周紅艷 臧睿覺 王玨 劉茜 張曉旻 曹靈 梅予鋒

氟化鈉-殼聚糖凝膠對(duì)乳牙釉質(zhì)早期齲再礦化實(shí)驗(yàn)觀察

周紅艷 臧睿覺 王玨 劉茜 張曉旻 曹靈 梅予鋒

目的探討氟化鈉殼聚糖凝膠促進(jìn)乳牙釉質(zhì)早期齲模型再礦化的可行性。方法乳前牙試件使用乳酸羧甲基纖維素凝膠預(yù)處理，制備早期齲模型；早期齲的乳前牙試件隨機(jī)分成4 組(n=6)，3 組分別進(jìn)行氟化鈉殼聚糖凝膠、殼聚糖空白凝膠、多樂氟處理，1 組作為空白對(duì)照，處理完成后進(jìn)行pH循環(huán)，SEM、EDS檢測(cè)循環(huán)完成后的試件表面。結(jié)果SEM觀察，氟化鈉殼聚糖凝膠能更好的保護(hù)釉質(zhì)表層結(jié)構(gòu)不受破壞，而多樂氟和空白對(duì)照組，則表現(xiàn)出釉質(zhì)表層的崩解。同時(shí)氟化鈉殼聚糖凝膠有更多的礦化物結(jié)晶在釉質(zhì)表面形成。EDS檢測(cè)鈣離子的沉積比例，氟化鈉殼聚糖凝膠組明顯多于其余各組(P<0.05)。結(jié)論氟化鈉殼聚糖凝膠可以提高乳前牙早期齲的再礦化水平。

殼聚糖水凝膠； 氟化鈉； 乳牙； 早期齲； 再礦化

對(duì)于兒童牙病來說，早期齲的再礦化治療是一項(xiàng)理想的微創(chuàng)治療方法。促進(jìn)再礦化的藥物對(duì)于這一微創(chuàng)治療來說是至關(guān)重要的。氟化物，CPP-ACP等都有很好的臨床應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)通過制備乳牙釉質(zhì)早期齲模型，使用氟化鈉殼聚糖凝膠處理后，進(jìn)行pH循環(huán)的再礦化治療，并通過SEM及EDS觀察再礦化的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

乳前牙，南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院兒童牙病科拔出的乳前牙24 顆，已征得患兒及家長同意，要求乳前牙沒有齲壞，磨耗量適中保證唇面釉質(zhì)的大小，釉質(zhì)表面沒有裂紋，拔出時(shí)注意不要用力過猛，造成不必要的裂紋。

殼聚糖氟化鈉凝膠(單位自制，正在申請(qǐng)專利)。

多樂氟(Sigma,美國),乙酸、無水氯化鈣、磷酸二氫鉀、羧甲基纖維素鈉(AR，滬試)，HEPES(AR，Sigma),掃描電鏡(JSM-6360LV)，能譜儀(GENESIS-2000XMS60)。

1.2 方法

1.2.1 釉質(zhì)試件制備 選取拔除的乳前牙24 顆，用金剛砂平頸緣去除牙根，橡皮輪拋光釉質(zhì)表面，三用槍沖洗表面30 s后，置于去離子水中，4 ℃冰箱保存。

存放24 h后，取出乳前牙，使用低速切割機(jī)切去厚約3 mm除唇側(cè)釉質(zhì)片。釉質(zhì)片唇側(cè)中央預(yù)留3 mm×3 mm的實(shí)驗(yàn)區(qū)域，其余部分用抗酸指甲油，涂3 遍，待指甲油干燥后，置于去離子水中，4 ℃冰箱保存。

1.2.2 釉質(zhì)試件處理 稱取64.4 g羧甲基纖維素鈉顆粒，7.46 ml乳酸，用1 L去離子水充分?jǐn)嚢?4 h，pH儀測(cè)定其pH值。取出釉質(zhì)片，用吸水紙吸干表面水分，全部浸沒在乳酸羧甲基纖維素鈉凝膠中，放入37 ℃恒溫箱48 h，制作早期齲模型。從凝膠中取出釉質(zhì)片，三用槍沖洗1 min去除表面的凝膠后，置于去離子水4 ℃冰箱中備用。取早期齲模型的釉質(zhì)片，隨機(jī)分成4 組(n=6)，3 組分別進(jìn)行藥物涂布，均勻地涂上氟化鈉殼聚糖凝膠，殼聚糖空白凝膠，多樂氟，每組涂布1 min, 靜置4 h，另一組不處理作為空白對(duì)照。

1.2.3 pH循環(huán)實(shí)驗(yàn) 去離子水配制1 L含1.5 mmol/L CaCl2、0.9 mmol/L KH2PO4及4.766 2 g HEPES的再礦化液，去離子水配制1 L含1.5 mmol/L CaCl2、0.9 mmol/L KH2PO4及50 mmol/L乙酸的脫礦液。

對(duì)各組釉質(zhì)片每片進(jìn)行pH循環(huán)處理，每次5 ml脫礦液3 h， 5 ml再礦化液21 h，換液之間，用去離子水沖凈，吸水紙吸干。經(jīng)過7 d的循環(huán)，取出釉質(zhì)片，去離子水洗凈，放入去離子水中4 ℃冰箱保存。

1.2.4 釉質(zhì)試件再礦化檢測(cè) 各組釉質(zhì)片進(jìn)行SEM及EDS測(cè)定，收集整理數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，SPSS 19軟件統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 SEM結(jié)果

各組再礦化后電鏡顯示，氟化鈉殼聚糖凝膠組(圖 1A、E)釉質(zhì)表面結(jié)構(gòu)粗糙，孔隙大部分被新生的礦物質(zhì)結(jié)晶所堵塞，結(jié)晶結(jié)構(gòu)相對(duì)統(tǒng)一，能看到明顯的結(jié)晶形態(tài)。殼聚糖空白凝膠組(圖 1B、F)釉質(zhì)表面呈蜂窩狀凹陷，大量的孔隙結(jié)構(gòu)暴露，個(gè)別孔隙被結(jié)晶結(jié)構(gòu)堵塞。多樂氟組(圖 1C、G)釉質(zhì)表面粗糙，有散在的不規(guī)則結(jié)晶結(jié)構(gòu)，同時(shí)也能觀察到不少孔隙。空白對(duì)照組(圖 1D、H)釉質(zhì)表面形態(tài)不規(guī)則、粗糙，大量的孔隙結(jié)構(gòu)，少數(shù)的結(jié)晶結(jié)構(gòu)。

2.2 EDS檢測(cè)結(jié)果

圖 1 各組再礦化后釉質(zhì)表面 (SEM, A～D: ×1 000； E～H： ×1 500)

Fig 1 Enamel surface of the each group after remineralization

(SEM, A～D: ×1 000； E～H： ×1 500)

2.2.1 F元素、P元素、Ca元素方差分析 F、P的元素組間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Ca元素的單因素方差分析氟化鈉殼聚糖凝膠組高于其余各組(P<0.05)，其余各組兩兩比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表 1，圖 2)。

圖 2 各組樣本F、P、Ca元素比例比較(%)

3 討 論

早期齲的形成主要是釉質(zhì)在細(xì)菌的酸性產(chǎn)物作用下，引起釉質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)脫礦，羥基磷灰石的結(jié)構(gòu)遭到破壞，鈣磷等離子從中流失。最早期的表現(xiàn)就是釉質(zhì)的顏色發(fā)生變化，呈現(xiàn)白堊色。這一變化，在臨床治療中經(jīng)常能夠見到。早期齲出現(xiàn)后，針對(duì)病癥的治療是當(dāng)下研究的熱點(diǎn)，控制早期的齲病不再發(fā)展，可抑制基質(zhì)結(jié)構(gòu)的崩塌這樣不可逆的結(jié)果的發(fā)生[1]。Gurunathan[2]、Sk?ld-Larsson[3]等的實(shí)驗(yàn)指出了再礦化治療釉質(zhì)白色病損的機(jī)制和方法，這樣的早期齲壞經(jīng)過治療是可逆的，因?yàn)橥僖褐械拟}磷是處于飽和的平衡狀態(tài)，脫礦的釉質(zhì)在一天中是不斷地和唾液接觸，脫礦和再礦化對(duì)于釉質(zhì)來說是一個(gè)每天不斷進(jìn)行的過程。

本項(xiàng)目另一部分實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)本課題制作的氟化鈉殼聚糖水凝膠為智能型凝膠，隨溫度升高凝膠由液相向膠體相的轉(zhuǎn)變，在溫度達(dá)到37 ℃時(shí)，8 min內(nèi)迅速變成薄膜狀緊密附著在牙面。pH值接近中性，生物相容性較好。作為大分子多糖，凝膠化后，提供的空間可以作為藥物的良好載體。口腔局部用藥，參考多樂氟這一口腔涂氟經(jīng)典藥物，4 h時(shí)的作用時(shí)間，可以達(dá)到70%多的藥物釋放量，可以充分地發(fā)揮藥物的作用。因此本實(shí)驗(yàn)使用氟化鈉殼聚糖溫敏凝膠進(jìn)行乳牙釉質(zhì)早期齲再礦化研究是可行的。

氟化物可以促進(jìn)釉質(zhì)的再礦化這一理論早已被寫進(jìn)教科書，這是因?yàn)榉x子的大小與羥基接近，且結(jié)合能力強(qiáng)，可以置換羥基磷灰石中的羥基和碳酸根，并填補(bǔ)羥基磷灰石的一些離子空隙，形成的氟磷灰石穩(wěn)定性更高，強(qiáng)度更大。本研究通過SEM可以直觀的觀察到釉質(zhì)的表層結(jié)構(gòu)，通過區(qū)分結(jié)構(gòu)的變化說明處理對(duì)于釉質(zhì)的作用。高潔等[58]的實(shí)驗(yàn)，通過掃描電鏡觀察乳切牙牙體結(jié)構(gòu)，展示了正常乳切牙的釉質(zhì)表面結(jié)構(gòu)，釉質(zhì)與牙本質(zhì)的相接的結(jié)構(gòu)，為乳牙的釉質(zhì)形態(tài)觀察展示了良好的辦法。郭青玉[4]、金燕[5]、劉梅天[6]等指出SEM觀察下，未處理時(shí)牙釉質(zhì)的表面形態(tài)光滑,而酸蝕后的牙釉質(zhì)表面呈現(xiàn)多孔的蜂窩狀或魚鱗狀結(jié)構(gòu)，這種酸蝕后描述上的差異可能與投照的角度有關(guān)，并指出了經(jīng)過再礦化實(shí)驗(yàn)后釉質(zhì)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)散在的礦化結(jié)節(jié)，表面粗糙，這些實(shí)驗(yàn)支持了本實(shí)驗(yàn)觀察到的結(jié)果。首先空白對(duì)照組，在單純的pH值循環(huán)后出現(xiàn)少量的結(jié)晶結(jié)構(gòu)散在釉質(zhì)表面，表面結(jié)構(gòu)粗糙，孔隙較多，說明再礦化作用不明顯；多樂氟組的釉質(zhì)表面觀察到了更多的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，但仍為散在的分布于表面，表面粗糙，與光滑的釉質(zhì)表面結(jié)構(gòu)有所區(qū)別；而殼聚糖空白凝膠組，觀察到的釉質(zhì)表面結(jié)構(gòu)為鱗片狀的大量的孔隙結(jié)構(gòu)，釉質(zhì)表面在經(jīng)過了pH值循環(huán)之后，只有少量的礦物質(zhì)結(jié)晶的形成；氟化鈉殼聚糖凝膠的SEM觀察結(jié)果，顯示了脫礦的孔隙周圍在經(jīng)過了pH值循環(huán)后大量的結(jié)晶結(jié)構(gòu)排列并阻塞了釉質(zhì)表面的孔隙。SEM的結(jié)果提示，殼聚糖凝膠可能滲透入釉質(zhì)的脫礦孔隙中，釉柱的直徑約4～6 μm，釉柱峭即釉柱間隙要小于這一寬度，殼聚糖凝膠這一高聚物的大分子結(jié)構(gòu)可能僅能夠滲透入酸蝕后的釉質(zhì)孔隙中，這與本課題的另一實(shí)驗(yàn)結(jié)果，相呼應(yīng)。

Arnaud的實(shí)驗(yàn)[7]指出單純殼聚糖鹽酸溶液能夠滲透入正常釉質(zhì)表面的孔隙當(dāng)中形成屏障作用來達(dá)到抗酸蝕的作用，正常釉質(zhì)表面的孔隙多來自釉柱間隙，本實(shí)驗(yàn)中殼聚糖凝膠表現(xiàn)為阻止了釉質(zhì)孔隙結(jié)構(gòu)與礦化液的接觸沒有形成礦化物結(jié)晶結(jié)構(gòu)。同時(shí)殼聚糖凝膠在pH值循環(huán)后，釉質(zhì)表面的結(jié)構(gòu)和酸蝕后的蜂窩狀結(jié)構(gòu)極為相似，而多樂氟及空白對(duì)照組pH值循環(huán)后表面粗糙，散在的礦化物結(jié)晶，無類蜂窩狀的結(jié)構(gòu)；氟化鈉殼聚糖凝膠則表現(xiàn)為大量的礦化物結(jié)晶阻塞孔隙，結(jié)晶結(jié)構(gòu)為條索狀，酸蝕后的蜂窩狀結(jié)構(gòu)也隱約可見，提示了與多樂氟相比氟化鈉殼聚糖凝膠及殼聚糖凝膠有維持釉質(zhì)表面結(jié)構(gòu)不變的能力，這與當(dāng)今的早期齲微創(chuàng)治療原則不謀而合。Zhou等[8]通過AFM觀察，酸蝕過后的釉質(zhì)表面經(jīng)過再礦化處理后，孔隙結(jié)構(gòu)可以被結(jié)晶所填塞，礦化效果越好，其表面結(jié)構(gòu)約趨于平坦；本實(shí)驗(yàn)中氟化鈉殼聚糖凝膠SEM結(jié)果提示有大量的礦化物結(jié)晶形成，再礦化治療的效果明顯。

EDS，全稱是energy dispersive spectrometer即能量色譜儀用來對(duì)材料微區(qū)成分元素種類與含量進(jìn)行。電子轟擊表面結(jié)構(gòu)，散射出來的不同波普的X線經(jīng)過收集，電腦處理，比較出這一區(qū)域的元素構(gòu)成比，比例的不同，提示了酸蝕處理后釉質(zhì)表面經(jīng)過再礦化之后的元素變化。釉質(zhì)表面的鈣磷以及氟在一定程度上是成比例的，而且這一比例一般情況下不會(huì)發(fā)生變化，Peric的實(shí)驗(yàn)[9]也指出了EDS檢測(cè)的元素比例即便在再礦化后沒有顯著性的差異。由本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，氟及磷的元素含量在各組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，各組含量均值近似相等，這可能與氟化鈉殼聚糖凝膠及多樂氟的藥物在預(yù)處理完酸蝕后的釉質(zhì)表面后即去除，而后經(jīng)歷了pH值循環(huán)，氟元素并沒有更多的沉積在釉質(zhì)表面有關(guān)，并且氟和磷達(dá)到了一個(gè)平衡值；鈣元素的含量，氟化鈉殼聚糖凝膠明顯要高于多樂氟、殼聚糖空白水凝膠及空白對(duì)照組，這與SEM的觀察結(jié)果是統(tǒng)一的，多樂氟、空白對(duì)照組都有少數(shù)結(jié)晶結(jié)構(gòu)堵塞了釉質(zhì)表面的孔隙結(jié)構(gòu)，殼聚糖空白水凝膠則表現(xiàn)為孔隙暴露，沒有更多的結(jié)晶結(jié)構(gòu)形成，此三組都沒有更多的Ca元素沉積，而氟化鈉殼聚糖凝膠組有大量的礦化物結(jié)晶在孔隙周圍形成阻塞了釉質(zhì)酸蝕后的孔隙結(jié)構(gòu)，所以EDS測(cè)定后有更多的Ca元素的沉積，Amaechi[10]用EDS檢測(cè)也證明了Ca元素比例的變化。說明氟化鈉殼聚糖凝膠相較于其他各組促進(jìn)釉質(zhì)再礦化的能力都要高。

氟化物作為治療早期齲的經(jīng)典藥物，局部用氟的方法很多，但使用含氟凝膠后，可在牙齒表面形成一層半透明的薄膜，持續(xù)緩慢釋放氟離子，同時(shí)此薄膜具有一定的粘接性，很難從牙齒表面去除[11]，不易脫落，并且由醫(yī)生操作，不用擔(dān)心因患者使用劑量的不合適而造成的中毒反應(yīng)。Magalh?es的研究[12]指出，多樂氟是一個(gè)酸性的凝膠，這一產(chǎn)品已經(jīng)作為美國FDA的治療和預(yù)防齲病的一個(gè)金標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)所研制的氟化鈉殼聚糖凝膠，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用于治療早期齲的效果優(yōu)于多樂氟，而且殼聚糖水凝膠的生物相容性良好，配置的原料易獲得，價(jià)格相對(duì)較便宜，這為氟化鈉殼聚糖凝膠成為治療早期齲的有效藥物提供了良好的基礎(chǔ)。

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Aninvitrostudyofre-mineralizationofenamelwithearlycariesinprimaryteethtreatedbyNaF-chitosangel

ZHOUHongyan1,ZANGRuijue2,WANGJue1,LIUQian1,ZHANGXiaomin1,CAOLing1,MEIYufeng1.

1. 210029,DepartmentofPediatricDentistry,NanjingStomatologicalHospital,JiangsuKeyLaboratoryofOralDiseases,NanjingMedicalUniversity,China; 2.DepartmentofPediatricDentistry,AffiliatedHospitalofStomatology,NanjingMedicalUniversity

Objective: To estimate the remineralization of enamel of primary teeth with early caries protreated by NaF-chitosan gel.MethodsEarly stage caries was created on anterior primary teeth. The samples were divided into 4 groups randomly(n=6), and treated by NaF-chitosan gel, chitosan gel, duraphat and non-treatment(the control) respectively. Then all samples were underwent a 7 days pH cycle. Then samples were tested with SEM and EDS. Data were analyzed with SPSS 19.ResultsThe SEM data showed that chitosan gel protected the enamel surface from being ruined by erosion. NaF-chitosan gel group showed more mineral crystal formation on the enamel surface. The NaF-chitosan gel group showed more Ca remineralized on the enamel surface.ConclusionNaF-chitosan gel can increase the remineraliztion of on the anterior primary teeth with early stage caries.

Chitosangel;NaF;Primaryteeth;Remineralization

江蘇省衛(wèi)生計(jì)生委預(yù)防醫(yī)學(xué)科研課題(編號(hào)： Y2015051)； 江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程資助(編號(hào)： PPZY2015B163)

210029， 南京醫(yī)科大學(xué)口腔疾病研究江蘇省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南京醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院兒童口腔科預(yù)防口腔科(周紅艷 王玨 劉茜 張曉旻 曹靈 梅予鋒)； 南京市口腔醫(yī)院兒童口腔科(臧睿覺)

梅予鋒 025-85031837 E-mail： yfmei@njmu.edu.cn

R780.1

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.04.026

(收稿： 2016-12-12 修回： 2017-06-02)