燕霞飛，鄭長英，李凱月，萬方浩，2，王俊平*

(1.青島農業(yè)大學植物醫(yī)學學院,山東省植物病蟲害綜合防控重點實驗室,山東青島 266109;2.中國農業(yè)科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室,北京 100193)

球孢白僵菌在重金屬Cd(Ⅱ)作用下抗氧化酶系變化

燕霞飛1，鄭長英1，李凱月1，萬方浩1，2，王俊平1*

(1.青島農業(yè)大學植物醫(yī)學學院,山東省植物病蟲害綜合防控重點實驗室,山東青島 266109;2.中國農業(yè)科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室,北京 100193)

測定球孢白僵菌Beauveriabassiana分生孢子在重金屬鎘Cd(Ⅱ)作用下不同時間段超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)及谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)活性的變化，以探討球孢白僵菌分生孢子應對重金屬脅迫時的生理生化反應。結果表明：Cd(Ⅱ)脅迫初始階段(2-6 h)，球孢白僵菌分生孢子中POD活性出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，POD對Cd(Ⅱ)脅迫較敏感。Cd(Ⅱ)脅迫4 h后，GST、SOD、CAT酶活性均顯著增加。GST活性在Cd(Ⅱ)脅迫早期酶活變化最為明顯，對菌體細胞起到關鍵的保護作用。后期GST活性較低，因此其保護作用較弱；POD的活性變化則與GST相反，POD在Cd(Ⅱ)脅迫后期對菌體細胞起到關鍵的保護作用；Cd(Ⅱ)脅迫下，CAT活性穩(wěn)定且變化不明顯但仍高于正常狀態(tài)下的CAT酶活；SOD始終保持高的酶活性，在這些抗氧化保護酶中，以SOD最為重要。結果表明,抗氧化酶活性的提高與維持是球孢白僵菌耐Cd(Ⅱ)脅迫的重要生理基礎。

鎘脅迫；球孢白僵菌；抗氧化酶系統(tǒng)；土壤修復

近年來，隨著化學農藥大量使用對農產品和環(huán)境帶來的污染及社會經濟的發(fā)展和人們對綠色食品要求的不斷提高，蟲生真菌生物防治應用正越來越受到人們的關注。球孢白僵菌Beauveriabassiana是一類重要的廣譜性昆蟲病原真菌，為世界上研究和應用最多的蟲生真菌之一，已被廣泛應用于農林業(yè)害蟲防治中(Fangetal.，2008；Wraightetal.，2010)。球孢白僵菌不僅可以寄生昆蟲，而且在寄主昆蟲缺乏時，能夠在不同生態(tài)環(huán)境中營腐生生活，土壤被公認為是昆蟲病原真菌的重要蓄積庫(Studdertetal.，1990；Pireiraetal.，1993)。

隨著工業(yè)、農業(yè)的不斷發(fā)展及各種化學產品、農藥及化肥的廣泛使用，重金屬通過各種途徑進入環(huán)境，造成土壤尤其是農田土壤的污染日益嚴重(Chaneyetal.，2004)。重金屬是一種持久性的有毒污染物，進入土壤環(huán)境后不易被化學或生物降解，易通過食物鏈及其他途徑進入植物、動物和人體內積累，對生態(tài)環(huán)境、食品安全和人體健康構成嚴重威脅，危害極大(Chaneyetal.，1999；Chaneyetal.，2013)。污染面積上看，國內專家認為鎘污染最嚴重(陳同斌等，2003)。據新近發(fā)布的《全國土壤污染狀況調查公報》(2014)統(tǒng)計，我國鎘污染農田面積已超過28×104hm2，每年生產的鎘含量超標農產品和動物造成的累積性毒害品達146萬噸(易澤夫等，2014)。

國外一些學者研究發(fā)現(xiàn)，球孢白僵菌不僅能夠防治害蟲，還具有生物轉化鎘、銅等重金屬的能力(Khalidetal.，2011)。球孢白僵菌的吸收和吸附作用將土壤中的重金屬清除出土體或將其固定在土壤中降低其遷移性和生物有效性，對受重金屬污染的土壤具有一定的修復作用。因此，大量高濃度的球孢白僵菌施用于農林業(yè)中時，部分會直接接觸寄主昆蟲，達到殺蟲的效果；而部分會蓄積在土壤中，此時球孢白僵菌會作為一種鎘吸附劑吸收和吸附土壤中的重金屬鎘。試驗中發(fā)現(xiàn)，鎘處理后的球孢白僵菌殺蟲毒性略有降低但沒有顯著性變化，仍保持高的殺蟲毒性，當土壤中的球孢白僵菌接觸到寄主昆蟲時，仍作為一種高毒力殺蟲真菌起到殺蟲的效果。

重金屬脅迫可誘導產生大量活性氧(ROS)從而誘發(fā)生物機體損壞，真菌自身能夠采取多種機制抵御重金屬的毒害，分泌抗氧化脅迫的酶類物質來減輕重金屬引起的生理毒害是一種重要的胞內防御機制(Banerjeeetal.，1999；徐勤松等，2006)。過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)是一個重要的ROS清除系統(tǒng)，SOD是細胞抵抗ROS脅迫的第一道屏障，可將其轉化為氧化作用相對較弱的H2O2，再由POD和CAT將H2O2分解成H2O(Lietal.，2005；Sunetal.，2010)。谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)可催化還原型谷胱甘肽GSH結合過氧化產物或絡合自由態(tài)Cd(Ⅱ)，降低細胞中ROS物質的濃度，在防御Cd(Ⅱ)脅迫的過程中具有重要的作用(Adamisetal.，2001；胡延玲等，2009)。大量實驗表明，低、中劑量Cd(Ⅱ)對生物體內抗氧化酶活性都有不同程度的誘導，而高劑量則導致活性顯著下降(Stebbing，1982；Muradoetal.，2007)。此外，Cd(Ⅱ)對抗氧化酶活性影響還取決于處理時間、實驗樣品的來源及其發(fā)育階段等因素。生物體內抗氧化酶系對重金屬污染相當敏感，可作為環(huán)境監(jiān)測的重要生物指標(Niuetal.，2010)。

在抗性機理研究中，SOD和POD等酶活性的變化已廣泛作為指示抵御逆境傷害的指標。此外，有關研究表明白僵菌可通過氧化還原、甲基化和去甲基化等作用轉化重金屬，使重金屬從有毒的游離態(tài)轉化為無毒或低毒的結合態(tài)從而改善土壤質量(Borchetal.，2009)。

試驗中發(fā)現(xiàn)，Cd(Ⅱ)濃度達到50 mg/L時，球孢白僵菌萌發(fā)率出現(xiàn)明顯的降低，109個孢子/mL球孢白僵菌分生孢子對Cd(Ⅱ)的吸附率達到56.7%，而107個孢子/mL球孢白僵菌分生孢子對Cd(Ⅱ)的吸附率達到28.7%。因此本研究在50 mg/L Cd(Ⅱ)離子懸浮液中培養(yǎng)球孢白僵菌分生孢子，分析球孢白僵菌分生孢子隨培養(yǎng)時間，活性氧清除體系中關鍵性酶SOD、POD、CAT及GST等含量的變化，以探討在重金屬污染條件下球孢白僵菌生長過程中活性氧代謝與酶活性之間的內在聯(lián)系，為進一步研究其對Cd(Ⅱ)的解毒機制提供了一定的理論基礎，并為球孢白僵菌在保持其高殺蟲活性的同時吸附和轉化土壤中的重金屬，改善土壤質量提供了科學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試菌株

供試球孢白僵菌菌株Bb33A(KU517852)，從野外感染球孢白僵菌的僵蠶體上分離獲得，保存于青島農業(yè)大學昆蟲生態(tài)學實驗室。

1.1.2試劑及儀器

POD、CAT測試盒為南京建成生物工程研究所生產，L-甲硫氨酸、Na2EDTA、NBT、核黃素、2,4-二硝基氯苯、GSH等均為國產分析純及生化試劑。水浴鍋，離心機(Hettich Zentrifugen，EBA20)，酶標儀(Thermo Multiskan MK3)，752N紫外可見分光光度計。

1.2 材料與處理

球孢白僵菌Bb33A分生孢子加入50 mg/L Cd(Ⅱ)溶液，分生孢子終濃度為2.0×107個孢子/mL，靜置于25℃恒溫箱。在預定的時間取出樣品，每處理3個重復，并以0.1%吐溫-80無菌水作為對照。樣品12000 g離心5 min，去上清，滅菌的濾紙干燥管底的球孢白僵菌分生孢子。放入-80℃冰箱保存。

1.3 測定方法

1.3.1酶液的制備

(1)GST粗酶液制備：液氮充分研磨處理樣，加500 μL預冷的0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH7.5)勻漿。4℃，5000 g離心10 min，取上清液，即為酶的粗提液。

(2)SOD、CAT粗酶液制備：液氮充分研磨處理樣，加500 μL預冷的0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH7.0，含0.1 mmol/L EDTA，4%苯基硫脲)勻漿，4℃，12000 g離心20 min，取上清液，即為酶的粗提液。用于測定SOD、CAT活性。

(3)POD粗酶液制備：液氮充分研磨處理樣，加500 μL預冷的0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.5)勻漿。4℃，4000 g離心15 min，取上清液，即為酶的粗提液(彭艷等，2006；張秀波等，2009)。

1.3.2GST、SOD、POD和CAT活性

GST測定參照Habig方法進行(Habigetal.，1974)，通過檢測GSH濃度的高低來反映GST活力的大??；SOD測定采用氮藍四唑(NBT)還原法；POD活性測定采用南京建成POD測試盒；CAT活性測定采用南京建成CAT測試盒。GST活性由酶標儀(Thermo Multiskan MK3)測定，SOD、POD、CAT活性由752N紫外可見分光光度計測定。

1.3.3酶活力測定

蛋白質含量采用考馬斯亮藍比色法，用牛血清蛋白作標準曲線(Bradford，1976)。蛋白含量由酶標儀(Thermo Multiskan MK3)測定。

SOD與GST酶活力的計算公式如下：

POD與CAT酶活力的計算嚴格按照南京建成生物工程公司試劑盒的說明進行，具體計算公式如下：

1.4 數(shù)據統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據采用Excel軟件對檢測數(shù)據進行表格處理與制圖，運用SPSS 21.0軟件(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)Tukey檢定法進行單因子顯著性差異分析。以置信度0.95為差異顯著，結果以均值表示。

2 結果與分析

2.1 球孢白僵菌在Cd(Ⅱ)脅迫下GST活性

球孢白僵菌Bb33A分生孢子在Cd(Ⅱ)脅迫下GST活性隨時間呈現(xiàn)先上升后下降平穩(wěn)最后下降，此時趨向未用Cd(Ⅱ)脅迫GST活性的趨勢(圖1)。Cd(Ⅱ)處理球孢白僵菌分生孢子2 h，GST活性無明顯變化；Cd(Ⅱ)處理4 h，GST活性顯著增加，6 h后達到最大值活性增加到466.54%；8 h后，GST酶活性相對6 h明顯下降，處理8-24 h內，GST酶活性穩(wěn)定變化不顯著呈波動性，GST活性分別增加到290.58%，347.75%，371.33%，330.05%；48 h后GST活性隨時間的延長而下降，趨向未用Cd(Ⅱ)脅迫時GST活性，分別增加到250.28%，216.90%，171.45%。

圖1 球孢白僵菌分生孢子在Cd(Ⅱ)脅迫后GST比活力Fig.1 Effect of Cd(Ⅱ) on GST specific activity of Beauveria bassiana spores注：柱狀圖上不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母者表示組間差異不顯著(P>0.05)，各組酶活均為平均值，下圖同。Note: The different letter superscripts means significant difference (P<0.05), the same letter denoted not significant difference (P>0.05), each enzyme activity were average, the following pictures were the same.

2.2 球孢白僵菌在Cd(Ⅱ)脅迫下SOD活性

球孢白僵菌Bb33A分生孢子在Cd(Ⅱ)脅迫后SOD活性隨時間呈現(xiàn)先上升后穩(wěn)定的趨勢(圖2)。Cd(Ⅱ)處理球孢白僵菌分生孢子4 h后，SOD活性提高，10 h后達到穩(wěn)定。SOD活性由467.34%增加到868.68%；Cd(Ⅱ)處理10-96 h內，SOD酶活穩(wěn)定保持較高水平，活性維持在868.68%-1009.5%。

圖2 球孢白僵菌分生孢子在Cd(Ⅱ)脅迫后SOD比活力Fig.2 Effect of Cd(Ⅱ) on SOD specific activity of Beauveria bassiana spores

2.3 球孢白僵菌在Cd(Ⅱ)脅迫下POD活性

球孢白僵菌Bb33A分生孢子在Cd(Ⅱ)脅迫下POD活性隨時間波動較大并且表現(xiàn)出一定的滯后性(圖3)。Cd(Ⅱ)處理球孢白僵菌分生孢子2-6 h內，POD活性明顯低于對照組POD酶活，僅為對照組POD活性的20.45%-28.77%，POD活性明顯受到抑制；Cd(Ⅱ)處理8 h，POD活性逐漸恢復至正常水平；Cd(Ⅱ)處理10 h，POD活性顯著性升高，GST活性提高到283.78%；隨后POD活性隨時間呈現(xiàn)上升的趨勢，在48 h達到最大值，POD活性增長到573.50%；Cd(Ⅱ)處理72 h后POD活性顯著性下降，在96 h時POD活性又恢復至正常水平。POD活性的變化表現(xiàn)出一定的滯后性，變化幅度較大，表明POD對Cd(Ⅱ)脅迫的響應較靈敏。

圖3 球孢白僵菌分生孢子在Cd(Ⅱ)脅迫后POD比活力Fig.3 Effect of Cd(Ⅱ) on POD specific activity of Beauveria bassiana spores

2.4 球孢白僵菌在Cd(Ⅱ)脅迫下CAT活性

球孢白僵菌Bb33A分生孢子在Cd(Ⅱ)脅迫下CAT酶活力(圖4)顯示，CAT活性隨時間波動較小。Cd(Ⅱ)處理球孢白僵菌分生孢子2 h，CAT活性未出現(xiàn)明顯變化；Cd(Ⅱ)處理4 h后，CAT活性提高，但增長率均維持在101.28%-202.78%，變化較小。

圖4 球孢白僵菌分生孢子在Cd(Ⅱ)脅迫后CAT比活力Fig. 4 Effect of Cd(Ⅱ) on CAT specific activity of Beauveria bassiana spores

2.5 Cd(Ⅱ)脅迫對白僵菌分生孢子GST、SOD、POD與CAT活性影響對比分析

球孢白僵菌Bb33A分生孢子在Cd(Ⅱ)脅迫下GST、SOD、POD、CAT活性增長率對比(圖5)顯示，Cd(Ⅱ)脅迫初始階段(2 h)，GST、CAT、SOD酶活性沒有明顯變化，而POD酶活性受到嚴重抑制，持續(xù)時間長(2-6 h)，因此POD對Cd(Ⅱ)脅迫敏感性最高；SOD活性增長率均大于其他三種酶；GST在Cd(Ⅱ)脅迫的初期(4-8 h)增長率較大；而POD活性在Cd(Ⅱ)脅迫中期(10-72 h)增長率較大；Cd(Ⅱ)脅迫后，CAT活性增長率維持在1.01-2.03，活性提高并保持穩(wěn)定。

圖5 球孢白僵菌分生孢子在Cd(Ⅱ)脅迫后GST、SOD、POD與CAT比活力增長率Fig.5 The growth rate of antioxidant enzymes of Beauveria bassiana spores after Cd(Ⅱ) stress

3 結論與討論

球孢白僵菌Bb33A(KU517852)是本實驗室分離純化的一種高殺蟲毒性菌株(2×107個孢子/mL白僵菌Bb33A第9天對西花薊馬的致死率達94.93%)，鎘處理后其殺蟲毒性會略有降低但仍保持高的殺蟲毒性(致死率由94.93%降至89.66%)，遇到寄主昆蟲時仍具有高的殺蟲效果。研究中發(fā)現(xiàn)其對Cd(Ⅱ)有較強的吸附能力。109孢子/mL球孢白僵菌Bb33A在第4天對Cd(Ⅱ)的吸附率達到56.7%(數(shù)據未發(fā)表)；同時還發(fā)現(xiàn)一方面Cd(Ⅱ)會影響、抑制球孢白僵菌Bb33A的生長及代謝活動。另一方面，球孢白僵菌Bb33A自身能夠采取多種機制抵御Cd(Ⅱ)的毒害，對Cd(Ⅱ)有較強的抗性(在一定Cd(Ⅱ)濃度范圍內，球孢白僵菌Bb33A萌發(fā)率、產孢量及徑向生長保持較高水平)。細胞內產生抗氧化酶類物質以減輕重金屬引起的氧化脅迫是一種重要的抵御機制。

經Cd(Ⅱ)脅迫后，球孢白僵菌分生孢子體內的各種抗氧化酶活性均出現(xiàn)明顯提高，這可能是由于球孢白僵菌分生孢子在逆境條件下，胞內的保護酶系統(tǒng)原有的平衡遭到破壞，導致自由基清除能力減弱，體內自由基水平發(fā)生變化，各種抗氧化酶參與調節(jié)而活性升高(魯雙慶等，2002；何潔等，2013)。有關研究發(fā)現(xiàn)重金屬耐性品種(玉米、玉豆等)在重金屬(鋁、鎘等)脅迫下抗氧化酶活性顯著高于重金屬敏感性品種(彭艷等，2006；李冬琴等，2015)?？梢姡矬w內抗氧化防御系統(tǒng)的能力強弱可能是其對重金屬脅迫耐性差異的關鍵因素。

Cd(Ⅱ)脅迫初始階段，POD酶活性受到嚴重抑制，持續(xù)時間長(2-6 h)，因此POD對Cd(Ⅱ)脅迫敏感性最高。一方面重金屬干擾物質在細胞中的運輸過程，抑制蛋白質的合成，進而抑制細胞內一些保護酶的活性，導致大量的超氧陰離子自由基產生(Liu，2010；Gusmanetal.，2013)。另一方面Cd(Ⅱ)可以與蛋白質分子中的羥基(—OH)、氨基(—NH2)、巰基(—SH)等結合，使蛋白質產生不可逆轉的變性，從而破壞酶系統(tǒng)的正常生理功能(Romero-Puertasetal.，2004)。此外Cd(Ⅱ)和巰基的親和力比鋅大，可與鋅蛋白酶發(fā)生親合反應，置換出鋅離子，使其酶活性喪失(Smeetsetal.，2005)。鎘處理2 h時，各種抗氧化酶由于以上原因酶活性或多或少受到影響，此時機體的解毒機制未開啟或受到抑制，因此更能反映出各種酶對鎘的敏感性，根據2 h時各種酶的活性的增長率，4種抗氧化酶對Cd(Ⅱ)脅迫的敏感性順序為POD>SOD>GST>CAT，這與幾種酶的空間結構相關。

GST分子具有細胞解毒和抗氧化雙重功效。有研究證實，GST參與重金屬解毒的過程主要通過兩種方式：一是GST基因能夠催化還原型谷胱甘肽(GSH)直接與Cd(Ⅱ)離子共價結合，將Cd(Ⅱ)轉運到液泡或質外體，從而達到解毒的目的(Perrinetal.，1971；Adamisetal.，2009)；二是GST還具有谷胱甘肽過氧化物酶GPOX活性，降低細胞中活性氧物質的濃度，從而減少氧化脅迫引起的損傷(Edwardsetal.，2000)。有關研究通過半定量表達分析發(fā)現(xiàn)，銅和鎘脅迫均能促使厚殼貽貝GST基因表達量升高為對照的6.95倍，且表現(xiàn)為時間依賴型(劉慧慧等，2014)。本試驗中GST在Cd(Ⅱ)脅迫初期(4-24 h)活性呈明顯上升，說明GST參與球孢白僵菌分生孢子的解毒過程，是該過程中關鍵抗氧化酶，對于球孢白僵菌防御Cd(Ⅱ)脅迫起到至關重要的作用。

從各酶系間變化差異來看，4種酶中SOD對Cd(Ⅱ)脅迫的應激性最強，自Cd(Ⅱ)脅迫4 h后，SOD活力一直呈激活狀態(tài)，SOD酶活性可達到對照的10倍左右；POD酶自Cd(Ⅱ)脅迫8 h后隨時間的延長增加，在48 h時達到最大，是對照的5.7倍，該生態(tài)效應得到來自國外的有關資料的支持。SOD和POD是抗氧化防御系統(tǒng)最重要的抗氧化酶之一，其活性越高，機體對ROS傷害的防御能力越強(彭艷等，2006；李冬琴等，2015)。SOD能將ROS轉化為氧化作用相對較弱的H2O2，再由POD和CAT將H2O2分解成H2O，因此SOD是細胞抵抗ROS脅迫的第一道屏障(Banerjeeetal.，1999；胡延玲等，2009；Sunetal.，2010)。Cd(Ⅱ)脅迫后，球孢白僵菌分生孢子內POD及SOD酶激活至較高水平，這說明受Cd(Ⅱ)脅迫的球孢白僵菌分生孢子對體內的Cd(Ⅱ)成分有了一定的耐受性，POD及SOD活性提高清除ROS的能力增強，對維持細胞正常生理功能起到了一定保護作用，表現(xiàn)出對Cd(Ⅱ)毒害的緩慢適應。

Cd(Ⅱ)脅迫4 h后，CAT活性增長率維持在1.01-2.03，活性提高并保持穩(wěn)定，說明在Cd(Ⅱ)脅迫時，球孢白僵菌分生孢子體內的CAT保護酶發(fā)揮作用以消除多余自由基，來維持生命活動的正常進行。

當重金屬濃度過大或處理時間過長，脅迫性加劇，生物體內產生的ROS超過生物體的清除能力時，便產生“毒物抑制效應”，對組織和細胞造成損傷，影響生物體的正常生理活動，使酶活性降低和喪失，甚至導致細胞或者生物體死亡(徐楠等，2003)。球孢白僵菌Bb33A中POD及GST兩種抗氧化酶活性隨Cd(Ⅱ)脅迫時間的延長最終會出現(xiàn)減少的趨勢，這可能是因為隨著Cd(Ⅱ)脅迫的持續(xù)，過多的ROS影響了POD及GST酶活性，而Foyer等(2000)認為可能是非酶促系統(tǒng)的應激反應加強的結果，即當一類抗氧化物質被大量消耗后，細胞就會啟動其他解毒過程來維持其正常生命狀態(tài)。

綜合以上分析可以得知球孢白僵菌Bb33A分生孢子在受到Cd(Ⅱ)脅迫后可以快速適應，及時調節(jié)(Cd(Ⅱ)脅迫4 h后，GST、CAT、SOD活性明顯提高)體內抗氧化酶系統(tǒng)防御Cd(Ⅱ)脅迫對其造成的毒害，以保障細胞正常生長發(fā)育及生理功能的完成。該研究中4種抗氧化酶協(xié)同抗Cd(Ⅱ)脅迫，共同組成防御過氧化系統(tǒng)，及時有效地清除體內的ROS以抵抗環(huán)境不良條件對機體的破壞。但機體在Cd(Ⅱ)脅迫下的調節(jié)能力是臨時和有限的，抗氧化酶POD、GST活性并沒有無限地提高，隨著時間的延長，脅迫性加劇遠遠超過機體所能耐受的能力，細胞內多種活性物質包括抗氧化酶系受到損傷而使活性下降甚至失活(曾曉敏等，2002)。

此外，有關研究表明微生物可通過氧化還原、甲基化和去甲基化等作用轉化重金屬，使重金屬從有毒的游離態(tài)轉化為無毒或低毒的結合態(tài)(Borchetal.，2009)。因此探討在重金屬污染條件下球孢白僵菌生長過程中活性氧代謝與酶活性之間的內在聯(lián)系，為進一步研究重金屬污染對球孢白僵菌的損傷及球孢白僵菌對Cd(Ⅱ)抗性機制提供依據，從而為球孢白僵菌在保持其高殺蟲活性的同時吸附和轉化土壤中的重金屬，改善土壤質量提供了科學基礎。

鎘污染越來越成為世界性的環(huán)境問題，已引起人們的廣泛關注。研究Cd(Ⅱ)脅迫對球孢白僵菌抗氧化酶的影響為進一步研究球孢白僵菌對Cd(Ⅱ)的解毒機制提供了一定的理論基礎，并為球孢白僵菌在保持其高殺蟲活性的同時吸附和轉化土壤中的重金屬，改善土壤質量提供了科學基礎。Cd(Ⅱ)脅迫誘導球孢白僵菌Bb33A中ROS累積，高水平的抗氧化酶活性是白僵菌33A耐重金屬Cd(Ⅱ)的重要機制之一，在這些抗氧化保護酶中，以SOD最為重要。這些抗氧化保護酶活性不可能無限地提高，其在Cd(Ⅱ)脅迫下的調節(jié)能力是臨時和有限的。

References)

Adamis PDB, Mannarino SC, Eleutherio ECA. Glutathione and gamma-glutamyl transferases are involved in the formation of cadmium-glutathione complex [J].FEBSLetters, 2009, 583 (9): 1489-1492.

Adamis PDB, Gomes DS, Pinto MLCC. The role of glutathione transferases in cadmium stress [J].ToxicologyLetters, 2001, 154 (2): 81-88.

Banerjee BD, Seth V, Bhattacharya A. Biochemical effects of some pesticides on lipid peroxidation and free-radical scavengers [J].ToxicologyLetters, 1999, 107 (1-3): 33-47.

Borch T, Kretzschmar R, Kapple A,etal. Biogeochemical redox processes and their impact on contaminant dynamics [J].EnvironmentalScience&Technology, 2009, 44 (1): 15-23.

Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding [J].AnalyticalBiochemistry, 1976, 72 (1-2): 248-254.

Chaney RL, Reeves PG, Ryan JA,etal. An improved understanding of soil Cd risk to humans and low cost methods to phytoextract Cd from contaminated soils to prevent soil Cd risks [J].Biometals, 2004, 17 (5): 549-553.

Chaney RL, Ryan JA, Reeves PG. Cadmium in soils and its transfer to plants and the human food chain. In: Proc. Eighth International Cadmium Conference (Nov. 10-13, 2011, Kunming, China) [R]. Brussels, Belgium: International Cadmium Association, 2013: 175-212.

Chaney RL, Ryan JA, Li YM,etal. Soil Cadmium as A Threat to Human Health Cadmium in Soils and Plants(McLaughlin MJ,etal.eds.)[M]. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1999: 219-256.

Chen TB, Huang QF, Gao D,etal. Heavy metal concentrations and their decreasing trends in sewage sludges of China [J].ActaScientiaeCircumstantiae, 2003, 23 (5): 561-569. [陳同斌, 黃啟飛, 高定, 等. 中國城市污泥的重金屬含量及其變化趨勢[J]. 環(huán)境科學學報, 2003, 23 (5): 561-569]

Edwards R, Dixon DP, Walbot V. Plant glutathione S-transferases: Enzymes with multiple functions in sickness and in health [J].TrendsinPlantScience, 2000, 5 (5): 193-198.

Fang WG, Scully LR, Zhang L,etal. Implication of a regulator of G protein signalling (BbRGS1) in conidiation and conidial thermotolerance of the insect pathogenic fungusBeauveriabassiana[J].FemsMicrobiologyLetters, 2008, 279 (2): 146-156.

Foyer CH, Christine H, Noctor G,etal. Oxygen processing in photosynthesis: Regulation and signaling [J].NewPhytologist, 2000, 146 (3): 359-388.

Gusman GS, Oliveira JA, Farnese FS,etal. Mineral nutrition and enzymatic adaptation induced by arsenate and arsenite exposure in lettuce plants [J].PlantPhysiologyandBiochemistry, 2013, 71 (2): 307-314.

Habig WH, Pabst MJ, Jakoby WB. Glutathione S-transferases: The first enzymatic step in mercapturic acid formation [J].JournalofBiologicalChemistry, 1974, 249: 7130-7139.

He J, Gao YT, He X,etal. The effect of Zn and Cd on growth and antioxidant enzymes activity ofSuaedaheteropterakitagawa[J].ActaScientiaeCircumstantiae, 2013, 33 (1): 312-320. [何潔, 高鈺婷, 賀鑫, 等. 重金屬Zn和Cd對翅堿蓬生長及抗氧化酶系統(tǒng)的影響[J]. 環(huán)境科學學報, 2013, 33 (1): 312-320]

Hu YL, Zhang CH, Ju T,etal. Differential responses of GSH and GST in two rice cultivars under Cd stress [J].JournalofAgro-environmentScience, 2009, 28 (2): 305-310. [胡延玲, 張春華, 居婷, 等. 鎘脅迫下兩種水稻GSH和GST應答差異的研究[J]. 農業(yè)環(huán)境科學學報, 2009, 28 (2): 305-310]

Khalid AH, Sedky HAH, Jin HJ. Potential capacity ofBeauveriabassianaandMetarhiziumanisopliaein the biosorption of Cd2+and Pb2+[J].JournalofGeneralandAppliedMicrobiology, 2011, 57 (6): 347-355.

Li DQ, Chen GK, Zheng H,etal. Effects of cadmium on growth and antioxidant enzyme activities of two kidney bean (PhaseolusvulgarisL.) cultivars [J].JournalofAgro-environmentScience, 2015, 34 (2): 221-226. [李冬琴, 陳桂葵, 鄭海, 等. 鎘對兩品種玉豆生長和抗氧化酶的影響[J]. 農業(yè)環(huán)境科學學報, 2015, 34 (2): 221-226]

Li LJ, Liu XM, Guo YP,etal. Activity of the enzymes of the antioxidative system in cadmium-treated Oxya chinensis (OrthopteraAcridoidae) [J].EnvironmentalToxicologyandPharmacology, 2005, 20 (3): 412-416.

Liu DL, Zhang SP, Chen Z,etal. Soil cadmium regulates antioxidases in sorghum [J].AgriculturalSciencesinChina, 2010, 9 (10): 1475-1480.

Liu HH, He JY, Zhao RT,etal. Molecular expression pattern of glutathions-transferase gene inMytiluscoruscusexposed to heavy metals [J].OceanologiaetLimnologiaSinica, 2014, 45 (2): 274-280. [劉慧慧, 何建瑜, 趙榮濤, 等. 重金屬脅迫下厚殼貽貝谷胱甘肽S-轉移酶基因表達分析[J]. 海洋與湖沼, 2014, 45 (2): 274-280]

Lu SQ, Liu SJ, Liu HY,etal. Effects of Cu2+on activities of protecting enzymes SOD, CAT and GSHPX in liver tissue ofMonopterusalbus[J].JournalofFisherySciencesofChina, 2002, 9 (2): 138-141. [魯雙慶, 劉少軍, 劉紅玉, 等. Cu2+對黃鱔肝臟保護酶SOD、CAT、GSHPX活性的影響[J]. 中國水產科學, 2002, 9 (2): 138-141]

Murado MA, Vazquez JA. The notion of hormesis and the dose-response theory: A unified approach [J].JournalofTheoreticalBiology, 2007, 244 (3): 489-499.

Niu YQ, Zheng JF, Wang HL. Progress in effect of lead on anti-oxidative damage enzyme of aquatic animal [J].EnvironmentalScience&Technology, 2010, 23 (2): 74-78.

Peng Y, Li Y, Yang GX,etal. Effects of aluminum stress on the activities of SOD, POD, CAT and the contents of MDA in the seedlings of different wheat cultivars [J].Biotechnology, 2006, 16 (3): 42. [彭艷, 李洋, 楊廣笑, 等. 鋁脅迫對不同小麥SOD、CAT、POD活性和MDA含量的影響[J]. 生物技術, 2006, 16 (3): 42]

Perrin DD, Watt AE. Complex formation of zinc and cadmium with glutathione [J].BiochimicaetBiophysicaActa, 1971, 230 (1): 96-104.

Pireira RM, Alvas SB, Stimac JL. Growth ofBeauveriabassianain fire ant nest soil with amendments [J].JournalofInvertebratePathology, 1993, 62 (1): 9-12.

Romero-Puertas MC, Rodriguez-Serrano M, Corpas FJ,etal. Cadmium-induced subcellular accumulation of O2-and H2O2in pea leaves [J].Plant,CellandEnvironment, 2004, 27 (9): 1122-1134.

Smeets K, Cuypers A, Lambrechts A,etal. Induction of oxidative stress and antioxidative mechanisms inPhaseolusvulgarisafter Cd application [J].PlantPhysiologyandBiochemistry, 2005, 43 (5): 437-444.

Studdert JP, Kaya HK. Water potential, temperature, and soil type on the formation ofBeauveriabassianasoicolonies [J].JournalofInvertebratePathology, 1990, 56 (3): 380-386.

Stebbing ARD. Hormesis-The stimulation of growth by low levels of inhibitors [J].TheScienceoftheTotalEnvironment, 1982, 22 (3): 213-234.

Sun SQ, He M, Wang GX,etal. Heavy metal-induced physiological alterations and oxidative stress in the mossBrachytheciumpiligerumchad [J].EnvironmentalToxicology, 2010, 26 (5): 453-458.

Wraight SP, Ramos ME, Avery PB,etal. Comparative virulence ofBeauveriabassianaisolates against lepidopteran pests of vegetable crops [J].JournalofInvertebratePathology, 2010, 103 (3): 186-199.

Xu QS, Shi GX, Wang X,etal. Generation of active oxygen and change of antioxidant enzyme activity inHydrillaverticillataunder Cd, Cu and Zn stress [J].ActaHydrobiologicaSinica, 2006, 30 (1): 107-112. [徐勤松, 施國新, 王學, 等. 鎘、銅和鋅脅迫下黑藻活性氧的產生及抗氧化酶活性的變化研究[J]. 水生生物學報, 2006, 30 (1): 107-112]

Xu N, Shi GX, Zeng XM,etal. Damage to primary structure and antioxidant enzymes inLemnaminorincluded by Hg2+[J].ActaPhytoecologicaSinica, 2003, 27 (3): 299-303. [徐楠, 施國新, 曾曉敏, 等. Hg2+脅迫對浮萍體細胞DNA一級結構和抗氧化酶系的損傷[J]. 植物生態(tài)學報, 2003, 27 (3): 299-303]

Yi ZF, Yu X, Wu J. Research advance of remediation technologies of the cadmium contaminated soil [J].ModernAgriculturalSciencesandTechnology, 2014, 9: 251-253. [易澤夫, 余杏, 吳景. 鎘污染土壤修復技術研究進展[J]. 現(xiàn)代農業(yè)科技, 2014, 9: 251-253]

Zeng XM, Shi GX, Xu QS,etal. The defense of protective system inTrapellasinensisoliveunder Hg2+、Cu2+stress [J].ChineseJournalofApplied&EnvironmentalBiology, 2002, 8 (3): 250-254. [曾曉敏, 施國新, 徐勤松, 等. Hg2+、Cu2+脅迫下茶菱保護酶系統(tǒng)的防御作用[J]. 應用與環(huán)境生物學報, 2002, 8 (3): 250-254]

Zhang XB, Tang F, Liu YS,etal. Induction of glutathione S-transferases by tannic acid inMicromelalophatroglodyta[J].ChineseBulletinofEntomoligy, 2009, 46 (4): 579-584. [張秀波湯方, 劉玉生, 等. 單寧酸對楊小舟蛾谷胱甘肽-S-轉移酶活性的誘導[J]. 昆蟲知識, 2009, 46 (4): 579-584]

TheeffectofCd(Ⅱ)onantioxidantenzymescctivityofBeauveriabassiana

YAN Xia-Fei1, ZHENG Chang-Ying1, Li Kai-Ye1, WAN Fang-Hao1,2, WANG Jun-Ping1*

(1. Key Laboratory of Integrated Crop Pest Management of Shandong Province, College of Plat Health and Medicine, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China; 2. Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

The effects of heavy metals Cd(Ⅱ) on antioxidant enzyme (SOD, CAT, POD and GST) activities ofBeauveriabassianawere studied.B.bassianaspores were exposed to Cd(Ⅱ) at different times in order to evaluate the responses of the spores to heavy metal stress. The enzyme activity of POD was decreased at the inception phase of Cd(Ⅱ) stress, and it was more sensitive to Cd(Ⅱ) stress. The enzyme activities of GST, SOD, CAT were significant increased after four hours of Cd(Ⅱ) stress. The change activity of GST was most evident at the early stress of Cd(Ⅱ), and it may play a key role in the protection ofB.bassianacell. Otherwise, it has no significant effect on cell later on; The change activity of POD was reversed, POD may play a key role in the protection ofB.bassianacell at the late stage of stress; The activity of CAT was stability and did not change significantly, it’s still higher than the activity of CAT in the normal state; SOD has always maintained a high enzyme activity. Among these antioxidant protection enzymes, SOD has the greatest importance. This indicted that the improve and maintain in the activities of antioxidant system were one of the physiological basis for the tolerance to Cd(Ⅱ) stress inB.bassianaspores.

Cd(Ⅱ) stress;Beauveriabassiana; antioxidant system; soil remediation

燕霞飛，鄭長英，李凱月,等.球孢白僵菌在重金屬Cd(Ⅱ)作用下抗氧化酶系變化[J].環(huán)境昆蟲學報，2017,39(5):992-999.

Q956.9;S476

A

1674-0858(2017)05-0992-08

國家自然科學基金(31201577)；青島農業(yè)大學高層次人才科研基金(630609)；山東省“泰山學者”建設工程專項經費

燕霞飛，女，1992年生，山東東營人，碩士研究生，研究方向為農業(yè)昆蟲與害蟲防治，E-mail：1572514891@qq.com

*通訊作者Author for correspondence, E-mail: junpingwang@qau.edu.cn

Received: 2016-09-22; 接受日期Accepted: 2016-11-22