李偉躍 ， 張?zhí)m鳳 ， 李勝美 ， 石 英

(1.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 ， 山東 濰坊 261061 ； 2.山東省濰坊新華中學(xué) ， 山東 濰坊 261061)

山東省雞致病性大腸桿菌的分離鑒定

李偉躍1， 張?zhí)m鳳2， 李勝美2， 石 英1

(1.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 ， 山東 濰坊 261061 ； 2.山東省濰坊新華中學(xué) ， 山東 濰坊 261061)

雞的大腸桿菌病是由某些血清型的大腸桿菌引起的一類疾病，隨著養(yǎng)雞業(yè)的集約化發(fā)展，該病的傳播越來越嚴(yán)重，對養(yǎng)雞業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大。為明確本省致病性大腸桿菌的血清型、有針對性地研究預(yù)防和治療雞大腸桿菌病的藥物和方法，對山東省雞致病性大腸桿菌進(jìn)行了分離和鑒定。

1 材料與方法

1.1 病料及分型血清 病料采自山東省德州市獸醫(yī)站禽病門診、淄博市獸醫(yī)站禽病門診、沂水縣獸醫(yī)站禽病門診，膠州市、萊州市、臨朐縣等多個肉雞養(yǎng)殖場和禽病門診的疑似大腸桿菌病的病、死雞，具有典型肝周炎、心包炎解剖病變的病死雞的脾臟、肝臟、心血等病料。大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922和大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)抗“O”血清，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 試劑和培養(yǎng)基 三糖鐵瓊脂、營養(yǎng)肉湯、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；麥康凱、伊紅美蘭瓊脂，購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇微量發(fā)酵管，購自杭州天和微生物試劑有限公司；蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、枸櫞酸鹽瓊脂、革蘭染色液、0.5%石炭酸生理鹽水、吲哚試劑、V-P試劑、M-R試劑等由實(shí)驗(yàn)室自行配制。

1.3 試劑配制方法 以下試劑按照參照參考文獻(xiàn)[1]進(jìn)行配制。蛋白胨水：蛋白胨 1 g，氯化鈉 0.5 g，蒸餾水100 mL。將蛋白胨、氯化鈉加入蒸餾水中，加熱溶解后調(diào)pH值為7.6，再煮沸加熱30 min。待冷后用濾紙過濾，分裝，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。葡萄糖蛋白胨水： 蛋白胨0.5 g，葡萄糖0.5 g，K2HPO40.5 g，完全溶解于100 mL蒸餾水中后，分裝試管，115 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。枸櫞酸鹽瓊脂：硫酸鎂0.2 g，磷酸二氫銨1.0 g，磷酸氫二鉀1.0 g，枸櫞酸鈉2.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂20 g，1%溴麝香草酚藍(lán)酒精溶液10 mL，蒸餾水1 000 mL。除溴麝香草酚藍(lán)酒精溶液外，其他成分混合于蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)整pH值為7.0，再加入溴麝香草酚藍(lán)酒精溶液，混勻后121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min，擺成斜面。培養(yǎng)基呈淡綠色。草酸銨結(jié)晶紫：取結(jié)晶紫飽和溶液(13.87 g結(jié)晶紫溶于100 mL 95%酒精)2 mL，加蒸餾水18 mL稀釋10倍，再加入1%草酸銨水溶液80 mL，混合過濾。革蘭碘液：碘化鉀2 g置乳缽中，加蒸餾水約5 mL，再加碘粒1 g，研磨，并徐徐加水至完全溶解后注入棕色瓶中，補(bǔ)加蒸餾水至300 mL。沙黃：將沙黃飽和溶液(3.41 g沙黃溶于100 mL 95%酒精)用蒸餾水稀釋10倍。吲哚試劑：對位二氨基苯甲醛1 g，溶于無水乙醇95 mL后加入濃鹽酸20 mL，避光保存。M-R試劑：甲基紅0.02 g，95%酒精60 mL，蒸餾水40 mL。V-P試劑：甲液：α-萘酚酒精溶液(α-萘酚5 g，無水乙醇100 mL)；乙液：40%KOH溶液(KOH 40 g，蒸餾水100 mL)。0.5%石炭酸生理鹽水：石炭酸0.5 g，蒸餾水100 mL。

1.4 主要儀器設(shè)備 超凈工作臺(中國蚌埠計劃設(shè)備廠)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(中國龍口市先科儀器公司)；高壓蒸汽滅菌鍋(上海通用核子儀器廠)；顯微鏡(日本OLYMPUS)；游標(biāo)卡尺、培養(yǎng)皿以及實(shí)驗(yàn)室常用玻璃儀器等。

1.5 方法

1.5.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察 將采集到的病料直接涂片鏡檢和分離培養(yǎng)。直接涂片，若觀察到革蘭陰性無芽孢短桿菌可作為初步診斷；將病料取出，分別接種于麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、普通肉湯、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，放在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在伊紅美藍(lán)瓊脂上長出帶金屬光澤的紫黑色菌落；在麥康凱培養(yǎng)基上長出紅色菌落；在普通培養(yǎng)基上形成中等大小、光滑濕潤、圓形凸起、灰白色邊緣整齊的菌落；普通肉湯中呈均勻渾濁生長，形成菌膜，管底有黏性沉淀。挑取符合特征的單菌落進(jìn)行革蘭染色，鏡檢，大腸桿菌為革蘭陰性無芽孢短桿菌。

1.5.2 生化試驗(yàn)[2]用五糖發(fā)酵(葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖)、IMViC、三糖鐵試驗(yàn)進(jìn)行生化鑒定。按照常規(guī)方法用滅菌接種環(huán)挑取普通瓊脂斜面上的純培養(yǎng)物少許，進(jìn)行三糖鐵、五糖發(fā)酵、IMViC試驗(yàn)。本菌能分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不分解蔗糖；三糖鐵斜面和底部均為黃色，且底部有氣體產(chǎn)生，但不產(chǎn)生H2S；IMViC的試驗(yàn)結(jié)果為++――。

1.5.3 血清型鑒定

(1)抗原制備：先用2 mL 0.5%石炭酸生理鹽水將普通瓊脂斜面小管中的培養(yǎng)物洗下，放到小圓底試管中，制作成濃稠菌懸液，再放入高壓蒸汽滅菌鍋中121.3 ℃高壓2 h，以破壞其“K”抗原，制得高壓抗原，然后鑒定“O”抗原。

(2)血清型鑒定：加樣：取干凈玻璃板，用蠟筆將其劃成方格，并注明每格相對應(yīng)的血清標(biāo)號，每板4種血清，用微量加樣器向每格加一種血清10 μL，再用微量移液器在血清附近滴加一種被檢菌“O”抗原10 μL，但不與血清接觸，用火柴棒將血清與抗原混勻。對照：每次試驗(yàn)同時以0.5%苯酚生理鹽水和高壓抗原混合物作對照，觀察是否有自凝現(xiàn)象。判定：3 min內(nèi)出現(xiàn)凝集者為陽性反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特性 大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂上形成帶金屬光澤的紫黑色菌落；在麥康凱瓊脂平板上形成玫瑰紅色中等大小的菌落；在普通瓊脂平板上形成灰白色、濕潤、半透明、邊緣整齊、表面光滑的中等大小菌落；在普通肉湯中呈均勻渾濁生長，有菌膜、管底有黏性沉淀；革蘭染色鏡檢可見多數(shù)散在排列的兩端鈍圓的短桿菌，呈粉紅色，為革蘭陰性菌。共分離到150株菌株。

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果 將分離到150株菌株按照常規(guī)方法采用五糖發(fā)酵、三糖鐵、IMViC試驗(yàn)，進(jìn)行生化鑒定，結(jié)果見表1。

表1 150株大腸桿菌的生化鑒定結(jié)果

+：陽性；-：陰性；A：產(chǎn)酸

2.3 血清型鑒定結(jié)果 用玻板凝集法對150株大腸桿菌進(jìn)行“O”血清型鑒定，結(jié)果見表2。

所分離的150株大腸桿菌中，有16株未定性，2株出現(xiàn)玻板凝集或自凝現(xiàn)象，其他132株分離的“O”型血清共有16種；血清型鑒定結(jié)果為，O78血清型的菌株最多，共計45株，占菌株的30.0%，O24a、O111和O5分別為12.7%、9.3%和8.0%，為優(yōu)勢血清型。

表2 150株大腸桿菌的血清型鑒定結(jié)果

3 討論

大腸桿菌的不同血清型之間交叉保護(hù)率低，不同地區(qū)大腸桿菌的血清型種類繁多而且差異較大，為雞大腸桿菌病的防治帶來了較大的困難。在雞大腸桿菌病傳統(tǒng)的流行病學(xué)研究中，血清型鑒定占有重要地位，對于由不同血清型大腸桿菌所導(dǎo)致的疾病，血清學(xué)分型具有更加重要的指導(dǎo)意義；明確山東省大腸桿菌血清型的分布和不同血清型之間的交叉保護(hù)力，對于山東省雞大腸桿菌病疫苗的研制和預(yù)防具有重要意義。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，山東省肉雞大腸桿菌的優(yōu)勢血清型是O78、O24a、O111和O5，分別占鑒定菌株的30.0%、12.6%、9.3%和8.0%。國外有很多關(guān)于大腸桿菌血清型鑒定的報道，不同地區(qū)流行的優(yōu)勢血清型所占的比例差異非常大，但最常見的優(yōu)勢血清型通常是O78[4]。本次試驗(yàn)分離所得的4個優(yōu)勢血清型中O78也是常見血清型，而O24a、O5卻不在此列，特別是我們在不同養(yǎng)雞場分離到的19株O24a血清型的大腸桿菌，在其他地區(qū)未見報道，這可能與當(dāng)?shù)匾N范圍較廣有關(guān)，因此有必要對其進(jìn)行進(jìn)一步研究。本次試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)O93、O88、O76、O35、O25、O20、O14、O11、O8血清型，與李宏娟報道的O26和O88是山東地區(qū)優(yōu)勢血清型不一致[5]。O116、O24b、O21、O15、O9、O7、O2占比例較低。山東省2000年17個地市的養(yǎng)雞場致病性大腸桿菌血清型中，O2、O11、O15、O18、O78、O143最為常見[6]，其結(jié)果中只有O78與本試驗(yàn)相同。

從結(jié)果也可看出，山東省雞群大腸桿菌血清型分布復(fù)雜，不同地區(qū)之間血清型有差異，從同一地區(qū)甚至同一雞群分離到的大腸桿菌菌株其血清型也不同。大腸桿菌血清型的組成如此復(fù)雜，給養(yǎng)雞生產(chǎn)中該病的防治造成了很大困難。因此，通過篩選地區(qū)性免疫原性優(yōu)良的大腸桿菌菌株制作菌苗，是雞大腸桿菌病免疫預(yù)防的基礎(chǔ)。建議雞場最好采用自家滅活苗預(yù)防較為可靠。

[1] 姚火春.獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.

[2] 沈萍,范秀容,李廣武．微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京:高等教育出版社，2004.

[3] 從佩清. 雞大腸桿菌病地方性致病菌株的分離鑒定及免疫研究[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1997，19(3)：72-77.

[4] 張春榮，蘇亞拉圖.我國流行的雞致病性大腸桿菌血清型[J]. 中國動物檢疫，1996，16(1)：2-8.

[5] 李宏娟.雞致病性大腸桿菌耐藥性監(jiān)測及基因型研究[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[6] 丁伯良，王英珍，李秀麗，等.天津地區(qū)雞致病性大腸桿菌血清型分布及其優(yōu)勢血清型的外膜蛋白型研究[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2003，24(2)：94-96.

R378.2+1

B

0529-6005(2017)09-0038-02

2016-12-05

李偉躍(1968-)，男，副教授，博士，主要從事動物營養(yǎng)與免疫研究，E-mail:zhmy.lizihao@163.com