張麗先，王學(xué)方，曹靜亞，李曉，李自紅，李飛飛，李智寧，寧二娟，宋夢嬌，魏悅

?

銀翹柴黃顆粒質(zhì)量控制方法研究

張麗先1，2，王學(xué)方2，3，曹靜亞1，2，李曉2，3，李自紅1，2，李飛飛1，2，李智寧1，2，寧二娟1，2，宋夢嬌1，2，魏悅1，2

1.河南科高中標(biāo)檢測技術(shù)有限公司，河南鄭州 450000；2.河南省生物技術(shù)開發(fā)中心，河南鄭州450000； 3.河南省科高植物天然產(chǎn)物開發(fā)工程技術(shù)有限公司，河南鄭州 450002

建立銀翹柴黃顆粒質(zhì)量控制方法。采用薄層色譜法鑒別銀翹柴黃顆粒中金銀花、柴胡、黃芩及甘草，HPLC測定連翹酯苷A的含量。在選定的色譜條件下，薄層色譜斑點(diǎn)清晰、分離度好，陰性對照未見干擾。含量測定連翹酯苷A在0.029 6～0.474 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為99.73%，RSD＝1.18%。本方法準(zhǔn)確、簡便，能夠有效控制銀翹柴黃顆粒的質(zhì)量。

銀翹柴黃顆粒；質(zhì)量控制；薄層色譜法；高效液相色譜法；含量測定

銀翹柴黃顆粒是基于銀翹散辛涼透表、清熱解毒的功效和小柴胡湯和解少陽、和胃降逆的功效[1-2]，通過不同藥味間合理加減、調(diào)劑組方制備而成的顆粒劑。該方劑由連翹、金銀花、柴胡、黃芩、甘草等7味中藥組成，具有清熱、抗炎、抑菌、抗感染、抗氧化、抗病毒、解熱鎮(zhèn)痛的功效。連翹作為君藥，用量較大，連翹酯苷A為連翹中含量較高的主要活性成分之一，具有與復(fù)方制劑相似的功效，如抗氧化、抗菌、抗感染、解熱等[3-4]。

該制劑藥味眾多，成分復(fù)雜，為更好地控制銀翹柴黃顆粒的質(zhì)量一致性，保證用藥安全有效，本試驗(yàn)采用薄層色譜法對銀翹柴黃顆粒復(fù)方制劑中金銀花、柴胡、黃芩和甘草進(jìn)行定性鑒別，同時(shí)采用HPLC對銀翹柴黃顆粒制劑中主要有效成分連翹酯苷A進(jìn)行定量測定，結(jié)合定性鑒別和含量測定建立銀翹柴黃顆粒質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津），KH5200型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司），ME-204型微量分析天平（賽多利斯公司），YELA SB-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司），HH4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司），Good-See-20E上?？普艹上裣到y(tǒng)。

3批銀翹柴黃顆粒（批號20140801、20140802、20140803，依次編號為1、2、3），河南省科高植物天然產(chǎn)物開發(fā)工程技術(shù)有限公司提供。對照藥材金銀花（批號121060-201208）、黃芩（批號120955-201309）、柴胡（批號120992-201209）、甘草（批號120904- 201319），中國食品藥品檢定研究院；對照品綠原酸（批號110753-200413）、黃芩苷（批號110715- 200815）、柴胡皂苷a（批號110831-200302）、柴胡皂苷d（批號110778-200506）、甘草苷（批號111610- 201106）、連翹酯苷A（批號111810-201001），中國食品藥品檢定研究院；硅膠G板、硅膠H板及聚酰胺板，青島海洋化工廠；乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 金銀花 分別取本品0.5 g，加甲醇15 mL，放置12 h，過濾，濾液作為供試品溶液，編號為1～3。另取金銀花對照藥材及按處方工藝制成的不含金銀花的樣品，同上法制成對照藥材溶液、陰性供試液。再取綠原酸對照品10 mg，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各6 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，以乙酸丁酯-甲酸-水（7∶2.5∶2.5）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置365 nm紫外光燈下檢視。3批供試品色譜中在與綠原酸對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色熒光斑點(diǎn)。在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯3個(gè)相同顏色的斑點(diǎn)，供試品平行性良好，陰性供試液無干擾。

2.1.2 黃芩 分別取本品1 g，加乙酸乙酯-甲醇（3∶1）的混合溶液30 mL，加熱回流30 min，放冷，過濾，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，上清液作為供試品溶液，編號為1～3。另取黃芩對照藥材及按處方工藝制成的不含黃芩的樣品，同法制成對照藥材溶液、陰性供試液。再取黃芩苷對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各2 μL，點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以36%醋酸溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%FeCl3乙醇溶液，分別置日光和365 nm紫外光燈下檢視。3批供試品色譜和黃芩苷對照品及對照藥材色譜相應(yīng)的位置顯相同的暗色斑點(diǎn)，黃芩苷分離度欠佳，供試品平行性良好，陰性供試液有干擾。

2.1.3 柴胡 分別取本品1 g，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，放冷，過濾，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨試液50 mL洗滌1次，再用正丁醇飽和的水50 mL洗滌1次，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液，編號為1～3。另取柴胡對照藥材及按處方工藝制成的不含柴胡的樣品，同法制成對照藥材溶液、陰性供試液。再取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d對照品，分別加甲醇制成每1 mL含柴胡皂苷a 0.5 mg、柴胡皂苷d 0.5 mg的對照品溶液，另配制每1 mL含柴胡皂苷a、柴胡皂苷d各0.5 mg的混合對照溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-乙醇-水（8∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，在60 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置365 nm紫外光燈下檢視。3批供試品色譜在對照藥材、對照品顯色位置處顯相同顏色斑點(diǎn)，其中柴胡皂苷d顯色明顯，柴胡皂苷a色彩暗淡，供試品平行性良好，陰性供試液無干擾。

2.1.4 甘草 分別取本品1 g，加乙醚40 mL，加熱回流1 h，過濾，棄去乙醚液，藥渣加甲醇30 mL，加熱回流1 h，過濾，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗滌3次，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液，編號為1～3。另取甘草對照藥材及按處方工藝制成的不含甘草的樣品，同法制成對照藥材溶液和陰性供試液。再取甘草苷對照品，加甲醇制成1 mg/mL的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置365 nm紫外光燈下檢視。3批供試品色譜中，與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，供試品平行性良好，陰性供試液無干擾。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 采用Venusil XBP-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.5%醋酸水溶液（15∶85）為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，檢測波長330 nm，進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見圖1。

2.2.2 對照品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取連翹酯苷A對照品7.4 mg，以70%甲醇溶解，定容于25 mL容量瓶中，得濃度為296 μg/mL的連翹酯苷A對照品溶液（臨用新制）。

2.2.3 供試品溶液的制備 取銀翹柴黃顆粒0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率400 W，頻率40 kHz）10 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。將供試品溶液過0.22 μm微孔濾膜，置于1.5 mL進(jìn)樣小瓶中，待液相分析。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 取除連翹外的其余藥味，按工藝要求制成不含連翹的陰性樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取連翹酯苷A對照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL，分別置于50 mL容量瓶中，70%甲醇定容，搖勻。在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下檢測，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得連翹酯苷A的線性方程＝1555750－6632.1，2＝0.999 9。連翹酯苷A在0.029 6～0.474 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

注：A.對照品；B.供試品；C.陰性對照

2.2.6 精密度試驗(yàn) 取濃度為11.84 μg/mL的對照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，峰面積RSD＝0.76%，表明精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于制樣后0、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，結(jié)果連翹酯苷A含量RSD＝1.25%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測，連翹酯苷A的平均含量為0.67%，RSD＝1.62 %，表明本法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取樣品6份，每份準(zhǔn)確稱取0.1 g，加入一定量的連翹酯苷A對照品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 連翹酯苷A加樣回收率試驗(yàn)

2.2.10 樣品含量測定 取樣品3批，按“2.2.3”項(xiàng)下方法處理，每批3個(gè)平行樣，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，以外標(biāo)法計(jì)算出連翹酯苷A的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（%，n＝3）

3 討論

參照藥典方法[5]221能夠?qū)崿F(xiàn)銀翹柴黃顆粒中金銀花的鑒別，綠原酸分離度良好。黃芩的薄層鑒別方法眾多，藥典以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶1∶2）為展開劑[5]301，謝東等[6]以乙酸為展開劑，其中以36%醋酸展開后斑點(diǎn)明顯，黃芩苷分離度較其他方法有提高，但仍然未能實(shí)現(xiàn)黃芩苷與鄰近斑點(diǎn)完全分離，拖尾現(xiàn)象依然明顯，陰性供試液在黃芩苷顯色處有干擾，故黃芩的薄層鑒別有待進(jìn)一步研究。雜質(zhì)對于柴胡的鑒別干擾嚴(yán)重，通過優(yōu)化前處理方法[7]，提高供試液中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的純度，有效改善了分離效果，柴胡皂苷d顯色明顯，可將其作為柴胡鑒別的對照品。藥典以甘草酸銨作對照品為甘草鑒別的方法[5]87對本處方不適用，本試驗(yàn)以甘草苷作為甘草鑒別的對照品，供試品溶液與對照品、對照藥材顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性供試液未見干擾。

本試驗(yàn)對于連翹酯苷A含量測定，考察了不同比例甲醇對連翹酯苷A的溶出度。流動(dòng)相選擇方面，比較了甲醇-水、乙腈-水、不同比例對乙酸對連翹酯苷A分離度及色譜峰對稱性的影響。最終選擇70%甲醇為提取溶劑，乙腈-0.5%乙酸為流動(dòng)相，通過一系列的方法學(xué)考察以及樣品測定表明本方法穩(wěn)定可靠。

本試驗(yàn)通過銀翹柴黃顆粒中多味中藥的定性鑒別，避免了單一藥味鑒別的片面性，較好實(shí)現(xiàn)了對復(fù)方制劑的全面把控，同時(shí)結(jié)合銀翹柴黃顆粒中活性成分連翹酯苷A含量測定方法，能夠?qū)︺y翹柴黃顆粒的質(zhì)量進(jìn)行有效控制。

[1] 陳巧謀,黃禮杰,王煒.銀翹散的臨床應(yīng)用與藥理實(shí)驗(yàn)研究[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2003,9(9)：37-39.

[2] 曹秋梅,許周潔,聶源,等.淺析小柴胡湯近十年藥理研究與臨床應(yīng)用[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2017,13(2)：76-77.

[3] 鄭江萍,葉正德,梁俊,等.連翹藥材及其配方顆粒中連翹酯苷A和連翹苷含量比較[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2014,21(11)：88-91.

[4] 孟祥樂,李俊平,李丹,等.連翹的化學(xué)成分及其藥理活性研究進(jìn)展[J].中國藥房,2010,21(43)：4117-4118.

[5] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2015.

[6] 謝東,路玫.薄層掃描法測定抗毒利咽口服液中黃芩苷的含量[J].西北藥學(xué)雜志,2000,15(4)：151-152.

[7] 趙志軍,王連水.小柴胡顆粒薄層鑒別及黃芩苷含量測定方法的研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2005,11(3)：22-23.

Study on Quality Control Method ofGranules

ZHANG Li-xian1,2, WANG Xue-fang2,3, CAO Jing-ya1,2, LI Xiao2,3, LI Zi-hong1,2, LI Fei-fei1,2, LI Zhi-ning1,2, NING Er-juan1,2, SONG Meng-jiao1,2, WEI Yue1,2

To establish the quality control method ofGranules.Lonicerae Japonicae Flos, Bupleuri Radix, Scutellariae Radix and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma inGranules were identified by TLC, and the content of forsythoside A was detected by HPLC.Under the selected chromatographic conditions, TLC spots were clear, the separating was good, and non-interference was found in negative control. Forsythoside A in calibration curve showed good linearity in the range of 0.029 6–0.474 μg, with average recovery of 99.73%, RSD=1.18%.The method is accurate and simple, which can be used for the quality control ofGranules.

Granules; quality control; TLC; HPLC; content determination

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.11.020

R284.1

A

1005-5304(2017)11-0082-04

（2017-04-19）

（2017-05-09；編輯：陳靜）

河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（152102110115）