柴繼俠 申德祥 梁曉婉 周青 張志誠(chéng) 康建華 褚憶憶 柴強(qiáng)

三維重建觀察四氯二苯并二惡英對(duì)胎鼠腭器官發(fā)育的影響

柴繼俠 申德祥 梁曉婉 周青 張志誠(chéng) 康建華 褚憶憶 柴強(qiáng)

目的三維重建觀察四氯二苯并二惡英(tetrachlorodibenzo-p-dioxin, TCDD)對(duì)胎鼠腭器官發(fā)育的影響。方法對(duì)妊娠12.5 d昆明鼠進(jìn)行40 μg/kg TCDD灌胃處理作為實(shí)驗(yàn)組，等劑量的玉米油處理作為對(duì)照組。妊娠13.5、14.5、 15.5 d 時(shí)，取出胎鼠頭部固定，制備腭器官石蠟連續(xù)切片， 蘇木精-伊紅染色，采集腭器官的圖像用Photoshop處理、3D-DOCTOR軟件對(duì)腭器官進(jìn)行三維重建。結(jié)果3D-DOCTOR三維重建顯示，對(duì)照組腭器官?gòu)纳鄡蓚?cè)移至舌上方，逐漸靠攏并融合；實(shí)驗(yàn)組腭器官?gòu)纳鄡蓚?cè)延遲于對(duì)照組移至舌上方漸靠攏，但并未融合，形成腭裂。結(jié)論3D-DOCTOR重建可觀察腭器官發(fā)育過(guò)程和TCDD作用于孕鼠導(dǎo)致胎鼠腭裂形成過(guò)程。

四氯二苯并二惡英(TCDD)； 腭器官； 三維重建； 側(cè)腭突； 發(fā)育

四氯二苯并二惡英(tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)是一類(lèi)持久性環(huán)境有機(jī)污染物，對(duì)人類(lèi)健康和環(huán)境安全構(gòu)成極大威脅，可來(lái)源于汽車(chē)尾氣、垃圾焚燒、農(nóng)藥等[1]。研究表明，TCDD可致多種人類(lèi)發(fā)育缺陷發(fā)生，其中包括腭裂畸形[2]。小鼠的腭器官發(fā)育與腭裂形成與人類(lèi)相似，通過(guò)解剖鏡、光鏡和電鏡等研究方法表明 TCDD與腭裂畸形發(fā)生密切相關(guān)[3-6]。

宏觀生物組織的三維重建通過(guò)高分辨率CT和磁共振儀器等在臨床工作中已廣泛使用，但對(duì)生物組織顯微結(jié)構(gòu)的組織重建仍未普及[7]。由于顯微鏡下的一個(gè)視野中只能顯示標(biāo)本的局部。即便如此，利用連續(xù)的組織切片仍然可以進(jìn)行組織器官的三維重建[7-9]。

本文通過(guò)Photoshop和3D-DOCTOR軟件三維重建觀察TCDD對(duì)胎鼠腭器官發(fā)育的影響，為腭器官的發(fā)育和腭裂形成提供可視化模型，為建立腭器官發(fā)育和腭裂形成的數(shù)字化模型打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本與分組

成年昆明系小鼠15 只雌鼠， 5 只雄鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)2 周后小鼠合籠，雌雄比例為3∶1，自由進(jìn)食和飲水。每12 h觀察合籠的雌鼠，如發(fā)現(xiàn)陰栓者記為妊娠0.5 d，稱(chēng)重后單獨(dú)飼養(yǎng)。 12 d后小鼠體重若增加2 g以上，且腹部可以看到明顯隆起，則認(rèn)為妊娠。將妊娠鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。在妊娠12.5 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組小鼠一次性給予40 μg/kg TCDD灌胃處理，對(duì)照組給予等劑量的玉米油。在妊娠13.5、 14.5、 15.5 d時(shí)，取出胎鼠(分別記為ED13.5、 ED14.5、ED15.5)，留取胎鼠頭部于4%多聚甲醛溶液中固定，48 h后脫水和石蠟包埋。

1.2 連續(xù)切片HE染色

將各組蠟塊進(jìn)行連續(xù)切片，厚度為7 μm。將含有腭器官側(cè)腭突的蠟片依次貼附在APES防脫處理的載玻片上。按照蠟片的序號(hào)如1、3號(hào)蠟片貼在A-1號(hào)載玻片上，2、4號(hào)蠟片貼在B-1號(hào)載玻片上，1 個(gè)標(biāo)本制成2 套相近的玻片。將腭器官的連續(xù)切片進(jìn)行HE染色。先染A套片，如果A套片里染色不好或者碎裂的話(huà)，取B套對(duì)應(yīng)的片號(hào)重新染色。

1.3 圖像采集和拼接

將每組HE染色的玻片按照順序，在本校顯微形態(tài)綜合實(shí)驗(yàn)室中的MOTIC數(shù)碼互動(dòng)實(shí)驗(yàn)室的教師機(jī)上拍攝圖像，放大40 倍，一張圖片拍不下全部組織結(jié)構(gòu)的話(huà)，就分上下2 次拍攝，并依次進(jìn)行命名，保存格式為JPEG。利用Photoshop軟件，將同一個(gè)標(biāo)本的2 張圖像拷貝到畫(huà)布中，參照劉宏建等[7]的方法進(jìn)行圖像的拼接，拼接完成后保存圖片。

1.4 圖像配準(zhǔn)

由于組織切片在貼片時(shí)，不可能保證前后貼片的位置完全一致，因此必須進(jìn)行圖像配準(zhǔn)。打開(kāi)Photoshop軟件，建立高2 000 bp寬2 000 bp大小的畫(huà)布，將圖像以小鼠鼻中隔中線(xiàn)為垂直線(xiàn)旋轉(zhuǎn)；確定某組織固定點(diǎn)在坐標(biāo)固定位置上，將連續(xù)切片的圖像，采用內(nèi)定位法[7]即圖層配準(zhǔn)法[9]，進(jìn)行圖像配準(zhǔn)；將配準(zhǔn)后的圖片以JPEG和PSD格式保存。

1.5 三維重建

使用3D-DOCTOR軟件對(duì)配準(zhǔn)后的圖像進(jìn)行三維重建。打開(kāi)3D-DOCTOR軟件，點(diǎn)擊創(chuàng)建New Stack，添加文件，選取配準(zhǔn)后圖像的文件夾，選中一個(gè)標(biāo)本所有的配準(zhǔn)后的圖像文件，打開(kāi)后則添加至操作界面。選擇Object Management，給所需勾選的組織結(jié)構(gòu)命名以及選取相應(yīng)的顏色。點(diǎn)擊Boundary Editor進(jìn)行組織結(jié)構(gòu)的邊界勾選，完成所有圖像選定結(jié)構(gòu)的邊界勾選。選擇工具欄中的3D合成中表面合成選項(xiàng)，即可獲得三維重建的可視化模型。

2 結(jié) 果

小鼠腭器官發(fā)育和TCDD對(duì)腭器官發(fā)育影響的HE圖像見(jiàn)圖 1，其三維重建圖像見(jiàn)圖 2～3。 HE圖像和三維重建圖像均顯示：對(duì)照組小鼠腭器官的側(cè)腭突在ED13.5時(shí)，位于舌的兩側(cè)；ED14.5時(shí)兩側(cè)的側(cè)腭突上抬到舌的上方，對(duì)向生長(zhǎng)，漸接觸；ED15.5時(shí)兩側(cè)的側(cè)腭突接觸融合。TCDD實(shí)驗(yàn)組的側(cè)腭突在ED13.5時(shí)位于舌的兩側(cè)；ED14.5時(shí)仍位于舌兩側(cè)，但體積增大；ED15.5時(shí)兩側(cè)的側(cè)腭突上抬到舌的上方，體積較大，但沒(méi)有接觸融合。

3 討 論

3.1 腭器官發(fā)育和TCDD對(duì)腭器官發(fā)育的影響

腭器官的形成和發(fā)育是一個(gè)連續(xù)而復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。腭器官由前腭突和側(cè)腭突2部分組成。本文研究的主要是胚胎時(shí)期腭器官中側(cè)腭突的發(fā)育過(guò)程，HE染色和三維重建均顯示，側(cè)腭突的發(fā)育過(guò)程和尹海燕等[10]研究結(jié)果相似：胚胎早期，舌幾乎完全充滿(mǎn)原始口鼻腔，所以側(cè)腭突沿著舌的兩側(cè)向下垂直生長(zhǎng)。隨著胚胎繼續(xù)發(fā)育，舌的形態(tài)逐漸變得扁平，位置開(kāi)始下降，同時(shí)，2 個(gè)側(cè)腭突上抬，位于舌的上方并水平生長(zhǎng)。最終兩側(cè)腭突相互接觸融合，繼續(xù)發(fā)育至成熟。

唇腭裂作為嚴(yán)重的出生缺陷，是常見(jiàn)的先天性畸形之一，患病率為0.1%[11]，為兒童頭面部的首發(fā)先天性畸形，是環(huán)境和遺傳因素相互作用所致的多基因遺傳病，其病因仍未完全明確[6]。環(huán)境污染物TCDD在眾多致畸因素中，與腭裂發(fā)生之間的關(guān)系越來(lái)越受到關(guān)注[3-6，12]，主要從不同動(dòng)物、不同劑量、不同作用時(shí)間的腭器官發(fā)育的解剖鏡、光鏡和電鏡等來(lái)研究。本文則主要根據(jù)小鼠腭器官HE的光鏡圖像進(jìn)行腭器官發(fā)育的三維重建研究，結(jié)果顯示TCDD可影響腭器官發(fā)育，主要是通過(guò)影響側(cè)腭突的生長(zhǎng)和上抬，導(dǎo)致側(cè)腭突體積較小、上抬延遲，最終兩側(cè)腭突不能在中線(xiàn)接觸融合，成功地建立了TCDD對(duì)腭器官發(fā)育影響的三維可視化模型。

3.2 三維重建及遇到的問(wèn)題

圖 1 2 組腭器官發(fā)育過(guò)程的HE圖片 (×4)

Fig 1 HE stain pictures of palatal organ development process in 2 groups (×4)

在該研究實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中，遇到的一些問(wèn)題和需要完善的地方總結(jié)如下：①判斷妊娠：觀察合籠雌鼠的陰栓時(shí)，應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格按照12 h的間隔，否則陰栓會(huì)溶解造成漏檢；對(duì)于不明顯的小陰栓或者陰道內(nèi)有明顯的液狀分泌物時(shí)，可列為疑似妊娠；在列為妊娠或疑似妊娠的同時(shí)要給小鼠稱(chēng)重，12 d后再次稱(chēng)重，此時(shí)體重至少要超過(guò)2 g，并且同時(shí)觀察小鼠的腹部要明顯隆起。②外定位的嘗試：曾嘗試用頭發(fā)、細(xì)棉線(xiàn)、小鼠肌肉等，但效果均不佳。頭發(fā)進(jìn)行外定位，包埋時(shí)頭發(fā)很容易漂移，3 根頭發(fā)很難同時(shí)平行于小鼠頭部外側(cè)，貼片和染色時(shí)，頭發(fā)也很容易丟失。細(xì)棉線(xiàn)進(jìn)行外定位，連續(xù)切片時(shí)，細(xì)棉線(xiàn)不易被切斷，且易刮傷組織。小鼠的腓腸肌定位，貼片和染色時(shí)易脫落。由于時(shí)間和操作技能的原因，本實(shí)驗(yàn)只采用了內(nèi)定位方法。③完整的連續(xù)切片：三維重建對(duì)組織切片的連續(xù)性、完整性要求較高。連續(xù)切片時(shí)，容易出現(xiàn)組織碎裂、重疊、標(biāo)本偏斜等，分析原因，調(diào)整脫水時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)技能等，盡可能切出完整的連續(xù)切片。連續(xù)切片光鏡圖像的數(shù)量與質(zhì)量直接影響三維重建效果。④軟件的處理：在Photoshop和3D-DOCTOR軟件處理時(shí)，尤其是圖像配準(zhǔn)和組織的邊界勾畫(huà)時(shí)，一定要仔細(xì)、認(rèn)真、準(zhǔn)確，盡可能地減少誤差。此外熟練掌握和靈活應(yīng)用這兩種軟件也可以提高三維重建的效果。

要想有更準(zhǔn)確更完美的腭器官發(fā)育和TCDD對(duì)腭器官發(fā)育影響的三維重建的可視化模型和準(zhǔn)確的數(shù)字化模型還需繼續(xù)提高各項(xiàng)技能，重建出小鼠準(zhǔn)確的腭器官發(fā)育和TCDD對(duì)腭器官發(fā)育影響的數(shù)字化模型，為腭器官的發(fā)育和腭裂形成的機(jī)制研究提供更準(zhǔn)確、更直觀的參考數(shù)據(jù)。

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3-Dreconstructionoftetrachlorodibenzo-p-dioxineffectedpalatalorgandevelopmentmodeloffetalmouse

CHAIJixia1,SHENDexiang2,LIANGXiaowan2,ZHOUQing2,ZHANGZhicheng2,KANGJianhua2,CHUYiyi2,CHAIQiang3.

1. 233030,DepartmentofHistologyandEmbryology,BengbuMedicalCollege,China; 2.DepartmentofPsychologicMedicine,BengbuMedicalCollege; 3.DepartmentofStomatology,TheFourthAffiliatedHospitalofZhejiangUniversityMedicalCollege,Yiwu,

Objective: To study the feasibility of 3-D reconstruction model in the observation of tetrachlorodibenzo-p-dioxin(TCDD) effected palatal organ development of fetal mouse.MethodsKunming mice treated 40 ug/kg TCDD by lavage on day 12.5 of pregnancy were used as in the experimental group, isodose corn oil treated in the control group. On day 13.5, 14.5 and 15.5 of pregnancy heads of the fetal mice were taken out and fixed. Conventional paraffin serial sections of palatal organ were preparated and dyed by hematoxylin-eosin, images of the palatal organs were collected and photoshop treated, 3-D reconstruction of the palatal organ was performed by 3D-DOCTOR software.Results3-D reconstruction images showed that palatal organs moved from on both sides above the tongue and gradually closed and merged in the control group. In the experimental group, the palatal organs moved from on both sides above the tongue was later than control group, gradually closed, but not merged, formed cleft palate.Conclusion3D-DOCTOR software reconstruction can be used for the study of the development process effected by TCDD in the pregnant mouse.

Tetrachlorodibenzo-p-dioxin(TCDD);Thepalatalorgan;Three-dimensionalreconstruction;Lateralpalatalprocess;Development

安徽省大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(編號(hào)：AH201410367025)； 安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(編號(hào)： KJ2014A166)

233030， 蚌埠醫(yī)學(xué)院組胚教研室(柴繼俠)， 蚌埠醫(yī)學(xué)院精神醫(yī)學(xué)系(申德祥 梁曉婉 周青 張志誠(chéng) 康建華 褚憶憶)； 浙江大學(xué)第四附屬醫(yī)院口腔科(柴強(qiáng))

柴繼俠 E-mail： chaichai123456@163.com

Q954.48, R321.5

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.04.006

(收稿： 2016-11-18 修回： 2017-02-14)