顧以韌, 梁 艷, 楊雪梅, 陶 璇, 鐘志君, 楊躍奎, 曾 凱, 陳曉暉, 呂學(xué)斌

(四川省畜牧科學(xué)研究院，動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066)

豬不同泌乳期母乳外泌體中l(wèi)et-7a和let-7f的差異表達(dá)研究

顧以韌, 梁 艷*, 楊雪梅, 陶 璇, 鐘志君, 楊躍奎, 曾 凱, 陳曉暉, 呂學(xué)斌**

(四川省畜牧科學(xué)研究院，動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066)

【目的】為研究miRNAs在仔豬免疫系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控作用?！痉椒ā勘狙芯坎捎脽晒舛縋CR技術(shù)(Q-PCR)研究了不同泌乳期(0、3、7、14、21和28 d)的梅山豬和大約克夏豬母乳外泌體中l(wèi)et-7a和let-7f的差異表達(dá)?！窘Y(jié)果】let-7a和let-7f在泌乳早期(0～3 d)的表達(dá)豐度明顯高于泌乳后期(7～28 d)；品種間分析顯示梅山豬母乳外泌體中l(wèi)et-7a和let-7f在整個(gè)泌乳期(0～28 d)的表達(dá)水平均明顯高于大約克夏豬。【結(jié)論】研究表明，let-7a 和 let-7f能夠正向調(diào)控仔豬免疫系統(tǒng)發(fā)育。本研究可為闡明母乳外泌體包被的miRNA在幼畜免疫系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中的具體調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

豬; let-7; 母乳; 外泌體

【研究意義】母乳是幼畜的主要營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，并含有多種與免疫相關(guān)的物質(zhì)，如免疫球蛋白和乳鐵蛋白等，其在幼畜生長(zhǎng)和免疫系統(tǒng)發(fā)育方面起著至關(guān)重要的作用[1-2]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】miRNA是一類(lèi)內(nèi)源性、高度保守、長(zhǎng)度在18～25 nt的，并通過(guò)結(jié)合到靶mRNA上參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的非編碼小分子RNA，其參與細(xì)胞凋亡和脂肪代謝等多種生物學(xué)和病理學(xué)過(guò)程，并調(diào)控免疫細(xì)胞的發(fā)育[3-4]。Let-7是人類(lèi)最先發(fā)現(xiàn)的miRNA家族，由于在疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起著重要作用，其被認(rèn)為是脊椎動(dòng)物的癌癥標(biāo)記因子[5-6]。外泌體是由細(xì)胞衍生的直徑約30～100 nm的小囊泡體，其廣泛存在于動(dòng)物的各種體液中，可以保護(hù)其中包被的miRNA，mRNA 和蛋白質(zhì)，還能參與細(xì)胞之間信息的傳遞和遺傳物質(zhì)交換[7-8]。先前研究顯示，血清、血漿、唾液和尿液等體液中外泌體包被的miRNA與不同的生理和病理狀態(tài)密切相關(guān)[9-11]，而人、牛和豬母乳外泌體包被的miRNA對(duì)新生兒免疫系統(tǒng)的發(fā)育具有重要調(diào)控功能[10,12-13]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究采用q-PCR技術(shù)對(duì)梅山豬和大約克夏豬不同泌乳階段(0、3、7、14、21和28 d)母乳外泌體中l(wèi)et-7a和let-7f的發(fā)育表達(dá)模式進(jìn)行了系統(tǒng)研究。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以期闡明母乳外泌體中l(wèi)et-7a和let-7f在仔豬免疫系統(tǒng)建立過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制。該研究將為探明外泌體包被的miRNA在免疫系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中的具體調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并有助于進(jìn)一步闡明乳質(zhì)量形成的分子機(jī)制。

表1 引物信息

注：5S, 18S和U6 snRNA為內(nèi)參基因。

Note：5Sribosomal RNA, 18Sribosomal RNA, andU6 snRNA were used as endogenous control genes.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)豬只采用健康狀況良好的，分娩期相近的經(jīng)產(chǎn)梅山母豬和大約克夏母豬各3頭，所有豬只均由四川省畜牧科學(xué)研究院科研實(shí)驗(yàn)豬場(chǎng)提供。

1.2 樣本采集

在母豬分娩后的0(1 h內(nèi))、3、7、14、21和28 d分別采集實(shí)驗(yàn)所需的豬乳樣本各2管(每管3～5 mL)，并保存在液氮中用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 免疫球蛋白含量的ELISA檢測(cè)

不同泌乳期的母乳樣本中IgA, IgG和IgM水平采用ELISA商業(yè)試劑盒(R&D Systems, USA)由上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司檢測(cè)完成。

1.4 熒光定量PCR

1.4.1 外泌體中RNA提取 取母乳1.5 mL用2000 r/min離心10 min除去乳中的脂肪球，對(duì)上清液再次12 000 r/min離心30 min，并通過(guò)0.45 μm PVDF過(guò)濾去除細(xì)胞碎屑。吸取1 mL上清液加入500 μl ExoQuick Exosome Precipitation Solution (SBI, CA, USA)在4 條件下孵育12 h。將混合液以1500 r/min 離心30 min 獲得外泌體沉淀，將沉淀溶于250 μl nuclease-free水中。采用TRIzol-LS (Invitrogen, CA, USA)根據(jù)操作說(shuō)明抽提外泌體中RNA，并通過(guò)Agilent Bioanalyzer 2100 和RNA 6000 Nano LabChip Kit (Agilent, CA, USA)對(duì)抽提的RNA進(jìn)行質(zhì)檢。

1.4.2 QRT-PCR 采用One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit (TaKaRa, China)根據(jù)操作說(shuō)明將等量RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用SsoFast EvaGreen Supermix Kit (Bio-Rad, USA) 在CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad，USA)儀器上進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。每個(gè)反應(yīng)體系20 μl，由10 μl SsoFast EvaGreen 混合液, 2 μl cDNA, 1 μl上下游引物和7 μl RNA-free water (Ambion, USA) 組成。5S、18S和U6作為miRNA定量的內(nèi)參基因，引物信息見(jiàn)表1。所有目的miRNA定量結(jié)果均通過(guò)溶解曲線分析驗(yàn)證PCR產(chǎn)物的特異性，確保產(chǎn)物無(wú)引物二聚體，每個(gè)樣本重復(fù)3次。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的miRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Sigmaplot12.0對(duì)性狀指標(biāo)和基因表達(dá)量進(jìn)行ANOVA和T-test分析，相關(guān)性采用Pearson Correlation程序分析。

2 結(jié)果與分析

本研究采用ELISA 方法測(cè)定了2個(gè)豬種不同泌乳階段母乳中IgA, IgG和 IgM含量， 如圖1所示，兩豬種的母乳中富含IgA, IgG和 IgM，且發(fā)育模式相似，整體趨勢(shì)均表現(xiàn)為隨泌乳時(shí)間的增加而下降，且含量在3～7 d時(shí)均呈極顯著下降(P<0.01)，表明免疫球蛋白在幼畜早期免疫系統(tǒng)建立過(guò)程中起著更重要的作用。品種間比較顯示，梅山豬母豬中3種免疫球蛋白含量在整個(gè)泌乳階段均顯著或極顯著高于大約克夏豬 (P<0.01 或P<0.05)，這和我國(guó)地方豬種梅山豬的抗病能力強(qiáng)于引進(jìn)豬種大約克夏豬的種質(zhì)特性相一致[14]。

本研究采用Q-PCR技術(shù)對(duì)不同泌乳期母乳外泌體中l(wèi)et-7a和let-7f的發(fā)育性表達(dá)模式進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，let-7a和let-7f在兩豬種母乳外泌體中的發(fā)育表達(dá)模式呈現(xiàn)明顯的泌乳階段特異性(圖2)，均表現(xiàn)為在泌乳前期(0～3 d)的表達(dá)量極顯著高于泌乳后期(7, 14, 21和28 d) (P<0.01)，其表達(dá)模式與母乳中免疫球蛋白水平的發(fā)育性變化模式一致。品種間比較顯示，整個(gè)泌乳期(0～28 d)let-7a 和 let-7f在母乳外泌體中的表達(dá)水平均表現(xiàn)為梅山豬高于大約克夏豬(let-7a:P0,3,7,14 d<0.01,P28 d<0.05;let-7f:P0 d<0.05,P3,7,14,21,28 d<0.01)。與之相對(duì)應(yīng)的是梅山豬母乳中免疫球蛋白水平(IgA, IgG和IgM)也顯著或極顯著高于大約克夏豬。相關(guān)性分析顯示，let-7a 和let-7f在兩豬種母乳外泌體中的表達(dá)水平與免疫球蛋白含量均呈極顯著的正相關(guān)(rlet-7a>0.86,P<0.01)。

*和**分別表示同一泌乳階段不同品種間差異達(dá)顯著水平(P<0.05)或極顯著水平(P<0.01)；同一品種不同泌乳階段間字母相同者表示差異不顯著, 字母不同者表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05)(小寫(xiě)字母)或極顯著水平(P<0.01)(大寫(xiě)字母)* P<0.05, ** P<0.01 between breeds at the same age. Different letters indicate a significant difference at P<0.05 (lowercase letter) or P<0.01 (capital letter) levels between days of the same breed圖1 兩豬種不同泌乳階段免疫球蛋白含量差異Fig.1 Immunoglobulin differences between pig breeds and age of pigs

圖2 let-7a(A) 和let-7f(B) 在不同豬種母乳外泌體中發(fā)育性表達(dá)模式Fig.2 Breed- and day-specific expression patterns of let-7a(A) and let-7f(B)

3 討 論

先前研究表明let-7a能調(diào)控炎癥相關(guān)誘導(dǎo)因子IL-6的信號(hào)傳導(dǎo)，并激活SAT3信號(hào)通路[15]；let-7f可通過(guò)靶基因A20調(diào)控機(jī)體對(duì)結(jié)核病(Mtb)的抵抗能力，并通過(guò)影響體內(nèi)腫瘤壞死因子和IL-1β的含量，調(diào)控機(jī)體的免疫能力[16]。此外，let-7a和let-7f還具有調(diào)控體內(nèi)B細(xì)胞和T細(xì)胞分化和影響其活性的功能，進(jìn)而影響機(jī)體的免疫能力[17-18]，而母乳外泌體中的miRNAs可通過(guò)消化道進(jìn)入幼畜體內(nèi)發(fā)揮其對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)控作用。本研究中不同豬種母乳中免疫球蛋白(IgA, IgG和 IgM)含量與let-7a和let-7f的表達(dá)變化呈極顯著的正相關(guān)，暗示let-7a和let-7f可影響乳質(zhì)量的形成，其在外泌體的保護(hù)下進(jìn)入幼畜體內(nèi)，作用于靶mRNA，發(fā)揮其在新生幼畜機(jī)體免疫系統(tǒng)建立和完善過(guò)程中的正向調(diào)控作用。母乳外泌體中l(wèi)et-7a和let-7f表達(dá)水平在梅山豬整個(gè)泌乳期均高于大約克夏豬，表明梅山豬新生幼畜能夠在母乳中miRNAs的調(diào)控下更快建立起完善的機(jī)體免疫系統(tǒng)，這可能也是梅山豬的抗病能力強(qiáng)于大約克夏豬的重要原因之一。母乳外泌體中l(wèi)et-7a和let-7f的發(fā)育性表達(dá)模式表明初乳在初生仔豬免疫系統(tǒng)的建立和完善過(guò)程中比常乳起著更加重要的作用，常乳更主要作用是提供仔豬機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。值得注意的是本研究中的miRNAs和免疫球蛋白水平在大約克夏豬泌乳期21 d時(shí)均出現(xiàn)輕微上升，推測(cè)可能是由于仔豬斷奶應(yīng)急引起的。鑒于外泌體中miRNA對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的發(fā)育和完善具有重要的調(diào)控功能，有必要對(duì)其具體調(diào)控機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)深入的研究。

4 結(jié) 論

本研究表明let-7a和let-7f能夠正向調(diào)控仔豬免疫系統(tǒng)發(fā)育，其在梅山豬母乳外泌體中的高表達(dá)能夠增強(qiáng)仔豬對(duì)疾病的抵抗能力。本研究結(jié)果可為闡明乳質(zhì)量形成的分子基礎(chǔ)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并為畜牧業(yè)中的抗病育種研究提供新的研究思路。

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ExpressionChangesofmicroRNAslet-7aandlet-7finPigMilkExosomesduringDifferentLactationPeriods

GU Yi-ren, LIANG Yan*, YANG Xue-mei, TAO Xuan, ZHONG Zhi-jun, YANG Yue-kui, ZENG Kai, CHEN Xiao-hui, LV Xue-bin**

(Sichuan Animal Science Academy, Sichuan Chengdu 610066, China)

【Objective】It is of great interest to understand the mechanism underlying breast milk quality for immune disease research.【Method】The expression changes oflet-7aandlet-7fmiRNAs were analyzed in porcine milk exosomes across the entire lactation period (newborn to 28 days after birth) by quantitative real-time PCR. 【Result】let-7aandlet-7fwere more abundant in the early lactation period (0 and 3days) than in the later lactation period (7, 14, 21 and 28 days), and were expressed at higher levels in Meishan pigs compared with Yorkshire pigs throughout the entire lactation period. 【Conclusion】This study is a preludetoin-depth investigations of the essential roles of breast milk exosome-packaged miRNAs in the development of the infant’s immune system.

Pig; let-7; miRNA; Milk; Exosomes

1001-4829(2017)5-1218-04

10.16213/j.cnki.scjas.2017.5.040

2016-06-15

國(guó)家自然科學(xué)基金(31301942)；四川省畜牧科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(SASA2014A08；SASA2015A01)；四川省科技支撐計(jì)劃(2014NZ0092)

顧以韌(1980-)，男，江蘇響水人，博士，研究方向?yàn)樨i遺傳育種，*為共同第一作者，**為通訊作者：呂學(xué)斌，E-mail: guyiren1128@163.com。

S828

A

(責(zé)任編輯 李 潔)