田林++戴七一++戴子一++羅榮宇

【摘 要】目的：觀察揉髕手法對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型軟骨組織的影響，為膝骨關(guān)節(jié)炎的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：將48只新西蘭兔隨機(jī)分為手法組、對(duì)照組、假模組、正常組，每組12只。手法組和對(duì)照組通過(guò)結(jié)扎下肢部分靜脈造成骨內(nèi)高壓型膝骨關(guān)節(jié)炎模型；假模組行手術(shù)顯露但不結(jié)扎切斷相應(yīng)血管；正常組則不做任何處理。自造模1周后手法組予揉髕手法，連續(xù)治療5周，共17次，其余3組不予任何治療措施。在造模后第12周末取右膝關(guān)節(jié)脛骨平臺(tái)內(nèi)側(cè)軟骨組織進(jìn)行肉眼觀察和切片光鏡觀察，并按照關(guān)節(jié)軟骨改良Mankin分級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分。結(jié)果：經(jīng)軟骨組織病理學(xué)Mankin評(píng)分，對(duì)照組評(píng)分與手法組、假模組及正常組比較明顯較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；手法組與假模組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.99 > 0.05）。對(duì)照組呈現(xiàn)中度退變，手法組及假模組為輕度退變，正常組未見(jiàn)明顯退變。結(jié)論：揉髕手法能延緩軟骨組織退變。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎，膝；揉髕手法；軟骨組織；動(dòng)物模型

Effect of Kneading Manipulation on Cartilage Tissue in Rabbit Models with Knee Osteoarthritis

TIAN Lin，DAI Qi-yi，DAI Zi-yi，LUO Rong-yu

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of kneading manipulation on the morphology of cartilage in rabbits with knee osteoarthritis，and to provide experimental basis for the prevention and treatment of knee osteoarthritis.Methods：Forty eight New Zealand rabbits were randomly divided into a manipulation group，a control group，a sham group and a normal group，with 12 rabbits in each group.In the manipulation group and the control group，the intraosseous hypertensive knee osteoarthritis models were induced by ligation of the lower part of the vein.The sham group underwent operation without ligation and cut-off of the corresponding blood vessels；and the normal group did not receive any treatment.One week after the models were made，rabbits in the manipulation group were treated with kneading manipulation for five consecutive weeks，a total of 17 times，and the remaining three groups were not given any treatment.At the end of the twelfth week after the establishment of the models，the medial articular cartilage of the right knee joint tibial plateau was taken out and observed with naked eyes and slice light microscope，and the pathological scores were evaluated according to the improved Mankin grading standard of the articular cartilage.Results：According to Mankin scores，the scores of the control group was significantly higher than those in the manipulation group，the sham group and the normal group，and the difference was statistically significant（P < 0.05）.The difference between the manipulation group and the sham group was not statistically significant（P = 0.99 > 0.05）.The control group showed a metaphase degeneration，while the control group and the sham group showed a mild degeneration，and there was no obvious degeneration in the normal group.Conclusion：The kneading manipulation can delay the degeneration of cartilage tissue.

【Keywords】 osteoarthritis，knee；

kneading manipulation；cartilage tissue；endprint

animal model

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變損壞、關(guān)節(jié)周圍軟組織炎性反應(yīng)、關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨骨質(zhì)增生及半月板退變等為主要病理表現(xiàn)，以膝關(guān)節(jié)疼痛、活動(dòng)障礙等為主要臨床表現(xiàn)的退行性、炎癥性關(guān)節(jié)疾病[1]，其中關(guān)節(jié)軟骨退變是KOA主要病理表現(xiàn)。關(guān)節(jié)軟骨是一種無(wú)神經(jīng)、無(wú)血管的透明軟骨組織，主要由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成，具有抗磨損、潤(rùn)滑關(guān)節(jié)、傳導(dǎo)關(guān)節(jié)負(fù)荷和緩沖震蕩等功能[2-4]。作為KOA的早期病變部位，軟骨的主要病理表現(xiàn)為軟骨細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)的降解，進(jìn)一步發(fā)展為軟骨的進(jìn)行性破壞和消耗。由此可見(jiàn)，保證關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)及功能的完整性是維持膝關(guān)節(jié)正常生理功能的重要

條件。

揉髕手法是由捏拿股四頭肌、旋轉(zhuǎn)揉按髕骨和屈伸牽張患膝關(guān)節(jié)等手法組成，其療效已經(jīng)得到臨床證實(shí)[5]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察揉髕手法對(duì)兔KOA模型軟骨組織形態(tài)的影響，為KOA的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級(jí)6月齡新西蘭兔48只，雌雄各半，體質(zhì)量（2.75±0.25）kg，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（桂）2003-0001。

1.2 主要儀器 脫水機(jī)（ASP3005型，德國(guó)LEICA公司）；包埋機(jī)（EG1160型，德國(guó)LEICA公司）；切片機(jī)（RM2235型，德國(guó)LEICA公司）；生物組織攤片烤片機(jī)（CS-Ⅲ型，孝感亞鵬公司）；光學(xué)顯微鏡（CX31型，日本OLYMPUS公司）。

2 方 法

2.1 動(dòng)物分組 整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程依照我國(guó)科學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)部門頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》對(duì)動(dòng)物實(shí)施處置[6]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心特定的兔房?jī)?nèi)，在單籠室溫條件下，可于籠內(nèi)自由活動(dòng)，自主飲水及進(jìn)食。于相同環(huán)境條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將48只新西蘭兔采用隨機(jī)數(shù)字表法分為手法組、對(duì)照組、假模組、正常組，每組12只。

2.2 模型制備方法 本研究采用手術(shù)結(jié)扎兔右側(cè)臀下靜脈、股靜脈及大隱靜脈造成骨內(nèi)高壓型KOA模型[7-9]。手法組、對(duì)照組和假模組均應(yīng)用1%戊巴比妥鈉3 mL·kg-1行耳靜脈麻醉，待麻醉效果良好后，手法組和對(duì)照組24只兔取左側(cè)臥位固定于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)解剖臺(tái)上，右側(cè)臀部手術(shù)區(qū)去毛備皮、碘伏消毒。在髖關(guān)節(jié)大轉(zhuǎn)子后1 cm處標(biāo)記定位，以此為中點(diǎn)，縱行切開(kāi)皮膚，切口長(zhǎng)約3 cm，用彎鉗對(duì)皮下組織、筋膜及肌肉進(jìn)行逐層分離，徹底止血使術(shù)野清晰，充分顯露髂內(nèi)靜脈分支臀下靜脈并剝離，絲線雙重結(jié)扎，結(jié)扎線間切斷。取仰臥位，充分暴露右側(cè)腹股溝，去毛備皮、消毒，在右側(cè)腹股溝動(dòng)脈搏動(dòng)處定位并縱行切開(kāi)皮膚，切口長(zhǎng)約

4 cm，彎鉗分離皮下組織，止血使術(shù)野暴露清晰，于股動(dòng)脈搏動(dòng)旁找到伴行的股靜脈及大隱靜脈并分離，分別雙重結(jié)扎后從線間切斷。依次逐層縫合皮下組織、皮膚后，敷蓋酒精紗布、棉墊，并用膠帶牢固固定。

假模組采用相同的體位及消毒方法，取同樣的切口清晰地顯露出臀下靜脈、股靜脈和大隱靜脈，但不予結(jié)扎和切斷，暴露完成后由內(nèi)到外直接進(jìn)行手術(shù)口縫合，酒精紗布、棉墊敷料包扎固定。

手術(shù)后手法組、對(duì)照組、假模組連續(xù)3 d給予左側(cè)臀肌注射青霉素（5×104 U·kg-1·d-1）、鏈霉素（1×105 U·kg-1·d-1）預(yù)防感染，同時(shí)密切注意術(shù)口敷料覆蓋情況，必要時(shí)進(jìn)行術(shù)口換藥包扎固定，直至術(shù)口愈合。正常組12只不做任何處理。

2.3 實(shí)驗(yàn)干預(yù) 手法組造模1周后使用揉髕手法進(jìn)行治療，具體操作如下：將動(dòng)物置于操作臺(tái)，待動(dòng)物情緒穩(wěn)定后由上而下捏拿兔右下肢股四頭肌

3 min，然后先順時(shí)針后逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)揉按患膝髕骨3 min，再屈伸牽張膝關(guān)節(jié)4 min。每只兔每次施術(shù)10 min，隔日1次，因手法施術(shù)的時(shí)長(zhǎng)與力度等具有主觀差異，為盡可能減小實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的偏倚，由專人定時(shí)施術(shù)，連續(xù)治療5周，共17次。對(duì)照組造模后不再做其他干預(yù)處理，同時(shí)期常規(guī)飼養(yǎng)。假模組術(shù)后不做任何干預(yù)處理，同時(shí)期常規(guī)飼養(yǎng)。正常組不做任何干預(yù)處理，同時(shí)期常規(guī)飼養(yǎng)。

2.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物軟骨組織形態(tài)觀察 在第12周末采血后，全部沿耳緣靜脈空氣栓塞處死動(dòng)物，于兔右膝關(guān)節(jié)處備皮，常規(guī)消毒，解剖右膝關(guān)節(jié)后，使用咬骨鉗、手術(shù)刀取內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨組織，固定染色，切片光鏡觀察，具體步驟如下：①取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨約0.3 cm×0.3 cm，肉眼大體觀察軟骨組織的顏色、光澤及形態(tài)后，放入4%多聚甲醛溶液中固定備檢。②將備檢的軟骨組織樣本取出，經(jīng)過(guò)脫鈣、脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度約為3 μm，然后HE染色、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍攝，記錄各組軟骨組織形態(tài)學(xué)的變化。③甲苯胺藍(lán)染色組織樣本切片脫蠟后，蒸餾水反復(fù)浸洗3次，0.1%甲苯胺藍(lán)液浸染10 min，染色5～8 min，用蒸餾水將多余染液洗凈，95%的乙醇進(jìn)行Ⅰ、Ⅱ級(jí)脫水處理，然后用二甲苯由低到高的三級(jí)別透明處理，中性樹(shù)膠封固，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍攝記錄各組軟骨組織形態(tài)學(xué)的變化，按照關(guān)節(jié)軟骨改良Mankin分級(jí)評(píng)分準(zhǔn)則進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分。見(jiàn)表1。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)的大體觀察 兔膝關(guān)節(jié)軟骨肉眼觀察結(jié)果見(jiàn)表2。

3.2 關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)的光鏡下觀察 手法組：軟骨表面可見(jiàn)大部分深達(dá)移行層的裂隙，見(jiàn)圖

1（1）；四層結(jié)構(gòu)基本清晰。部分動(dòng)物軟骨層增厚，表層及中層細(xì)胞增多，并排列稍紊亂；潮線清晰完整，個(gè)別標(biāo)本潮線稍模糊或出現(xiàn)雙潮線；甲苯胺藍(lán)染色出現(xiàn)輕度減退，見(jiàn)圖2（1）。endprint

對(duì)照組：軟骨表面不光滑，可見(jiàn)糜爛和缺損，且大部分動(dòng)物可見(jiàn)深達(dá)輻射層，周圍軟骨見(jiàn)簇狀增生明顯，局灶骨贅；軟骨層變薄顯著，軟骨厚薄不均勻，軟骨細(xì)胞顯著減少，見(jiàn)圖1（2）；軟骨中可見(jiàn)潮線扭曲紊亂，并有軟骨下血管入侵潮線現(xiàn)象；甲苯胺藍(lán)染色以中度減退為主，個(gè)別動(dòng)物軟骨呈重度減退，見(jiàn)圖2（2）。

假模組：軟骨表面裂隙不規(guī)則，部分動(dòng)物軟骨裂隙深達(dá)移行層，見(jiàn)圖1（3）；軟骨四層結(jié)構(gòu)清晰，層次排列規(guī)則，軟骨細(xì)胞數(shù)量正常；有一只兔的軟骨層變薄明顯，軟骨細(xì)胞明顯減少；大部分標(biāo)本潮線清晰完整，個(gè)別標(biāo)本稍模糊或出現(xiàn)雙潮線，或軟骨下血管入侵潮線現(xiàn)象；甲苯胺藍(lán)染色輕度減退為主，見(jiàn)圖2（3）。

正常組：軟骨表面光滑平整，見(jiàn)圖1（4），個(gè)別標(biāo)本軟骨表面見(jiàn)小裂隙；軟骨四層結(jié)構(gòu)清晰，層次排列規(guī)則，軟骨細(xì)胞數(shù)量正常；大部分標(biāo)本潮線清晰完整，個(gè)別標(biāo)本稍模糊或出現(xiàn)雙潮線，個(gè)別動(dòng)物甲苯胺藍(lán)染色輕度減退，見(jiàn)圖2（4）。

3.3 關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)Mankin分級(jí)評(píng)分 按照關(guān)節(jié)軟骨改良Mankin分級(jí)評(píng)分準(zhǔn)則進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分，對(duì)照組評(píng)分顯著高于其他3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；手法組與假模組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表3。

4 討 論

4.1 KOA動(dòng)物模型的建立與選擇 目前，通過(guò)實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制KOA模型的方法主要有自發(fā)性動(dòng)物模型、誘發(fā)性模型兩類。為模仿人類下肢的生物力學(xué)特性，造模動(dòng)物以大鼠、兔、山羊、狗等哺乳動(dòng)物為主。自發(fā)性動(dòng)物模型即讓實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自發(fā)關(guān)節(jié)軟骨退變形成自身KOA，其病理過(guò)程與人相似，是一種理想的原發(fā)性KOA模型。誘發(fā)性模型制備方法較多，主要有機(jī)械方法、關(guān)節(jié)腔注射法及外科手術(shù)法，如Videman法、Hulth及改良法、關(guān)節(jié)刻痕法等[8-10]。

根據(jù)本課題的研究目的和實(shí)驗(yàn)要求，結(jié)合實(shí)驗(yàn)干預(yù)的特點(diǎn)，筆者選擇骨內(nèi)高壓造模法，通過(guò)手術(shù)破壞膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定裝置、血運(yùn)系統(tǒng)或直接損傷關(guān)節(jié)軟骨組織，模擬KOA關(guān)節(jié)應(yīng)力改變、微循環(huán)障礙、骨內(nèi)壓增加等病理改變。依據(jù)如下：首先，動(dòng)物骨內(nèi)高壓造模方法符合人類KOA病理變化。其次，該方法具有模型穩(wěn)定、成功率高等特點(diǎn)，有利于本實(shí)驗(yàn)干預(yù)措施的實(shí)施。因關(guān)節(jié)手術(shù)造模對(duì)關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)有所破壞，而機(jī)械方法則對(duì)關(guān)節(jié)活動(dòng)進(jìn)行限制，二者均對(duì)手法干預(yù)有一定的影響。骨內(nèi)高壓造模方法無(wú)需破壞關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)，不影響關(guān)節(jié)正?；顒?dòng)和手法的實(shí)施。

從動(dòng)物軟骨組織觀察及Mankin分級(jí)評(píng)分結(jié)果看，對(duì)照組軟骨組織破壞嚴(yán)重，Mankin分級(jí)評(píng)分高達(dá)（9.17±0.72）分，可認(rèn)為軟骨組織達(dá)到中度退變，手法組及假模組以輕度退變?yōu)橹?，正常組未見(jiàn)明顯退變，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合KOA軟骨組織基本病理變化特點(diǎn)，可認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)造模成功，證明結(jié)扎動(dòng)物下肢靜脈制備骨內(nèi)高壓型KOA模型的方法可取。

4.2 揉髕手法對(duì)兔KOA動(dòng)物模型軟骨病理學(xué)的影響 軟骨作為KOA的早期病變組織，主要病理表現(xiàn)為軟骨的退變與消耗，軟骨組織呈現(xiàn)進(jìn)行性破壞和流失[11]。揉髕手法作為一種力學(xué)干預(yù)措施，在治療KOA的過(guò)程中，膝關(guān)節(jié)周圍組織承受屈伸牽張、揉按等產(chǎn)生的應(yīng)力，經(jīng)軟骨基質(zhì)-整合素-細(xì)胞骨架信號(hào)傳導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)力學(xué)因素的干預(yù)，引發(fā)軟骨細(xì)胞內(nèi)一系列生化反應(yīng)和基因組學(xué)以及代謝組學(xué)變化，有效延緩軟骨細(xì)胞的退變和降解，最終改善KOA癥狀及關(guān)節(jié)功能[12]。

在軟骨組織病理觀察方面，經(jīng)軟骨組織的肉眼觀察及光鏡下觀察軟骨的光滑度、顏色及色澤、厚度及銳度、軟骨細(xì)胞的數(shù)量、形態(tài)和層次，發(fā)現(xiàn)手法組和對(duì)照組呈輕、中度退變，但手法組相對(duì)較輕，二者M(jìn)ankin分級(jí)評(píng)分結(jié)果也與該病理觀察結(jié)果相符合。本次實(shí)驗(yàn)中，手法組的Mankin分級(jí)評(píng)分與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），可見(jiàn)揉髕手法能有效延緩關(guān)節(jié)軟骨退變。值得一提的是，假模組軟骨也以輕度退變?yōu)橹?，假模組Mankin分級(jí)評(píng)分與手法組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ﹥ 0.05），

而與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），可見(jiàn)假模組軟骨亦有輕度退變。假模組軟骨的變化可能是假模組在接受手術(shù)干預(yù)后，因創(chuàng)傷因素影響關(guān)節(jié)組織內(nèi)環(huán)境代謝改變及活動(dòng)量較少等造成的，當(dāng)然，亦有Mankin評(píng)分時(shí)的人為誤差等客觀因素的存在。

揉髕手法能延緩軟骨組織退變，達(dá)到延緩KOA進(jìn)展，治療KOA的目的。但揉髕手法對(duì)軟骨組織的具體作用機(jī)制仍未完全明晰，尚需進(jìn)一步研究。

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收稿日期：2017-04-09；修回日期：2017-06-20endprint