張康迪，劉 偉

（河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

基于低共熔溶劑的液相微萃取-高效液相色譜法測定大豆油中的TBHQ

張康迪，劉 偉*

（河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

建立了一種基于綠色低共熔溶劑的液相微萃取與高效液相色譜聯(lián)用技術(shù)，用于測定大豆油中的合成抗氧化劑TBHQ。結(jié)果表明，氯化膽堿/乙二醇在物質(zhì)的量比為1∶2時(shí)組成的低共熔溶劑對大豆油中的TBHQ具有較高的萃取率。最佳萃取條件為：低共熔溶劑用量400 μL，油用量0.15 g，萃取溫度50℃，萃取時(shí)間30 min，正己烷用量 2 mL。檢測限為 0.02 μg/mL，回收率在98.5%～112%范圍內(nèi)，日內(nèi)和日間精密度均小于2%。該方法成功應(yīng)用于市售大豆油樣品中TBHQ的測定，接近于使用國標(biāo)方法的測定結(jié)果。

低共熔溶劑；抗氧化劑；TBHQ；大豆油；液相微萃取

0 前言

眾所周知，抗氧化劑是通過延緩由氧化引起的食品劣變來保護(hù)食物的物質(zhì)[1]?？寡趸瘎┓譃樘烊豢寡趸瘎┖秃铣煽寡趸瘎?，其中油脂中常使用合成抗氧化劑，如 BHA、BHT、TBHQ 等[2]。TBHQ 是油脂抗氧化能力最強(qiáng)、使用最廣泛的一種合成抗氧化劑。大量研究證明：TBHQ具有不會(huì)引起油脂變色、抗氧化能力強(qiáng)、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。但是，毒理學(xué)研究顯示，TBHQ在動(dòng)物試驗(yàn)中有一些副作用，如造成動(dòng)物的胃腫瘤和DNA損傷[3]。因此，對油脂中TBHQ的添加量有嚴(yán)格限定，不允許過量添加。美國FDA規(guī)定，TBHQ在食品中使用的最大限量為油脂或食品中脂肪含量的0.02%。我國從1991年開始允許TBHQ作為添加劑用于油脂行業(yè)，最大使用限量為200 mg/kg。

現(xiàn)階段，對油脂中的酚類成分的檢測方法主要是先進(jìn)行液-液萃取，然后用高效液相色譜分析儀進(jìn)行檢測。常用的萃取劑有乙腈、甲醇等傳統(tǒng)有機(jī)溶劑，但是這些萃取劑具有較大的毒性，試驗(yàn)過程中對操作人員產(chǎn)生一定的毒害，且對環(huán)境也會(huì)造成污染。隨著全社會(huì)環(huán)保意識的增強(qiáng)，人們更希望能找到一種綠色無污染的新型溶劑來代替這些毒性較大的傳統(tǒng)溶劑。

2003年，Abbott等[4]首次發(fā)現(xiàn)了一種由季銨鹽（如氯化膽堿）和酰胺化合物（如尿素）形成的物理化學(xué)性質(zhì)優(yōu)良的溶劑——低共熔溶劑（deep eutectic solvents，DES）。這種溶劑無毒，可生物降解，且合成過程原子利用率達(dá)100%，是一種新型的綠色溶劑。低共熔溶劑的制備過程簡單，將一定物質(zhì)的量比的季銨鹽和氫鍵供體混合，在一定的溫度下攪拌直至形成均一透明液體即可，無需純化即可直接使用。與離子液體相比，低共熔溶劑具有低揮發(fā)性、低熔點(diǎn)、高熱穩(wěn)定性、選擇性溶解能力以及合成簡單、成本低、無毒性、可生物降解、環(huán)境友好等諸多特點(diǎn)[5-7]，在眾多領(lǐng)域中顯示出廣闊的應(yīng)用前景。隨著人們對低共熔溶劑性質(zhì)研究的不斷深入，其在分離提取過程中顯示出較強(qiáng)的優(yōu)越性，特別是在油脂中酚類化合物的提取過程中[8-9]，如從棕櫚毛油中提取維生素E[10]，測定橄欖油中的總酚含量[11]等。但是應(yīng)用于食用油脂中合成抗氧化劑TBHQ的提取及測定還未見報(bào)道，故作者使用低共熔溶劑對大豆油中的TBHQ進(jìn)行萃取，并采用高效液相色譜法進(jìn)行分析，以期為分析檢測油脂中的抗氧化劑TBHQ提供新的方法和思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆油：河南陽光油脂集團(tuán)有限公司；TBHQ（HPLC，純度≥99.00%）：美國Sigma-Aldrich公司；氯化膽堿（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；尿素、甘油、乙二醇、1.2-丙二醇、乳酸：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純）：美國生物VBS天津景隆元科技發(fā)展有限公司；正己烷（色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；純凈水：娃哈哈集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters e2695高效液相色譜分析儀、Waters 2489紫外檢測器：美國Waters公司；SCQ-250B超聲儀：上海生彥超聲儀器有限公司；TDL-80-2B型低速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；BSA224S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；磁力攪拌器：IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 DES的制備

將氯化膽堿與氫鍵供體（如尿素、甘油、乙二醇、乳酸、1.2-丙二醇、水）按照一定的物質(zhì)的量比混合（表1），加熱攪拌直至形成均一透明的液體。

表1 不同組成的DESTable 1 Compositions of different DES

1.3.2 TBHQ的萃取方法

準(zhǔn)確稱取一定量的油樣于磨口具塞三角瓶中，并用正己烷溶解，加入一定量的低共熔溶劑，萃取，在 3 000 r/min下離心10 min，取 DES相用高效液相色譜儀分析。

1.3.3 抗氧化劑的HPLC檢測[12]

色譜柱：Waters Symmetry C18柱（250 mm×5 μm×4.6 mm）；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。采用梯度洗脫，流動(dòng)相A：甲醇，B：0.5%乙酸水，其中A：0～7 min，40%～80%；7～15 min，80%～100%；15～20 min，100% ；20 ～28 min，100% ～40% ；28 ～40 min，40%。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。建立TBHQ的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算油脂中TBHQ的萃取率。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取方式的選擇

萃取方式直接影響目標(biāo)物的萃取效率。超聲波在介質(zhì)中傳播，穿過介質(zhì)時(shí)，產(chǎn)生空化作用，從而細(xì)化物質(zhì)，加速目標(biāo)成分進(jìn)入溶劑，提高提取率。恒溫?fù)u床萃取方法是對兩相液體進(jìn)行搖動(dòng)振蕩，使兩相不相溶的液體充分接觸。分別使用這兩種方式對大豆油中的TBHQ進(jìn)行萃取。結(jié)果表明，超聲萃取可以較快達(dá)到最大的萃取效率，且其在食品藥品分析檢測領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，故采用超聲萃取方式進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 DES的選擇

溶劑體系的選擇由樣品材料中提取的目標(biāo)化合物的性質(zhì)決定。在相同的超聲萃取條件下，由圖1可知，6種溶劑中TBHQ萃取率最高的組分是DES-3（氯化膽堿/乙二醇），萃取率達(dá)到85.09%。原因是氯化膽堿/乙二醇物質(zhì)的量比為1∶2形成的低共熔溶劑的黏度比較小，流動(dòng)性好，擴(kuò)散率大使得其對大豆油中TBHQ有更好的提取效果。比較不同低共熔溶劑的萃取率，可以得出氯化膽堿/乙二醇組成的低共熔溶劑的萃取效果最好。此外，有研究表明，向低共熔溶劑中加入一定量的水可以降低其黏度，在某些情況下可以提高目標(biāo)物萃取效率。因此，向低共熔溶劑中加入水，研究其萃取效果。結(jié)果顯示，含水的低共熔溶劑（DES-6）的萃取效率明顯低于不含水的萃取效率（DES-3）。因此本研究選擇氯化膽堿/乙二醇組成的低共熔溶劑作為最佳萃取溶劑。

圖1 溶劑種類對萃取率的影響Fig.1 Effect of extraction solvent on the extraction efficiency of TBHQ from soybean oil

2.3 萃取溫度的選擇

在該萃取體系中，適當(dāng)升高溫度可以使低共熔溶劑的黏度下降，使得低共熔溶劑有更好的流動(dòng)性，從而使溶劑與油樣的傳質(zhì)更加充分，使提取更加徹底，從而提高萃取效率。從圖2可以看出，隨著溫度的升高，TBHQ的萃取率先逐漸升高，到達(dá)50℃后趨于平穩(wěn)。所以，在研究中選擇50℃作為提取的最佳溫度。

圖2 萃取溫度對萃取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction efficiency of TBHQ from soybean oil

2.4 萃取時(shí)間的選擇

在一定時(shí)間范圍內(nèi)，隨著時(shí)間的延長可以使反應(yīng)更加充分，提高萃取效率。從圖3可以看出：大豆油中TBHQ的萃取率隨時(shí)間的延長先增大后稍有減小，這是由于在一定時(shí)間范圍內(nèi)，萃取時(shí)間越長，使得低共熔溶劑萃取目標(biāo)化合物越充分。然而，操作時(shí)間過長，會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)體系中的TBHQ發(fā)生少量氧化損失。萃取時(shí)間在30 min時(shí)萃取效率達(dá)到最大值，為91.77%。

圖3 萃取時(shí)間對萃取率的影響Fig.3 Effect of the extraction time on the extraction efficiency of TBHQ from soybean oil

2.5 低共熔溶劑用量的選擇

從圖4可以看出，萃取率隨著低共熔溶劑加入量的增加而增加，當(dāng)達(dá)到一定值時(shí)，TBHQ的萃取率趨于平穩(wěn)，這是由于當(dāng)油樣的量不變時(shí)，萃取溶劑量過少，導(dǎo)致油樣與萃取劑接觸不夠充分；也可能是萃取劑所能溶解的TBHQ已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài)而造成萃取率偏低。但是如果加入萃取劑過多會(huì)消耗超聲能量同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致萃取劑的浪費(fèi)，在本研究中，低共熔溶劑的最適用量為400 μL，TBHQ萃取率達(dá)到93.23%。

圖4 低共熔溶劑用量對萃取率的影響Fig.4 Effect of the DES amount on the extraction efficiency of TBHQ from soybean oil

2.6 油用量的選擇

圖5是油樣用量對萃取率的影響，隨著油樣的用量從0.5 g減少到0.08 g時(shí)，TBHQ的萃取效率逐漸提高，當(dāng)油樣用量為0.15 g時(shí)，TBHQ的萃取效率達(dá)到103%，最接近真實(shí)值，因此，在萃取過程中選擇0.15 g作為油樣的最佳用量。

圖5 油樣用量對萃取率的影響Fig.5 Effect of oil amount on the extraction efficiency of TBHQ from soybean oil

2.7 正己烷用量的選擇

為了使萃取過程中傳質(zhì)更加充分，加入正己烷來稀釋油樣，正己烷用量對萃取率的影響見圖6。如圖6可知，不加正己烷的萃取率明顯低于加入正己烷的萃取率。當(dāng)正己烷的量在一定范圍內(nèi)時(shí)，隨著正己烷加入量的增加，TBHQ的萃取效率先增加后趨于平穩(wěn)。因此，加入2 mL正己烷可使萃取效率更高。

圖6 正己烷用量對萃取率的影響Fig.6 Effect of n-hexane amount on the extraction efficiency of TBHQ from soybean oil

2.8 方法表征

為了更好地評價(jià)該萃取方法，設(shè)計(jì)了一系列試驗(yàn)進(jìn)行表征，包括線性關(guān)系、回收率、精確度、檢測限（LOD）和定量限（LOQ）。通過外標(biāo)法在 0～500 mg/kg范圍內(nèi)校準(zhǔn)曲線，用HPLC-UV法分析。線性回歸方程為y=7 648.9x-9 884.4，其中y是分析物的峰面積，x是分析物的濃度（μg/mL）。TBHQ顯示出良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999 8。TBHQ最低檢出限為0.02 μg/mL，最低定量限為0.06 μg/mL。為了評估回收率，向大豆油中加入3種不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)樣品測定3次，計(jì)算TBHQ的加標(biāo)回收率。如表2所示，得到了在98.5%～112%范圍內(nèi)較高的加標(biāo)回收率。此外，還測定了日內(nèi)和日間精密度。對于日內(nèi)精密度，大豆油樣品在同一天測定6次，TBHQ濃度的RSD為1.1%。對于日間精密度，在5個(gè)不同工作日測定樣品，RSD為1.7%。顯然，該萃取方法具有較高回收率和精密度，適用于大豆油中TBHQ的定量分析。

表2 加標(biāo)回收率的測定Table 2 Recovery rate of TBHQ

2.9 實(shí)際樣品檢測

從當(dāng)?shù)爻匈徺I了6種大豆油來測定其中TBHQ的含量，結(jié)果如表3所示。同時(shí)，與傳統(tǒng)方法（甲醇萃?。y得的TBHQ含量進(jìn)行了對比，發(fā)現(xiàn)基于低共熔溶劑的萃取結(jié)果與傳統(tǒng)方法得出結(jié)果極為相近。但是，與傳統(tǒng)溶劑萃取方法相比，基于低共熔溶劑的萃取方法所需油樣量（0.15 g）和萃取溶劑的量（400 μL）較少，更加符合微萃取的概念。因此，基于低共熔溶劑的微萃取方法是一種高效、低成本和環(huán)境友好型的綠色萃取技術(shù)。

表3 實(shí)際樣品檢測Table 3 Sample detection

3 結(jié)論

本研究采用基于低共熔溶劑的超聲微萃取技術(shù)成功從大豆油中提取TBHQ，并使用HPLC-UV方法進(jìn)行檢測。由氯化膽堿和乙二醇組成的DES在優(yōu)化條件下表現(xiàn)出較高的提取效率，其萃取率接近100%。在實(shí)際樣品分析中，其測定結(jié)果接近國標(biāo)方法。此外，將DES溶劑直接注入反相HPLC系統(tǒng)進(jìn)行分析，不涉及相轉(zhuǎn)化過程，可極大地簡化樣品預(yù)處理過程，表明DES是一種用于提取油脂中抗氧化劑TBHQ的理想溶劑。

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DEEP EUTECTIC SOLVENT BASED SOLVENT MICROEXTRACTION-HPLC MEDTHOD FOR DETERMINATION OF TBHQ IN SOYBEAN OIL

ZHANG Kangdi ，LIU Wei
（School of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou450001，China）

A green and inexpensive ultrasonic-assisted liquid-liquid microextraction （UALLME） technique based on deep eutectic solvents （DESs） was employed in the extraction and separation of TBHQ from soybean oils.The results showed that the deep eutectic solvents （DESs） composed of choline chloride / ethylene glycol at molar ratio 1∶2 had the highest extraction rate of TBHQ in soybean oil. In a typical experiment，400 滋L DES as extraction solvent was added to 2.0 mL sample solution containing 0.15 g soybean oil，extraction time was 30 min，extraction temperature was 50 ℃，and then ultrasonic-assisted extraction was applied. After centrifugation，DES phase containing TBHQ was directly analyzed by reverse phase high-performance liquid chromatograph-ultraviolet detector （HPLC-UV） and no phase inversion was involved，which could simplify the sample pretreatment process. This method was successfully applied to the determination of TBHQ in 6 soybean oil samples，and the results were close to those of conventional liquid-liquid extraction with methanol as solvent.The linearity，the intra-day precision，the recovery rate and the detection limit of this method were also evaluated.It was concluded that the method was stable and reproducible，which was suitable for the detection and analysis of TBHQ in soybean oil.

Deep Eutectic Solvent；antioxidant；TBHQ；soybean oil；solvent microextraction

TS 225.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

1673-2383(2017)05-0032-05

http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20171030.0936.014.html

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-10-30 9:36:35

2017-02-24

河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助計(jì)劃（2014GGJS-058）；河南工業(yè)大學(xué)青年骨干教師培育計(jì)劃（2014003）

張康迪（1993—），女，河南新鄉(xiāng)人，碩士研究生，研究方向?yàn)橹|(zhì)化學(xué)與品質(zhì)。

*通信作者