彭敏，石美琴，童曉東，楊水英，許彥

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康咳靈合劑中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ含量測定

彭敏，石美琴，童曉東，楊水英，許彥

南通市中醫(yī)院，江蘇南通 226001

測定康咳靈合劑中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ的含量。采用HPLC，色譜柱為Poroshell 120 Ec-C18柱（4.6 mm×150 mm，4 μm），以乙腈（A）-水（B）作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，檢測波長為210 nm，流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃。重樓皂苷Ⅰ在1.009～10.09 μg（＝0.999 6）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為97.31%（RSD＝2.05%，＝6）；重樓皂苷Ⅱ在0.640 5～6.405 μg（＝0.999 8）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為96.41%（RSD＝1.67%，＝6）。本方法簡便、重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于測定康咳靈合劑中重樓皂苷的含量。

康咳靈合劑；高效液相色譜法；重樓皂苷Ⅰ；重樓皂苷Ⅱ

咳靈合劑是依據(jù)本院臨床經(jīng)驗(yàn)方研制而成的院內(nèi)制劑，由矮地茶、重樓、百部、南沙參、炙枇杷葉、天冬、甘草等組成，具有潤肺祛痰、止咳平喘的功效，善于治療熱、痰火型咳嗽。重樓是康咳靈合劑的主要組成之一，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚功效。現(xiàn)代研究表明，甾體皂苷是重樓的主要活性成分，也是重樓藥材質(zhì)量控制的重要標(biāo)準(zhǔn)[1]。因此，本研究建立重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ的含量測定方法，作為控制康咳靈合劑質(zhì)量的方法之一。

1 儀器與試藥

DIONEX-UltiMate 3000高效液相色譜儀，紫外檢測器（賽默飛世爾科技有限公司）；JP-040S型超聲波清洗機(jī)（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）；ME104/02電子分析天平（梅特勒-托利多有限公司）；EPED-S2- 30DH型超純水器（南京普益達(dá)科技發(fā)展有限公司）。

重樓皂苷Ⅰ對照品（批號111590-201103）、重樓皂苷Ⅱ（批號111591-201103）對照品，中國食品藥品檢定研究院；康咳靈合劑為本院自制（批號分別為160113、160314、160321）；乙腈為色譜純，水為自制超純水，甲醇、正丁醇、丙酮為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱：Poroshell 120 Ec-C18（4.6 mm×150 mm，4 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～30 min，38%A；30～50 min，38%～45%A；50～75 min，45%～55%A）；流速：1 mL/min；檢測波長：210 nm；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30 ℃。在此條件下，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ的出峰時(shí)間分別為44.91、49.93 min，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ的色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度均大于1.50，陰性對照在與重樓皂苷對照品相同的保留時(shí)間處無色譜峰干擾。色譜圖見圖1。

注：A.混合對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.重樓皂苷Ⅱ；2.重樓皂苷Ⅰ

2.2 對照品溶液的制備

取重樓皂苷Ⅰ對照品2.018 0 mg、重樓皂苷Ⅱ?qū)φ掌?.281 1 mg，精密稱定，加甲醇溶解，定容至10 mL，即得混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取本品20 mL，用水飽和的正丁醇萃取4次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)帽礈?次，每次10 mL，棄去丙酮液，殘?jiān)舾?，用甲醇溶解，定容?0 mL。

2.4 陰性對照溶液的制備

依處方組成，制成缺重樓的康咳靈合劑，按“2.3”項(xiàng)下方法制備陰性對照溶液。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ?qū)φ掌啡芤?、10、20、30、40、50 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，以重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程。重樓皂苷Ⅰ：＝1.432 5＋0.106 4，線性范圍為1.009～10.09 μg，＝0.999 6。重樓皂苷Ⅱ：＝1.589 2－0.000 7，線性范圍為0.640 5～6.405 μg，＝0.999 8。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ?qū)φ掌啡芤?0 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計(jì)算得重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ峰面積的RSD分別為1.29%、1.57%，表明儀器的精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號（160314）的樣品6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，測定峰面積，計(jì)算得樣品中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ的平均含量分別為0.185 5、0.094 7 mg/mL，RSD分別為2.10%、2.43%，結(jié)果表明本方法的重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、16 h進(jìn)樣，測定峰面積，計(jì)算得重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ峰面積RSD分別為1.68%、2.12%，表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量（批號160314）的樣品6份，每份10 mL，分別精密加入重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ混合對照品適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制成加樣回收供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，測定峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)

2.6 樣品含量測定

取3批樣品（批號160113、160314、160321），每批取2份，按“2.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，測定峰面積，并計(jì)算重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（mg/mL）

3 討論

本試驗(yàn)采用水飽和的正丁醇作為萃取溶劑，并考察了萃取溶劑倍量對重樓皂苷含量測定的影響。經(jīng)4倍量溶劑萃取后，重樓皂苷得率達(dá)到最大，繼續(xù)增大溶劑量對重樓皂苷得率并無顯著影響。綜合考慮，選擇萃取溶劑的量為樣品取樣體積的4倍，分4次萃取。

重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ?qū)儆阽摅w皂苷，難溶于丙酮[2]，因此選擇丙酮作為洗滌溶劑，除去正丁醇提取物中的雜質(zhì)。此外，本試驗(yàn)還考察了丙酮作為沉淀試劑提取正丁醇提取物水溶液中的重樓皂苷的方法。由于本品重樓皂苷含量較低，沉淀物的析出量較少，分離后對重樓皂苷含量測定影響較大。因此，選擇丙酮洗滌法作為除雜方法。

在探索色譜條件的過程中，本試驗(yàn)參考了《中華人民共和國藥典》中重樓藥材含量測定方法[3]，選擇了乙腈-水梯度洗脫的步驟，結(jié)果基線漂移嚴(yán)重，目標(biāo)成分分離不理想。因此，結(jié)合有關(guān)報(bào)道[4-5]，參照乙腈-水（42∶58）[6]的比例，降低初始流動(dòng)相的極性，減慢流動(dòng)相的梯度速度后，分離度較好，目標(biāo)峰與雜質(zhì)分離清晰，保留時(shí)間適中。

[1] 黃賢校,高文遠(yuǎn),滿淑麗,等.重樓屬藥用植物皂苷類化學(xué)成分及其生源途徑的研究進(jìn)展[J].中草藥,2009,40(3)：483-489.

[2] 匡海學(xué).中藥化學(xué)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2003：293.

[3] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2015：260.

[4] 李懿,何佳,趙庭周,等.HPLC同時(shí)測定不同產(chǎn)地滇重樓中的6種重樓皂苷[J].中成藥,2012,34(1)：113-116.

[5] 韓燕全,洪燕,夏倫祝,等.UPLC-ELSD法同時(shí)測定重樓中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ[J].中草藥,2012,43(2)：305-307.

[6] 楊培民,倪健,曹廣尚.HPLC法測定重樓克感滴丸中重樓皂苷Ⅰ和重樓皂苷Ⅱ的含量[J].中華中醫(yī)藥雜志,2012,27(3)：678-680.

Content Determination of Polyphyllin Ⅰ and Ⅱ inMixture by HPLC

PENG Min, SHI Mei-qin, TONG Xiao-dong, YANG Shui-ying, XU Yan

To establish a method for determining the contents of polyphyllin Ⅰ and polyphyllin Ⅱ inMixture.The contents of polyphyllin Ⅰ and Ⅱ were determined by HPLC gradient elution. Poroshell 120 Ec-C18 column (4.6 mm × 150 mm, 4 μm) was used; Acetonitrile-water (A∶B) was set as the mobile phase; the flow rate was 1.0 mL/min; the detection wavelength was 210 nm; column temperature was 30 ℃.Polyphyllin Ⅰ showed good linear relationship in the range of 1.009–10.09 μg (=0.999 6), and the average recovery was 97.31% (RSD=2.05%,=6). Polyphyllin Ⅱ showed good linear relationship in the range of 0.640 5– 6.405 μg (=0.999 8), and the average recovery was 96.41% (RSD=1.67%,=6).The method is simple, with good repeatability and accurate results, which can be used to determine the contents of polyphyllin Ⅰ and Ⅱ inMixture.

Mixture; HPLC; polyphyllin Ⅰ; polyphyllin Ⅱ

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.11.018

R284.1

A

1005-5304(2017)11-0075-03

（2017-03-16）

（2017-04-11；編輯：陳靜）

南通市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科技項(xiàng)目（WQ2015065）

童曉東，E-mail：924822769@qq.com