò)增ATP2A2基因全部外顯子：通過NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）查取ATP2A2基因mRNA序列，BLAST得到該基因序列，采用Primer3.0設(shè)計(jì)特異性引物對ATP2A2基因的21個(gè)編碼外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增（http：//www.genome.wi.mit.edu/csi?bin/primer/primer3?www.cgi）。見表1。PCR反應(yīng)：總體系25 μl，內(nèi)含有200 ng基因組DNA，100 μmol/L dNTP，引物 4 pmol，1.2 mmol/L MgCl2和1 U 聚合酶（日本Takara生物技術(shù)公司）。每個(gè)反應(yīng)的步驟為：95℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)：94℃變性30 s，52～56℃退火30 s，72℃延伸1 min。最后，將反應(yīng)混合物在72℃中延伸5 min。所有PCR產(chǎn)物進(jìn)行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳。PCR產(chǎn)物純化及測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

二、結(jié)果

PCR產(chǎn)物測序發(fā)現(xiàn)，11例患者ATP2A2基因第12號外顯子剪切位點(diǎn)1288?1位堿基由鳥嘌呤（G）轉(zhuǎn)化為腺嘌呤（A）。而家系中未患病的32名成員及100例無親緣關(guān)系的健康人均未見改變，故1288?1G→A為該家系的突變位點(diǎn)。見圖4。

表1 ATP2A2基因21對外顯子引物、產(chǎn)物大小及退火溫度

圖3 家系圖

圖4 ATP2A2基因12號外顯子和內(nèi)含子部分序列圖 箭頭所示為先證者ATP2A2基因的第1288?1位堿基發(fā)生G→A突變。4A：家系內(nèi)患者；4B：正常家系成員；4C：無親緣關(guān)系健康對照

三、討論

KF是一種常染色體顯性遺傳的角化不良性皮膚病。Sakuntabhai等［7］將位于12q23?24.1區(qū)域內(nèi)編碼肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-ATP 酶 2（srco/endoplasmic reticulum Ca2+ATPase type 2，SERCA2）的ATP2A2基因進(jìn)一步確定為KF的致病基因，該基因在皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)高度表達(dá)。SERCA2為鈣泵蛋白，其功能主要為調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，在調(diào)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)外鈣離子濃度方面有重要作用。SERCA2屬于P型鈣離子ATP酶家族，也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中大量鈣離子聚集的離子泵。

我們收集一四代49人哈薩克族KF大家系，通過對ATP2A2基因分析，首次發(fā)現(xiàn)一個(gè)ATP2A2基因的剪切位點(diǎn)雜合突變，第12號外顯子第1288?1位堿基由鳥嘌呤（G）轉(zhuǎn)化為腺嘌呤（A），此突變可能導(dǎo)致ATP2A2基因在翻譯過程中產(chǎn)生錯(cuò)誤的剪切位點(diǎn)，致其翻譯的ATP2A2核酸序列發(fā)生改變，進(jìn)而影響其編碼的SERCA2蛋白結(jié)構(gòu)及功能。

本文哈薩克族KF家系遺傳模式具有以下特點(diǎn)：①子女為患者，其父母至少一方患病；②家系中所有患者均攜帶有ATP2A2基因1288?1G→A剪切位點(diǎn)突變，健康成員中未檢測具有ATP2A2基因突變；③一個(gè)患者的家族中，可以連續(xù)幾代出現(xiàn)此病患者，呈垂直遺傳；④無病的家系成員與健康人結(jié)婚，后代不再有此病。故該家系符合常染色體顯性遺傳［5］。家系中患者的突變位點(diǎn)相同，但病情嚴(yán)重程度、發(fā)病年齡不完全相同，部分患者伴發(fā)心血管疾病，可見，即使是同一家系、同一突變也可導(dǎo)致不同表型，這與Zheng等［8］研究相符。推測影響該家系表型的因素有：①家系中患者均攜帶有相同的ATP2A2基因1288?1G→A剪切位點(diǎn)突變，此突變可能是該家系患者的遺傳學(xué)基礎(chǔ)；②外界環(huán)境（如溫度、濕度等）可能也作為KF的誘因影響該家系中患者表型；③該家系中部分患者（Ⅰ2、Ⅱ5、Ⅲ14）同時(shí)患有心血管疾病，雖不能明確其與KF之間的關(guān)系，但已有動(dòng)物模型研究［9］提示在肌原纖維Ca2+敏感性增高的情況下，KF患者患心力衰竭的可能性提高。ATP2A2基因編碼的SERCA2共有2個(gè)可變剪切體，SERCA2a及SERCA2b。SERCA2a主要分布在人類心肌與骨骼肌中，SERCA2b主要分布在皮膚和大腦的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，不同突變導(dǎo)致SERCA2b各個(gè)單體的功能缺陷可相互影響，最終引起SERCA2b總體功能改變，導(dǎo)致表皮內(nèi)角質(zhì)形成細(xì)胞的黏附和分化功能異常，促進(jìn)本病發(fā)生。雖然本研究不能證實(shí)ATP2A2基因突變是KF患者患心血管疾病的原因，但不排除該家系A(chǔ)TP2A2基因發(fā)生的雜合突變可能導(dǎo)致SERCA2單倍不足，從而導(dǎo)致患心血管疾病的可能性。

［1］Tavadia S,Mortimer E,Munro CS.Genetic epi?demiology of Darier′s disease:a population study in the west of Scotland［J］.Br J Dermatol,2002,146（1）:107?109.DOI:10.1046/j.1365?2133.2002.04559.x.

［2］Bashir R,Munro CS,Mason S,et al.Localisation of a gene for Darier′s disease［J］.Hum Mol Genet,1993,2（11）:1937?1939.

［3］Craddock N,Dawson E,Burge S,et al.The gene for Darier′s disease maps to chromosome 12q23?q24.1［J］.Hum Mol Genet,1993,2（11）:1941?1943.

［4］Miyauchi Y,Daiho T,Yamasaki K,et al.Comprehensive analysis of expression and function of 51 sarco（endo）plasmic reticulum Ca2+?ATPase mutants associated with Darier disease［J］.J Biol Chem,2006,281（32）:22882 ?22895.DOI:10.1074/jbc.M601966200.

［5］宋珍珍,徐益明,康曉靜.毛囊角化病一家系15例［J］.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志,2010,27（1）:113?114.DOI:10.3760/cma.j.issn.1003?9406.2010.01.048.

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［7］Sakuntabhai A,Burge S,Monk S,et al.Spectrum of novel ATP2A2 mutations in patients with Darier′s disease［J］.Hum Mol Genet,1999,8（9）:1611?1619.

［8］Zheng L,Jiang H,Mei Q,et al.Identification of two novel Darier disease?associated mutations in the ATP2A2 gene［J］.Mol Med Rep,2015,12（2）:1845?1849.DOI:10.3892/mmr.2015.3605.

［9］Prasad V,Lorenz JN,Lasko VM,et al.SERCA2 haploinsuffi?ciency in a mouse model of Darier disease causes a selective predisposition to heart failure［J］.Biomed Res Int,2015,2015:251598［2015?12?03］.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4433638.DOI:10.1155/2015/251598.

Mutation analysis of the ATP2A2 gene in a Kazakh family with Darier′s disease

Wang Weijia,Kang Xiaojing,Wang Peng,Pu Wenjing,Yu Shirong,Zhao Juan,Liang Junqin,Liang Shengnan
Department of Dermatology and Venereology,People′s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumqi 830000,China（Wang WJ,Kang XJ,Wang P,Yu SR,Zhao J,Liang JQ,Liang SN）;Department of Pathology,People′s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumqi 830000,China（Pu WJ）

Kang Xiaojing,Email:drkangxj666@163.com

ObjectiveTo analyze mutations in the ATP2A2 gene in a Kazakh family with Darier′s disease.Methods Clinical data were collected from 49 members from a family with Darier′s disease,and peripheral blood samples were obtained from 44 family members and 100 unrelated healthy people.Genomic DNA was extracted from these blood samples.PCR and DNA sequencing were performed to detect mutations in the ATP2A2 gene.ResultsDarier′s disease was inherited in an autosomal dominant manner in this family.A G→A heterozygous mutation（1288?1G→A）was identified at position 1288?1 at the splice site in exon 12 of the ATP2A2 gene in 11 patients in this family,but not in 33 healthy members or 100 healthy controls.ConclusionDarier′s disease in this family may be caused by the heterozygous mutation（1288?1G→A）at the splice site in exon 12 of the ATP2A2 gene.

Darier disease;DNA mutational analysis;Pedigree;Gene,ATP2A2;Kazakh

康曉靜，Email：drkangxj666@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.09.015

國家自然科學(xué)基金（81360235）

Fund program:National Natural Science Foundation of China（81360235）

2016?08?25）

（本文編輯：尚淑賢）