夏 楠 ， 張亞莉 ， 王仁虎 ， 朱明霞 ， 劉文強(qiáng) ， 劉國(guó)榮

(1.聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院 ， 山東 聊城 252059 ； 2.新希望臨沂六和飼料公司 , 山東 臨沂 276000)

雞發(fā)生傳染性腺胃炎后炎癥因子的變化

夏 楠1， 張亞莉1， 王仁虎1， 朱明霞1， 劉文強(qiáng)1， 劉國(guó)榮2

(1.聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院 ， 山東 聊城 252059 ； 2.新希望臨沂六和飼料公司 , 山東 臨沂 276000)

為了闡明雞傳染性腺胃炎(chickens infectious proventriculitis，CIP)的發(fā)病規(guī)律，研究了該病的病變特點(diǎn)和機(jī)體內(nèi)炎癥因子的變化規(guī)律。對(duì)于不同日齡的自然發(fā)病肉雜雞分別進(jìn)行腺胃肉眼病變計(jì)分，發(fā)現(xiàn)患病雞在第21天時(shí)分值最高，病變最典型。采用ELISA對(duì)21日齡雞血清中炎癥因子和SIgA的含量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，患病雞IL-1分泌量增加，但差異不顯著；IL-6、IL-8、TNF-ɑ的分泌量分別達(dá)到76.933 7±7.233 4 ng/L、62.206 3±7.869 3 ng/L和134.598 8±18.649 7，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。SIgA分泌量為19.187 5±1.976 8 ng/L，明顯高于對(duì)照組，差異極顯著(P<0.01)。這些變化表明，機(jī)體發(fā)生了全身性或局灶性炎癥，也表明機(jī)體產(chǎn)生了顯著的免疫應(yīng)答，并且有助于該病的輔助診斷。

肉雜雞 ； 傳染性腺胃炎 ； 炎癥因子

雞傳染性腺胃炎(CIP)是一種由多種致病因素共同或者協(xié)同作用引起的一種傳染性慢性消耗性疾病，主要侵害3～25日齡的雛雞，發(fā)病雞群采食量下降，生長(zhǎng)緩慢，機(jī)體消瘦，羽毛雜亂[1-2]。大體剖檢病變是腺胃腫大、腺胃乳頭出血、水腫和分泌物增多[3-4]。該病流行范圍廣，病因復(fù)雜并且具有不確定性，發(fā)病率和病死率較高，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)帶來重大的經(jīng)濟(jì)損失。發(fā)生CIP的雞體內(nèi)發(fā)生一系列的病理變化，引起炎癥反應(yīng)，造成免疫抑制，例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)發(fā)生CIP的雞體內(nèi)IL-2 和IFN-γ含量明顯降低，造成了免疫抑制，繼發(fā)其他疾病[5-6]。

目前，雞傳染性腺胃炎的病原學(xué)研究較多[7-8]，但是感染后可量化的判斷標(biāo)準(zhǔn)及體內(nèi)炎癥因子的變化規(guī)律研究較少。推測(cè)發(fā)生CIP后相應(yīng)的炎癥因子如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-ɑ和SIgA的分泌量有可能發(fā)生變化。使用ELISA方法檢測(cè)了這些細(xì)胞因子的變化規(guī)律及其與CIP的病變特點(diǎn)的關(guān)系，揭示了肉雜雞體內(nèi)的免疫學(xué)變化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 817肉雜雞來自山東省某規(guī)?；怆u場(chǎng)，于2016年6-8月監(jiān)測(cè)其發(fā)病情況。按照CIP發(fā)病標(biāo)準(zhǔn)[6]選擇發(fā)病雞只作為發(fā)病試驗(yàn)組(A組)，在7、14、21、28日齡分別選取發(fā)病雞各20只，選擇同日齡健康雞20只作為對(duì)照組(B組)。

1.2 主要試劑 包括Chicken IL-1、IL-6、IL-8、SIgA和TNF-ɑ的EILSIA檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Rapid-bio生物公司。

1.3 方法

1.3.1 腺胃病變計(jì)分 從第7天開始，每隔7 d剖檢20只符合CIP標(biāo)準(zhǔn)的病雞，根據(jù)其發(fā)病情況進(jìn)行腺胃肉眼病變計(jì)分：分?jǐn)?shù)為0～3分，代表無病變至嚴(yán)重病變。0分為正常腺胃；1分為發(fā)生腫大，無出血，無腺胃乳頭脫落；2分為發(fā)生腫大，并且有出血，但無腺胃乳頭脫落；3分為腺胃腫大，且有出血和腺胃乳頭脫落。計(jì)算每組的病變計(jì)分。

1.3.2 炎癥因子含量測(cè)定 對(duì)21日齡雞進(jìn)行翅靜脈采血1.5 mL，5 000r/min離心10 min，收集血清用于炎癥因子含量的檢測(cè)。按照IL-1、IL-6、IL-8、TNF-ɑ和SIgA檢測(cè)試劑盒的說明書，采用雙抗體夾心ELISA法進(jìn)行炎癥因子含量的測(cè)定，使用Bio-Rad M680酶標(biāo)儀測(cè)定其在450 nm波長(zhǎng)下的OD值。

1.3.3 制定標(biāo)準(zhǔn)曲線 根據(jù)試劑盒中各標(biāo)準(zhǔn)品加樣孔對(duì)應(yīng)的細(xì)胞因子的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，此時(shí)曲線上縱坐標(biāo)是標(biāo)準(zhǔn)物OD值，橫坐標(biāo)是其相應(yīng)的濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出其線性的方程式，然后將測(cè)得的樣品OD值代入方程式得到各孔細(xì)胞因子的濃度C1，實(shí)際濃度是樣品濃度C1的5倍。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件處理分析，統(tǒng)計(jì)各組數(shù)據(jù)的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 病變計(jì)分結(jié)果 經(jīng)過連續(xù)病變計(jì)分，發(fā)現(xiàn)發(fā)病21 d的試驗(yàn)組雞病變計(jì)分最高(圖1)。剖檢時(shí)發(fā)現(xiàn)該組雞腺胃表面有明顯的壞死灶，腺胃乳頭出血、脫落甚至消失。腔上囊和胸腺已經(jīng)發(fā)生萎縮并且胰腺壞死。判定該組為典型病變，對(duì)其進(jìn)行炎癥因子含量變化的測(cè)定。

圖1 不同日齡的雞病變計(jì)分

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 以白細(xì)胞介素1(IL-1)為例檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值和濃度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)測(cè)算R2=0.9893表示曲線成立(表1和圖2)。

表1 雞群白細(xì)胞介素1(IL-1)的OD值和濃度

圖2 IL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 炎癥因子的變化 由表2可知，與對(duì)照組相比，21日齡的CIP病雞血清IL-1分泌量增加，但差異不顯著；IL-6、IL-8、TNF-ɑ的分泌量分別達(dá)到76.933 7±15.233 4 ng/L、62.206 3±12.869 3 ng/L和134.598 8±18.649 7，明顯高于對(duì)照組，且差異顯著。SIgA分泌量為19.187 5±5.976 8 ng/L，明顯高于對(duì)照組，差異極顯著。這也表明，在21日齡測(cè)定CIP病雞血清中細(xì)胞因子的含量具有顯著的意義。

表2 21 d的CIP雞血清中細(xì)胞因子含量測(cè)定結(jié)果

*：P<0.01，表示極顯著；P<0.05表示顯著；P>0.05表示不顯著

3 討論

參與炎性反應(yīng)的細(xì)胞因子主要有Th1和Th2，其中，Th1細(xì)胞參與細(xì)胞免疫和遲發(fā)性超敏性炎癥反應(yīng)，如IL-10；Th2可輔助B細(xì)胞分化為抗體分泌細(xì)胞，參與體液免疫應(yīng)答，如IL-2。IL-6又稱前炎癥細(xì)胞因子，是炎癥反應(yīng)中的中樞性調(diào)節(jié)因子，而且IL-6含量的高低與機(jī)體體液免疫功能呈正相關(guān)關(guān)系[9-10]。雞群感染CIP后IL-6的含量明顯增高，發(fā)生典型的炎癥反應(yīng)后，也通過受體介導(dǎo)B淋巴細(xì)胞的增殖，促進(jìn)機(jī)體的體液免疫應(yīng)答。IL-8是一種強(qiáng)有力的嗜中性粒細(xì)胞趨化和活化因子，可以趨化嗜中性粒細(xì)胞到炎癥部位，加重炎癥反應(yīng)造成組織損傷[11]。當(dāng)雞群發(fā)生CIP后IL-8的分泌增加，證明機(jī)體已經(jīng)發(fā)生了顯著的炎癥反應(yīng)。TNF-ɑ是炎癥反應(yīng)中釋放最早且具有廣泛生物活性的炎癥因子，正常情況下，TNF-ɑ的含量很低，一旦受到外界的刺激，其調(diào)控因子κB被激活，對(duì)TNF-ɑ進(jìn)行調(diào)控使其含量增加。同時(shí)，TNF-ɑ對(duì)κB再刺激會(huì)發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)IL-1和IL-8 含量增加，發(fā)生炎癥因子的瀑布效應(yīng)，使炎癥反應(yīng)更加嚴(yán)重[12]。這幾種炎癥因子協(xié)同作用，促進(jìn)了腺胃病變積分的升高，并于21 d到達(dá)最高。SIgA的合成與分泌主要受T淋巴細(xì)胞和白細(xì)胞介素的調(diào)節(jié)，主要分泌到外分泌液中發(fā)揮效應(yīng)功能。作為黏膜免疫的主要成員，同時(shí)還可以產(chǎn)生全身性的體液免疫應(yīng)答[13-14]。雞群感染CIP后SIgA的含量增高，表明CIP導(dǎo)致了機(jī)體提高黏膜免疫應(yīng)答水平，以抵抗病原微生物的感染。

許多研究集中于CIP的病因?qū)W分析，但是該病病因的復(fù)雜性，至今尚無定論。而且，實(shí)驗(yàn)室復(fù)制該病例較為困難。因此，本試驗(yàn)采集自然感染發(fā)病的臨床病例作為樣本進(jìn)行了研究。對(duì)于IL-1、IL-6、IL-8、TNF-ɑ和SIgA五種炎癥因子和肉雜雞CIP關(guān)系的研究，從免疫學(xué)角度分析表明，這些炎癥因子都有特異的功效，但是它們之間以及和其他炎癥因子之間又是相互關(guān)聯(lián)密不可分的。例如，TNF-ɑ、IL-1、IL-6誘發(fā)炎癥反應(yīng)在很大程度上是通過誘導(dǎo)產(chǎn)生以IL-8為代表的趨化因子所介導(dǎo)而產(chǎn)生的，且與病灶的大體炎癥程度呈正相關(guān)。無論何種原因引起CIP采用病變積分的方式均能用于評(píng)估該病嚴(yán)重程度。發(fā)生CIP感染后，體內(nèi)的IL-2和IFN-γ含量顯著減少，表明產(chǎn)生了嚴(yán)重的免疫抑制[6]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著病情的發(fā)展，IL-6、IL-8、TNF-ɑ和SIgA等炎癥因子的含量也有顯著變化，提示機(jī)體發(fā)生了全身性或局灶性的炎癥反應(yīng)。通過炎癥因子的含量變化檢測(cè)為CIP的防控和治療提供理論依據(jù)，并且具有實(shí)際的臨床意義。

[1] Goodwin M A, Hafner S, Bounous D I,etal. Viral proventriculitis in chickens[J]. Avian Pathol, 1996, 25(2): 369-379.

[2] Dormitorio T V, Giambrone J J, Hoerr F J. Transmissible proventriculitis in broilers[J]. Avian Pathol, 2007, 36(2): 87-91.

[3] 周繼勇. 雞傳染性腺胃炎病毒(暫定名)的致病性[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000,20(2)：124-126

[4] 王建琳，尹燕博. 雞傳染性腺胃炎病理組織學(xué)觀察[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013,34(12)：247-250

[5] Van Reeth K. Cytokines in the pathogenesis of influenza[J]. Vet Microbio, 2000,74(1-2): 109-116.

[6] 劉國(guó)榮，劉文強(qiáng)等. 雞發(fā)生傳染性腺胃炎后IL-2及IFN-γ的動(dòng)態(tài)變化[J]. 中國(guó)家禽，2015，37(6)：47-48.

[7] 沈美艷，張廣斌，李久慶，等．呼腸孤病毒在雞傳染性腺胃炎病例中存在情況的研究[J]．家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2006，27(6)：112-114．

[8] 王玉東，王永玲，張子春，等．雞腺胃型傳染性支氣管炎病毒(QX IBV)的分離和鑒定[J]．中國(guó)獸醫(yī)雜志，1998，24(1)：12-13．

[9] 狄政莉，萬琪等. IL-1β和IL-6在腦缺血再灌注微血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用[J]. 西安醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，22(5)：432-434.

[10] 潘靈輝. 細(xì)胞因子平衡在炎癥反應(yīng)中作用的研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述，2005，11(9)：775-777

[11] 任卉，崔麗英．IL-4和IL-8與支氣管哮喘及慢性阻塞性肺疾病的相關(guān)性研究[J]．內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，33(2)：168-172．

[12] 李衛(wèi)，劉佳，白家媛，等．ɑ腫瘤壞死因子的研究進(jìn)展[J]．動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31(12)：108-111．

[13] Kaiser P，Rothwell L，Galyov E E，etal．Differential cytokine expression in avian cells in response to invasion by Salmonella typhimurium，Salmonella enteritidis and Salmonella gallinarum[J]．Microbiology，2000，146：3 217-3 226．

[14] 楊倩，毛衛(wèi)華，汪愛芬．免疫途徑對(duì)雛雞分泌型免疫球蛋白A細(xì)胞分布的影響[J]．中國(guó)獸醫(yī)科技，1998，28(11)：3-5．

Changesofinflammatoryfactorsafterinfectiousproventriculitisinhybridbroilers

XIA Nan1， ZHANG Ya-li1， WANG Ren-hu1， ZHU Ming-xia1， LIU Wen-qiang1， LIU Guo-rong2

(1. College of agricultural of Liaocheng University ， Liaocheng 252059 ， China；2. New hope Liuhe Shandong Linyi co. ， Ltd ， Linyi 276000 ,China)

Pathological characteristics of the disease and the change of inflammatory factors were analyzed to clarify the pathogenesis of chickens infectious proventriculitis(CIP). The pathological changes of the proventriculitis in the broilers with different ages were scored, respectively. The highest score was found at 21 day with the most typical lesions. Inflammatory factors and SIgA in the serum of chickens of 21 days were detected with ELISA，The results showed that the secretion of IL-1 was increased but no significant difference in the diseased chickens compared with the control group. The secretion of IL-6, IL-8 and TNF-ɑ were 76.933 7±7.233 4 ng/L 62.206 3±7.869 3 ng/L and 134.598 8±18.649 7 ng/L，respectively,which were significantly higher than the control group(P<0.05). The secretion of SIgA was 19.187 5±1.976 8 ng/L, which was significanty differently higher than that of the control group(P<0.01).

hybrid broiler ; infectious proventriculitis ; inflammatory factor

LIU Wen-qiang

S852.4

A

0529-6005(2017)09-0020-03

2016-12-31

國(guó)家自然科學(xué)基金(81202306);山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃(J14LF03);聊城大學(xué)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目(cxcy2015072)

夏楠(1991-)，女，碩士，從事動(dòng)物疫病發(fā)生機(jī)理與防治研究，E-mail: 1423445152@qq.com

劉文強(qiáng)，E-mail：liuwenqiang@lcu.edu.cn