王金成, 井明博, 陳 拓, 楊蕊琪, 王國鋒, 周天林

(1.甘肅省高校隴東生物資源保護與利用省級重點實驗室, 甘肅 慶陽 745000;2.隴東學院 生命科學與技術學院, 甘肅 慶陽 745000; 3.甘肅省極端環(huán)境微生物資源與工程重點實驗室中國科學院 西北生態(tài)環(huán)境資源研究院, 甘肅 蘭州 730000; 4.陜西師范大學 生命科學學院, 陜西 西安 710062)

試驗研究

隴東黃土高原油污土壤環(huán)境因子對場地生態(tài)修復的季節(jié)響應

王金成1,2,3, 井明博1,2, 陳 拓3, 楊蕊琪3, 王國鋒4, 周天林1,2

(1.甘肅省高校隴東生物資源保護與利用省級重點實驗室, 甘肅 慶陽 745000;2.隴東學院 生命科學與技術學院, 甘肅 慶陽 745000; 3.甘肅省極端環(huán)境微生物資源與工程重點實驗室中國科學院 西北生態(tài)環(huán)境資源研究院, 甘肅 蘭州 730000; 4.陜西師范大學 生命科學學院, 陜西 西安 710062)

[目的] 探討隴東黃土高原地區(qū)油污土壤場地修復過程中土壤環(huán)境因子對季節(jié)變化的響應機制，為油污土壤植物微生物聯(lián)合生態(tài)修復的推廣應用提供參考。[方法] 利用隴東適生植物“金盞菊”聯(lián)合土著石油降解菌劑開展為期285 d的場地原位修復試驗，采用常規(guī)方法測定不同季節(jié)土壤理化特性、酶活性和微生物群落特性等環(huán)境指標。[結果] (1) 場地修復過程中土壤TPHs降解率在夏(24.62%±3.96%)秋(29.93%±1.94%)兩季明顯高于春(3.82%±0.91%)冬(9.24%±0.87%)兩季； (2) 季節(jié)變化和強化處理對油污土壤酶活性和理化特性存在顯著交互效應(p<0.05)。土壤pH值、含鹽率和有機質含量在秋季明顯降低(p<0.05)，而土壤速效養(yǎng)分均在夏秋含量最高(p<0.05)； (3) 春季土壤微生物群落Evenness指數(shù)偏低(p<0.05)，夏季Richness指數(shù)明顯增加(p<0.05)，Shannon-Wiener指數(shù)在夏秋兩季明顯高于其他季節(jié)(p<0.05)； (4) NMDS排序結果顯示，夏秋兩季分異于其他季節(jié)主要與土壤微生物群落Richness指數(shù)(r2=0.706 3，p=0.002)和速效磷(r2=0.615 7，p=0.005)有關； (5) 低溫季節(jié)影響土壤TPHs降解率的因素主要是土壤理化特性和土壤酶活性的疊加效應(54%)，而夏秋兩季土壤理化特性、土壤酶活性和土壤微生物特性三者的共同作用可解釋土壤TPHs降解率變異的74%。[結論] 土壤微生物群落Evenness指數(shù)和土壤酶活性偏低是造成春冬兩季土壤TPHs降解率偏低，而土壤微生物群落Shannon-Wiener指數(shù)、Richness指數(shù)、速效磷含量和生物強化處理有效化水平是隴東地區(qū)夏秋兩季土壤TPHs降解率明顯增加的主要環(huán)境因素。

隴東黃土高原; 油污土壤; 環(huán)境因子; 季節(jié)響應; 原位修復

土壤石油烴污染是世界性環(huán)境問題之一，如何經(jīng)濟有效且環(huán)境友好的實現(xiàn)其生態(tài)恢復即是當今環(huán)保領域研究熱點，亦為土壤修復領域的難點[1]。相比物理和化學修復，生物修復是一種成本低、生態(tài)可承受的修復技術。但在實際場地修復中土壤微生物和植物發(fā)揮活性的條件相對苛刻，易受多種環(huán)境因子的影響[2]，其中包括季節(jié)因素影響下的土壤非生物學及生物學特性[3]。

有“西部大慶”之稱的隴東黃土高原地區(qū)生態(tài)脆弱，干旱少雨，晝夜及寒暑溫差極大，因此在隴東黃土高原地區(qū)開展油污土壤的生態(tài)修復所需周期相對較長且易受季節(jié)因素的制約[4]，而該地區(qū)不同季節(jié)影響下土壤環(huán)境因子對生態(tài)修復的響應機制尚不明確，極大地限制了對隴東地區(qū)生態(tài)修復機制的理解，進而影響了修復效果。

為此，本研究擬采取隴東地區(qū)土著石油降解菌劑聯(lián)合當?shù)剡m生植物金盞菊的修復方式，在甘肅省慶陽市馬嶺鎮(zhèn)長慶油田采油二廠“隴東油泥處理站”開展為期285 d的原位修復試驗，分析不同處理方式下油污土樣酶活性和理化性質等14項土壤生物學和非生物學環(huán)境因子在不同季節(jié)的變化；基于Bray-Curtis相異指數(shù)，將所測定的土壤環(huán)境因子擬合到油污樣地在4個季節(jié)的非度量多維尺度(NMDS)排序圖上，旨在揭示隴東地區(qū)場地原位修復過程中土壤環(huán)境因子對季節(jié)變化的響應機制，以期通過分析環(huán)境因子的季節(jié)響應，優(yōu)化場地修復降解條件、加速生物降解速率，為隴東地區(qū)油污土壤植物微生物聯(lián)合生態(tài)修復的推廣應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試樣地的選擇

原位修復樣地位于甘肅省慶陽市馬嶺鎮(zhèn)長慶油田采油二廠“隴東油泥處理站”(東經(jīng)107°22′19″，北緯36°36′15″)。束沿深度45 cm，土層厚度為0—25 cm，土樣濕容重為1.776%±0.36 g/cm3，自然含水量8.59%±0.27%，pH值8.82%±0.32；供試油污土樣的初始含油量為3.84%(密度0.902 g/cm3，飽和烴含量51.24%，芳烴含量20.43%，膠質和瀝青質含量10.13%，其他組分占18.20%)。

1.2 供試植物及菌劑的分離和篩選

本研究所采用的供試植物為金盞菊(Calendulaofficinalis)，為隴東地區(qū)常見適生植物，具有耐旱、耐寒等特性，品種為德國梆梆。供試菌劑源自甘肅省高校隴東生物資源保護與利用省級重點實驗室通過選擇性培養(yǎng)基和富集培養(yǎng)基自主篩選構建的石油降解菌劑(一級種)[4]。初步鑒定為:假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、微球菌屬(Micrococcus)、線菌屬(Actinomayces)、紅球菌屬(Rhodococcus)和鹽單胞菌屬(Natronococcus)。

1.3 試驗場地設置及原位修復試驗

試驗場地分空白區(qū)和試驗區(qū)，束沿成正方形(3 m×3 m)，空白區(qū)未做任何處理(CK)，試驗區(qū)為金盞菊與微生物菌劑修復區(qū)(JZJ)，試驗區(qū)設3個重復。通過計算將擴大培養(yǎng)的菌液按3%比例接入已翻耕均勻的試驗區(qū)[2]，由陜西西安環(huán)發(fā)環(huán)保工程有限公司負責二、三級菌種發(fā)酵和場地修復區(qū)維護。

自然降雨提供水分(圖1數(shù)據(jù)資料由甘肅省慶陽市氣象局提供)。試驗開始于2015年3月14日，結束于2016年1月25日，試驗周期為285 d，于2015年3月14日投加菌劑，一周后種植供試植物幼苗。本研究根據(jù)隴東黃土高原地區(qū)季節(jié)變化規(guī)律(圖1)將每年3—5月劃分為春季、6—8月為夏季、9—11月為秋季、12月至來年2月為冬季，為了體現(xiàn)該區(qū)季節(jié)特性分別在2015年4月24日，7月5日，10月10日和2016年1月25日用四分法取樣，除利用鮮土提取土壤微生物細菌基因組總DNA外，其余土樣在室溫背陰處風干，過2 mm篩備用。

圖1 場地修復過程中平均氣溫與降水量的季節(jié)變化趨勢

1.4土壤理化性質測定

過氧化氫酶采用高錳酸鉀滴定法，脲酶和多酚氧化酶采用7230 G分光光度計比色法[5]；脫氫酶和含鹽率采用唐景春的分析方法[6]。土壤堿解氮采用堿解擴散法；土壤速效磷、速效鉀分別采用0.5 mol/L NaHCO3浸提—鉬銻抗比色法和火焰光度計法[7]；電位法(pHS-3酸度計)測定土樣pH值；采用超聲—索氏萃取—重量法測定土壤總石油烴含量(total petroleum hydrocarbons，TPHs)[2]；采用變性凝膠梯度電泳(DGGE)技術分析微生物群落多樣性[2]。

1.5 數(shù)據(jù)處理與計算

利用SPSS 16.0和R2.15.2(http:∥www.r-project.org/)對數(shù)據(jù)進行處理分析，用Origin 8.0和R 2.15.2作圖。為了闡述植物—微生物強化修復在不同季節(jié)影響下土壤環(huán)境因子間關系，基于Bray-Curtis相異指數(shù)，使用R語言“vegan”程序包中“envfit”程序，將所測定的14項土壤環(huán)境因子擬合到供試油污樣地在4個季節(jié)的非度量多維尺度(NMDS)排序圖上，為防止樣點在各象限的分布發(fā)生移位，在擬合時對NMDS的排序軸進行了旋轉，以確保NMDS第一軸能夠最大程度地代表群落相異性的變異。供試油污樣地矩陣及環(huán)境因子數(shù)據(jù)集分別用Bray-Curtis與Euclidean距離表示[8]。方差分解運用“Vegan”數(shù)據(jù)包里的“Varpart”功能對供試油污樣地中14個環(huán)境因子進行分析，所有數(shù)據(jù)均經(jīng)過Hellinger轉換，用Venn圖表示土壤理化特性、酶活性及土壤微生物群落特性對土壤TPHs降解率的純效應以及共同效應，圖中的數(shù)字代表上述環(huán)境變量對供試油污樣地土壤TPHs降解率的解釋信息量[9]。

2 結果與分析

2.1 場地修復過程中土壤TPHs降解率季節(jié)性變化

圖2為場地修復過程中土壤TPHs降解率的四季變化情況。由圖2可見，夏(24.62%±3.96%)秋(29.93%±1.94%)兩季土壤TPHs降解率明顯高于春(3.82%±0.91%)冬(9.24%±0.87%)兩季(p<0.05)；就整個修復期而言，季節(jié)變化對CK組油污土壤TPHs降解率產(chǎn)生顯著影響(p<0.05)，但其累計TPHs降解率僅為4.77%±0.76%，而金盞菊與微生物菌劑修復(JZJ)組為67.24%±4.47%。上述結果說明隴東地區(qū)利用金盞菊進行場地修復夏秋兩季為土壤TPHs生物降解的主要季節(jié)，累計降解率占總石油烴去除率的81.17%±0.37%。

2.2場地修復過程中油污土壤酶活性及理化性質的季節(jié)性變化

本研究中不同季節(jié)對油污土壤脫氫酶、多酚氧化酶、過氧化氫酶和脲酶活性的影響差異顯著(p<0.01，表1)。處理和季節(jié)對上述酶活性的影響也存在顯著的交互效應。從酶活性的變化看，JZJ處理組4種供試土壤酶活性均在秋季最高(p<0.05)，但土壤多酚氧化酶、過氧化氫酶和脲酶活性在夏秋兩季間無顯著差異。多重比較結果顯示(Duncan，α=0.05)，就JZJ處理組而言，除土壤脫氫酶，其余3種酶活性在冬季高于春季(p<0.05)，說明隴東地區(qū)油污土壤酶活性變化趨勢與適生植物金盞菊的生長密切相關，究其原因為季節(jié)變化驅動植物生長過程中有效增加了土壤根際微環(huán)境土壤養(yǎng)分有效化水平和植物微生物間共代謝水平，因而在夏秋兩季表現(xiàn)出較高的土壤酶活性且兩季間無顯著性差異。

注：JZJ表示金盞菊與微生物菌劑處理；不同小寫字母表示不同處理間差異顯著。下同。

圖2 場地過程中土壤TPHs降解率的季節(jié)性變化

注：*平均值±標準誤。每組同列不同字母表示多重比較差異顯著(Duncan，α=0.05)。下同。

就土壤理化特性而言，雙因素方差分析結果顯示處理和季節(jié)對油污土樣理化性質亦存在明顯交互影響。從季節(jié)變化情況看，土壤pH值、含鹽率和有機質含量在秋季明顯降低(p<0.05)，但與冬季卻無顯著差異，這可能與年度修復累計效應有關(表2)；從速效養(yǎng)分含量來看，土壤速效鉀、堿解氮和速效磷含量均在夏秋含量最高(p<0.05)。上述結果說明利用金盞菊在隴東地區(qū)進行測定修復后油污土壤理化性質和酶活性響應模式呈季節(jié)性差異，而夏秋兩季土壤速效養(yǎng)分含量較高可能由于夏秋兩季土壤微生物群落多樣性的增加有效增加了土壤脲酶和多酚氧化酶活性，從而有利于土壤速效養(yǎng)分的有效化水平。

表2 場地修復過程中油污土壤理化性質的季節(jié)變化

2.3聯(lián)合修復過程中各處理間油污土壤微生物群落多樣性季節(jié)變化

圖3為場地修復過程中油污土壤微生物群落多樣性隨季節(jié)變化的PCR-DGGE指紋圖譜，通過Quantity One 4.6.2軟件對圖譜條帶信息分析計算土壤微生物群落Richness豐富度指數(shù)、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)、Margalef豐富度指數(shù)和Evenness均勻度指數(shù)；采用UPGAMA方法對電泳圖譜進行聚類分析，以明確土壤微生物群落對不同季節(jié)的響應情況。圖譜上條帶信息反映了土壤微生物群落多樣性變化情況，其中電泳條帶的多少反映出土壤中細菌群落多樣性；條帶的粗細則反映了種群密度的差異，條帶亮度表征種群分布頻率高低。UPGAMA聚類分析結果顯示，24條PCR-DGGE指紋圖譜可劃分為3個類群，其中類群1主要為金盞菊和微生物菌劑強化處理組，但未包括冬季處理組；而類群2若在63%～78%相似水平截取，則主要包括的是春冬兩季的對照組；若在52%～72%相似水平截取，夏季(SU CK1-2)與秋季(FA CK1-3)處理組出現(xiàn)明顯交錯現(xiàn)象(圖3)。F檢驗結果顯示，4種多樣性指數(shù)在四季變化明顯，上述結果體現(xiàn)了采用金盞菊實施場地修復可對隴東地區(qū)油污土壤微生物群落結構和組成產(chǎn)生影響的同時又季節(jié)變化做出了不同響應(圖4)。

圖3 場地修復過程中四季間土壤微生物群落的PCR-DGGE指紋圖譜及其圖譜聚類

圖4 場地修復過程中四季間油污土壤樣品微生物群落多樣性指數(shù)變化

由圖4可見春季JZJ處理組根際微生物群落Evenness均勻度指數(shù)偏低可能是由于春季供試植物生長引起的土壤有效氮匱乏進而造成土壤微生物分布不均；而夏季金盞菊迎來生長旺期的同時土壤微生物群落隨之做出響應，Richness豐富度指數(shù)與春季相比明顯增加；從Shannon-Wiener多樣性指數(shù)來看，JZJ處理組在夏秋季土壤微生物群落多樣性顯著高于其他季節(jié)，且根際微生物群落均勻度指數(shù)從春季的0.71±0.011上升至0.97±0.008，說明土壤微生物群落結構和組成開始趨于穩(wěn)定，分布相對均勻。

2.4場地修復過程中油污土壤環(huán)境因子的非度量多維尺度(NMDS)排序季節(jié)性變化

縱觀土壤酶活性、理化性質及微生物群落遺傳多樣性的試驗結果，對于季節(jié)差異極大的隴東地區(qū)采用金盞菊開展場地修復可有效改善油污土壤生物學及非生物學特性，有助于土壤TPHs生物降解，但金盞菊處理組在不同季節(jié)亦表現(xiàn)出不同的響應模式。為了明確不同季節(jié)影響下土壤環(huán)境因子間有何內(nèi)在聯(lián)系，以及環(huán)境因子在驅動其分異過程中的相對重要性，基于Bray-Curtis相異指數(shù)，將所測定的14項土壤環(huán)境因子擬合到4個季節(jié)的非度量多維尺度(NMDS)排序圖上，由脅強系數(shù)(Stress=0.097 6)可見該NMDS分析結果可解釋四季更替時環(huán)境變量90.24%的信息量(圖5)。

注：僅有95%置信水平與季節(jié)分異顯著相關的環(huán)境變量擬合在NMDS排序圖上，其中A為含鹽率；B為TPH；C為Shannon-Wiener指數(shù)；D為Evenness指數(shù)；E為多酚氧化酶；F為速效磷；G為Richness指數(shù)。

圖5場地修復過程中土壤環(huán)境因子的非度量多維尺度(NMDS)排序季節(jié)性變化

由圖5可見，夏秋和春冬兩季分別在NMDS排序圖上相對集中，且兩者與CK間分異明顯，說明金盞菊聯(lián)合修復對隴東地區(qū)季節(jié)變化呈不同的響應模式。為了闡明何種環(huán)境變量與該分異模式有關，將14個環(huán)境因子變量擬合至NMDS排序圖的結果顯示，其中有7個環(huán)境變量與NMDS排序結果顯著相關(p<0.05)。由圖5可見，與夏秋兩季在NMDS排序圖上的分異與土壤微生物群落Richness豐富度指數(shù)(r2=0.706 3，p=0.002)，速效磷(r2=0.615 7，p=0.005)，Shannon-Wiener指數(shù)(r2=0.538 0，p=0.013)，Evenness均勻度(r2=0.508 6，p=0.015 0)和多酚氧化酶活性(r2=0.501 2，p=0.019 0)有關，這一結果說明導致夏秋兩季明顯分異于春冬和CK的主要環(huán)境因素為土壤微生物群落，說明隴東地區(qū)夏秋季節(jié)較高土壤溫度和相對充裕的降雨量可加速土壤微生物數(shù)量及多樣性的增加，進而提高土壤有機碳的礦化速率和植物根際土壤微環(huán)境共代謝水平，有效提升了土壤養(yǎng)分有效循環(huán)。而圖4中與CK組分異有關的土壤環(huán)境變量為土壤含鹽率(r2=0.403 7，p=0.029)和TPHs(r2=0.398 4，p=0.037)，說明土壤含鹽率和TPHs居高不下是導致CK組在NMDS排序圖上分異與其他處理的最主要的環(huán)境因子。

2.5油污土壤環(huán)境因子對場地修復過程中季節(jié)響應的方差分解

為了解析夏秋與冬春兩季在NMDS排序圖上的分異結果，以衡量不同季節(jié)場地修復效果的土壤TPHs降解率，利用方差分解揭示場地修復過程中油污土壤環(huán)境因子對夏秋與冬春兩季響應機制。圖6為油污土壤環(huán)境因子對場地修復過程中春冬和夏秋兩季響應模式的方差分解Venn圖，結果顯示，本研究所涉及的14項環(huán)境變量可劃分為3類環(huán)境因子(土壤微生物學特性、土壤酶活性及土壤理化特性)。根據(jù)方差分解殘差(Residuals)可知，3類環(huán)境因子總疊加效應共同解釋了土壤TPHs降解率在春冬和夏秋兩季分異的88%和96%(圖6)。

就春冬低溫季節(jié)而言，3類環(huán)境因子獨立效應分析結果顯示，僅有土壤酶活性與微生物群落分別解釋了4%和3%；從3類環(huán)境因子交互作用來看，影響低溫季節(jié)土壤TPHs降解率的因素主要來自土壤理化特性和土壤酶活性(54%)，而三者的共同作用可解釋土壤TPHs降解率變異的31%(圖6a)，說明低溫季節(jié)土壤養(yǎng)分水平和酶活性的低下是限制土壤TPHs降解率的主要因素(圖2)，但究其原因土壤微生物受低溫限制是導致土壤養(yǎng)分有效化水平低下的主要原因之一。

從夏秋常溫季節(jié)來看，3類環(huán)境因子獨立效應分析結果顯示，土壤理化特性、酶活性與微生物群落分別解釋了9%，13%和24%；從3類環(huán)境因子交互作用來看，影響常溫季節(jié)土壤TPHs降解率的因素主要來自土壤理化特性和土壤酶活性(61%)以及土壤微生物特性和土壤酶活性(43%)，而三者的共同作用可解釋土壤TPHs降解率變異的74%(圖6b)，上述結果說明土壤溫度和含水量是決定隴東地區(qū)場地修復的主要環(huán)境因素，而常溫季節(jié)土壤微生物特性是決定土壤TPHs降解率的決定性因素，因此如何提高隴東地區(qū)油污土壤微生物數(shù)量和多樣性以及與植物根際土壤微環(huán)境共代謝水平是決定隴東地區(qū)油污染場地修復效果的主要環(huán)境因素。

圖6 方差分解土壤理化因子、酶活性和微生物群落分別對不同季節(jié)影響下油污土壤TPHs降解率的純效應和共同效應

3 討 論

3.1場地修復過程中油污土壤非生物學環(huán)境因子的季節(jié)響應機制

植物—微生物聯(lián)合修復體系可有效促進土壤石油烴的快速降解和礦化，因此TPHs降解率高低可反映植物—微生物系統(tǒng)的吸收和代謝能力[10]。焦海華等[10]在2015年分析研究了紫茉莉對石油污染鹽堿土壤石油烴降解的影響，結果顯示與CK 相比，TPHs降解率在春、夏、秋季分別提高了47.6%，28.3%，18.9%；而在2013年焦海華等[12]又研究了牽?；▽κ臀廴钧}堿土壤石油烴降解的影響中發(fā)現(xiàn)與CK相比，土壤中石油烴降解率明顯在春、夏、秋季分別提高了7.5%，34.2%和19.7%。上述結果與本試驗結果基本一致，說明隴東地區(qū)利用金盞菊進行場地修復夏秋兩季為土壤TPHs生物降解的主要季節(jié)，累計降解率占總石油烴去除率的81.17±0.37%，究其原因可能與土壤溫度和降雨量有關，適宜的土壤溫度及含水量可有效催化土壤酶活性和微生物群落正常繁殖[2]，加速土壤養(yǎng)分有效化速率，進而刺激石油降解菌和適生植物的生長，提高土壤TPHs降解率。

本研究利用隴東地區(qū)土著石油降解菌劑聯(lián)合當?shù)剡m生植物金盞菊進行油污土壤生態(tài)修復試驗，所涉及的眾多非生物特性環(huán)境因子中土壤溫度變化是季節(jié)更替的主要體現(xiàn)形式。前人研究指出低溫可導致石油烴黏度增加、固化程度加劇、蒸發(fā)緩慢、擴散能力下降，從而限制石油烴的降解速率[13]。張樹棟等[14]研究了崇明西沙濕地土壤石油類污染物含量隨季節(jié)變化的情況，結果表明該區(qū)土壤TPHs含量呈季節(jié)性變化，且溫度越低，酶活性越低，降解速率越慢。譙興國等[14]研究了凍融作用對石油污染土壤酶活性的影響，結果表明凍融作用可使油污土壤過氧化氫酶和脲酶的活性增強。王華金等[16]利用土著石油降解菌劑開展了油污土壤模擬生物修復試驗，結果表明降解試驗初期土壤過氧化氫酶和脫氫酶活性明顯增加。上述結果與本研究結果基本一致，但本研究中利用金盞菊生態(tài)修復過程中土壤非生物學性質對季節(jié)變化的響應模式不盡相同。①由表1可見，夏秋兩季對油污土壤酶活性起決定性作用，說明隴東地區(qū)春季低溫環(huán)境一定程度上限制了金盞菊的生長。②3.84%初始含油量可造成土壤C/N失衡，導致其幼苗養(yǎng)分失衡和生理脫水，阻礙了金盞菊的生長。③由圖2可見，JZJ組在夏秋兩季TPHs降解率分別達24.62±3.96%和29.93±1.94%，說明金盞菊在夏秋兩季石油烴吸收和轉化速率相對較高，而這種情況在某種程度上也說明本研究所投加土著石油降解菌劑與金盞菊根際分泌物間共代謝水平相對較高[2]，且優(yōu)先利用了易于降解的烷烴類物質[17]，進而加速了土壤TPHs生物降解速率的同時刺激過氧化氫酶活性，有效解除降解過程中過氧化氫的積累的同時也有助于土壤微生物的生長繁殖[13]。④金盞菊在夏秋兩季可顯著影響對4種石油烴降解反應參與酶的活性，說明金盞菊生長度溫度要求相對苛刻，夏秋兩季的累計修復效應可以看出JZJ處理組可大幅提升土壤脲酶、多酚氧化酶和土壤脫氫酶活性，夏秋兩季較高的土壤溫度有利于金盞菊生長的同時擴大了土壤根際微環(huán)境中土著石油降解菌生境從而亦有助于其根際微生物群落生長繁殖，其結果可由圖4微生物群落多樣性指數(shù)變化予以印證。上述土壤酶活性的變化可引起土壤微生物群落結構和組成變化，其中土壤微生物數(shù)量的增加將加大對土壤有機碳和無機鹽的需求程度，進而使得油污土壤有機質和含鹽率在夏秋兩季明顯降低(表2)。

前人研究指出石油烴中多環(huán)芳烴含量與脲酶活性呈負相關與多酚氧化酶呈正相關[16]。由表1可見，JZJ組處理在夏秋兩季脲酶和多酚氧化酶活性最高則有利于土壤速效N，P，K的有效化水平，因此夏秋兩季土壤速效養(yǎng)分含量明顯高于春冬兩季。此外，其活性在夏季提升幅度極大則說明土壤脲酶和多酚氧化酶活性易受土壤溫度限制[15]，且石油降解菌在石油烴降解過程中優(yōu)先利用易于降解的烷烴類物質，而芳烴類物質的降解相對滯后，加之夏季土壤溫度的回升引起了土壤多酚氧化酶活性在夏秋二季的增加，同時也說明金盞菊根際微生物群落結構和組成的改變可有效增加土壤多酚氧化酶活性，加速多環(huán)芳烴的生物降解，在一定程度上消除其對土壤脲酶活性的限制，因此引發(fā)了土壤脲酶活性在修復后期逐漸提升，進而改善了土壤氮素有效循環(huán)，增加了土壤微生物與植物根際分泌物共代謝水平。上述分析結果說明隴東地區(qū)開展石油烴污染的生物降解采用金盞菊聯(lián)合土著石油降解菌劑的修復模式對石油烴中烷烴及芳烴類物質降解具有明顯的針對性和季節(jié)性。

3.2場地修復過程中各處理間油污土壤生物環(huán)境因子的季節(jié)響應機制

微生物種群結構與多樣性都是表征生態(tài)系統(tǒng)群落結構的重要參數(shù)，其對環(huán)境污染物的反應表現(xiàn)為多種形式。TPHs進入土壤后對生態(tài)環(huán)境的影響首先表現(xiàn)為土壤微生物群落結構組成、數(shù)量及多樣性的改變。Frank等[18]利用菌根真菌和鏈霉菌對德國龍訥堡地區(qū)油污土壤進行了年度修復試驗，并利用生物技術分析了油污土壤微生物群落多樣性季節(jié)性變化情況，結果顯示土壤微生物可培養(yǎng)微生物數(shù)量呈季節(jié)性變化趨勢且有效提高了植物修復效果。焦海華等[12]利用磷脂脂肪酸(PLFAs)生物標記法分析野生牽?；ǖ纳L對石油烴污染土壤微生物群落與石油烴降解的影響，結果表明牽?；ㄉL對其根際土壤微生物群落影響顯著，微生物多樣性在春季增加83%、夏季增加140%、秋季增50%；微生物的生物量在春季增加97.6%，夏季增加116.3%，秋季增加60.3%。朱鳴鶴等[19]研究了海三棱藨草對石油污染灘涂根際沉積物中微生物種群特點的影響，結果顯示無論植物是否存在，細菌數(shù)量均在春夏兩季達最高，且呈季節(jié)性微生物種屬差異性。焦海華等研究了紫茉莉對石油污染鹽堿土壤微生物群落的影響中發(fā)現(xiàn)與CK相比，根際土壤微生物PLFAs種類變異率在春、夏、秋季分別為71.4%，69.2%和33.3%；而牽?；ㄉL可使其根際微生物多樣性在春、夏和秋季分別增加了83%，140%和50%[11]。上述結果與本研究結果不盡相同，本研究中春季金盞菊根際微生物群落Evenness均勻度指數(shù)均偏低，除地域性差異外，可能是外援投加石油烴降解菌劑在某種程度改變了原初油污土樣微生物群落結構和組成，加之春季供試植物生長引起的土壤有效氮匱乏進而造成土壤微生物分布不均；上述情況隨著夏季到來則略有緩解，在夏季金盞菊迎來生長旺期的同時土壤微生物群落隨之做出響應，Richness豐富度指數(shù)與春季相比明顯增加(p<0.05)；從Shannon-Wiener多樣性指數(shù)來看，JZJ處理組在夏秋季土壤微生物群落多樣性顯著高于其他季節(jié)(p<0.05)，且根際微生物群落均勻度指數(shù)從春季的0.71±0.011上升至0.97±0.008，說明土壤微生物群落結構和組成開始趨于穩(wěn)定，分布相對均勻(p<0.05)。值得注意的是3種多樣性指數(shù)中，冬季Evenness均勻度和Shannon-Wiener多樣性指數(shù)明顯高于春季，可能與夏秋兩季中土壤微生物群落結構和組成的改變和冬季低溫環(huán)境的脅迫下土壤耐冷石油降解菌的數(shù)量和分布有關[20]。夏秋兩季在NMDS排序圖上的分異與土壤微生物群落Richness豐富度指數(shù)，速效磷，Shannon-Wiener指數(shù)，Evenness均勻度和多酚氧化酶活性有關，說明導致夏秋兩季明顯分異于春冬和CK的主要環(huán)境因素為土壤微生物群落，說明隴東地區(qū)夏秋季節(jié)較高土壤溫度和相對充裕的降雨量可加速土壤微生物數(shù)量及多樣性的增加，進而提高土壤有機碳的礦化速率和植物根際土壤微環(huán)境共代謝水平，有效提升了土壤養(yǎng)分有效循環(huán)，而圖4中與CK組分異有關的土壤環(huán)境變量為土壤含鹽率(r2=0.403 7，p=0.029)和TPHs(r2=0.398 4，p=0.037)，說明土壤含鹽率和TPHs居高不下是導致CK組在NMDS排序圖上分異與其他處理的最主要的環(huán)境因子。

4 結 論

(1) 場地修復過程中土壤TPHs降解率呈季節(jié)性變化，夏秋兩季土壤TPHs降解率明顯高于春冬兩季，且夏秋兩季累計降解率占總石油烴去除率的81.17±0.37%，說明隴東地區(qū)利用金盞菊進行場地修復夏秋兩季為土壤TPHs生物降解的主要季節(jié)。

(2) 不同季節(jié)對油污土壤酶活性和理化特性的影響差異顯著，且處理和季節(jié)對其存在顯著的交互效應；JZJ處理組4種供試土壤酶活性均在秋季最高。土壤pH值、含鹽率和有機質含量在秋季明顯降低，但與冬季卻無顯著差異，而土壤速效養(yǎng)分均在夏秋含量最高。

(3) 春季金盞菊根際微生物群落Evenness均勻度指數(shù)偏低，而夏季Richness豐富度指數(shù)明顯增加；Shannon-Wiener多樣性指數(shù)在夏秋季顯著高于其他季節(jié)。上述結果體現(xiàn)了采用金盞菊實施場地修復可對土壤微生物群落結構產(chǎn)生影響的同時又在不同季節(jié)做出了不同響應，夏秋兩季土壤微生物群落結構和組成趨于穩(wěn)定，數(shù)量增加，分布均勻。

(4) 夏秋和春冬兩季分別在NMDS排序圖上相對集中，且夏秋兩季的集中主要與土壤微生物群落Richness豐富度指數(shù)和速效磷有關；而與CK組分異的有關的土壤環(huán)境變量為土壤含鹽率和TPHs，說明土壤含鹽率和TPHs居高不下是導致CK組在NMDS排序圖上分異與其他處理的最主要的環(huán)境因子。

(5) 影響低溫季節(jié)土壤TPHs降解率的因素主要來自土壤理化特性和土壤酶活性的疊加效應(54%)，而影響常溫季節(jié)土壤TPHs降解率的因素主要來自土壤理化特性和土壤酶活性(61%)以及土壤微生物特性和土壤酶活性(43%)的交互效應，說明土壤溫度和含水量是決定隴東地區(qū)場地修復的主要環(huán)境因素，低溫季節(jié)土壤養(yǎng)分水平和酶活性的低下是限制土壤TPHs降解率的主要因素，而常溫季節(jié)土壤微生物特性是影響土壤TPHs降解率的決定性因素。

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SeasonalResponsesofSoilEnvironmentalFactorstoIn-SituEcologicalRemediationofCrude-OilContaminatedSoilinEasternGansuProvinceofLoessPlateau

WANG Jincheng1,2,3, JING Mingbo1,2, Chen Tuo3,YANG Ruiqi3, WANG Guofeng4, ZHOU Tianlin1,2

(1.UniversityProvincialKeyLaboratoryforProtectionandUtilizationofLongdongBio-resourcesinGansuProvince,Qingyang,Gansu745000,China; 2.CollegeofLifeScienceandTechnology,LongdongUniversity,Qingyang,Gansu745000,China; 3.KeyLaboratoryofExtremeEnvironmentalMicrobialResourcesandEngineeringofGansuProvince,NorthwestinstituteofECO-EnvironmentandResource,ChineseAcademyofSciences,Lanzhou,Gansu730000,China; 4.CollegeofLifeScience,ShaanxiNormalUniversity,Xi’an,Shaanxi710062,China)

[Objective] To explore the mechanism of seasonal responses of soil environmental factors to in-situ ecological remediation of crude-oil contaminated soil in Eastern Gansu Province of the loess plateau, in order to provide reference for the popularization and application of ecological restoration of soil plant microorganisms. [Methods] A combined remediation experiment using the indigenous crude-oil degradation bacteria agent and the native plant (Calendulaofficinalis) as materials had been conducted for in-situ ecological remediation of crude-oil contaminated soil for 285 days. The changes and seasonal responses to the in-situ ecological remediation of soil physicochemical property , enzyme activity and microbial-community property were investigated using conventional methods. [Results] (1) Soil TPHs degradation rate in summer (24.62%±3.96%) and fall (29.93%±1.94%) were higher than those in spring (3.82%±0.91%) and winter (9.24%±0.87%) during the process of in-situ ecological remediation. (2) There were obvious interactions between remediation treatment and seasonal variation with regard to soil physicochemical property and enzyme activity (p<0.05). Soil pH value, salt content and organic content were lower and soil nutrient were higher in fall in comparison with that of other seasons (p<0.05), respectively. (3) Evenness index of soil microbial community was less in spring (p<0.05), and its richness index was higher in summer (p<0.05), as well as the Shannon-Wiener index was higher in summer and fall (p<0.05). (4) Nonmetric multidimensional scaling analysis suggested that the seasonal difference of soil TPHs degradation rate was strongly affected by the richness index (r2=0.706 3，p=0.002) and soil available phosphous (r2=0.615 7，p=0.005). (5) Variation partitioning analysis revealed that the most important combined environmental factor to determine the degradation rate of soil TPHs in cold season (spring and winter) was the interaction between soil physicochemical properties and enzyme activity (54%). However, 74% of the soil TPHs variation in warm season was explained by soil physicochemical property, enzyme activity and soil microbial community property. [Conclusion] The low soil TPHs degradation rates in spring and winter were resulted from the low evenness index of soil microbial community and low soil enzymes activity; while richness index and the Shannon-Wiener index of soil microbial community, soil available P and ecological remediation effectiveness all resulted to the high soil TPHs degradation rate in summer and fall.

EasternGansuProvinceofloessplateau;crude-oilcontaminatedsoil;environmentalfactor;seasonresponse;in-situecologicalremediation

A

1000-288X(2017)05-0001-09

X53, Q938.1+3

文獻參數(shù)： 王金成, 井明博, 陳拓, 等.隴東黃土高原油污土壤環(huán)境因子對場地生態(tài)修復的季節(jié)響應[J].水土保持通報，2017,37(5)：1-9.

10.13961/j.cnki.stbctb.2017.05.001； Wang Jincheng, Jing Mingbo, Chen Tuo, et al. Seasonal responses of soil environmental factors to In-situ ecological remediation of crude-oil contaminated soil in eastern Gansu Province of Loess Plateau[J]. Bulletin of Soil and Water Conservation, 2017,37(5)：1-9.DOI:10.13961/j.cnki.stbctb.2017.05.001

2017-02-20

2017-03-14

科技部國家國際合作專項“青藏高原凍土中原油降解微生物的篩選及耐冷工程菌構建”(2014DFA30330); 甘肅省青年科技基金計劃項目(17JR5RM354)；甘肅省高等學?？蒲许椖?2014B-091)； 隴東學院青年資助項目 (XYZK1605)

王金成(1985—),男(漢族),甘肅省慶陽市人,在讀博士,主要從事土壤持久性有機污染物生態(tài)修復研究工作。E-mail:wensent20002002@163.com。