摘要 選取蘋果輪紋病具有代表性的B. dothidea，成功地設(shè)計(jì)并且合成了B. dothidea實(shí)時(shí)熒光 PCR 引物和探針，建立了B. dothidea的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)體系。結(jié)果表明，利用16S rDNA序列設(shè)計(jì)的特異性探針能夠快速檢測(cè)、鑒定植物病原B. dothidea，具有靈敏度高、不易污染和漏檢的優(yōu)點(diǎn)。

關(guān)鍵詞 蘋果輪紋病菌；檢測(cè)方法；鑒定

中圖分類號(hào) S436.611.1+6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2017）19-0100-02

蘋果輪紋病是一種真菌性病害，病原菌為貝氏葡萄座腔菌梨?；虰otryosphaeria dothidea，可使蘋果果實(shí)腐爛、枝干樹(shù)皮疣突及局部壞死。蘋果輪紋病在我國(guó)發(fā)生范圍廣、危害重，在高溫多雨的地區(qū)發(fā)病尤為嚴(yán)重[1]，常年平均爛果率達(dá)20%～30%，多雨年份可達(dá)40%～50%，病果率非常高。一般在貯藏期發(fā)病，侵染后產(chǎn)生病斑，最后在病斑處形成顏色深淺不一、交替排列的同心輪紋，并在病健交界處有明顯間隔，因而得名輪紋病[2]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料。從南京口岸進(jìn)境旅客攜帶物中截獲的可疑蘋果病果上分離所得菌株，包括炭疽?。–olletotrichum gloe-osporioides）、鏈格孢（Alternaria mali）、間座殼屬（Diaporth-aceae sp.）、擬莖點(diǎn)霉（Phomopsas mali）、可可色二孢（Lasiod-iplodia theobromae）、薔薇盾殼霉（Coniothyrium tirolensis）、奇異根串珠霉（Thielaviopsis paradoxa）、交鏈孢（Alternaria sp.）、美澳褐腐（Monilinia fructicola）、牛眼果腐（Neofabraea spp.），均由江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局植檢所提供。

1.1.2 供試試劑。TIANGEN DP305DNA提取試劑盒。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，洗凈去皮切碎，加水1 000 mL煮沸30 min，紗布過(guò)濾，再加20 g葡萄糖、20 g瓊脂，滅菌水1 000 mL。

1.1.3 供試儀器。實(shí)時(shí)熒光PCR儀ABIPRISM7500FAST PCR儀（ABI公司）和LightCycler1.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)。收集菌體供試菌株菌絲，用植物基因組 DNA提取試劑盒提取DNA。根據(jù)GenBank中蘋果輪紋病菌DNA中的保守序列設(shè)計(jì)1對(duì)寡核苷酸引物和TaqMan探針[3]。參照Wiiiam G 等設(shè)計(jì)16S rDNA通用引物對(duì)：

Bd-beta-FP GGCTCTGGCGTGTAAGTCTG

Bd-beta-RP GGTCCGAGGTGCCATTGTA

TaqMan探針Bd-beta-PFAM-TCTCAGCGTGGGAGAA-CATCAATGA-BHQ

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)供試的炭疽?。–oll-etotrichum gloeosporioides）、鏈格孢（Alternaria mali）、間座殼屬（Diaporthaceae sp.）、擬莖點(diǎn)霉（Phomopsas mali）、可可色二孢（Lasiodiplodia theobromae）、薔薇盾殼霉（Coniothyrium tir-olensis）、奇異根串珠霉（Thielaviopsis paradoxa）、交鏈孢（Alt-ernaria sp.）、美澳褐腐（Monilinia fructicola）、牛眼果腐（Neo-fabraea ）菌株的DNA。

反應(yīng)體系為20 μL，包括2×Premix Ex Taq10 μL、5 μmol/L上下游引物各0.8 μL、5 μmol/L探針0.2 μL、模板DNA 2 μL、50×ROX Reference DyeⅡ0.4 μL、加無(wú)菌水補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃，10 min ；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min，共40個(gè)循環(huán)。

將檢測(cè)樣品在ABIPRISM 7500 FAST上擴(kuò)增，結(jié)束后打開(kāi)分析軟件到找到Ct值，記錄下每個(gè)樣品的Ct值和Ct值分析檢測(cè)結(jié)果。

1.2.3 靈敏度檢測(cè)。將輪紋病菌菌液（B. dothidea）模板DNA逐級(jí)稀釋5倍，濃度分別為20.0、4.0、0.8 ng/L和150、50、10 pg/L（BECKMAN紫外分光光度測(cè)濃度）。退火溫度60 ℃，分別加入實(shí)時(shí)熒光體系中擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性擴(kuò)增

由圖1可知，該探針只對(duì)B. dothidea進(jìn)行了特異性擴(kuò)增，而對(duì)其他菌株沒(méi)有擴(kuò)增[3]。

2.2 靈敏度試驗(yàn)

由圖2可知，實(shí)時(shí)熒光PCR可以擴(kuò)增不同濃度的B.dothidea模板DNA，并且濃度為10 pg/L時(shí)仍有擴(kuò)增。雖然模板濃度與檢出率、特異性有一定的線性關(guān)系，但并非是成正相關(guān)，在模板濃度0.8 ng/L時(shí)擴(kuò)增效率最高。模板濃度太高或太低都會(huì)使RCR反應(yīng)受到干擾，影響擴(kuò)增效率[3]。

通過(guò)已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品蘋果輪紋病（B. dothidea）RT-Realtime定量PCR做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，log（起始濃度）與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，該擴(kuò)增反應(yīng)存在的線性關(guān)系（圖3）。

3 結(jié)論與討論

葡萄座腔菌屬（Botryosphaeria）下面有3個(gè)種，分別為B. dothidea、B. malicola和B. obtusa[4-5]。其中，B. dothidea是主要類群，B. malicola和B. obtusa為偶發(fā)類群[6]。致病性測(cè)定顯示B.obtusa也是蘋果果實(shí)輪紋病的一個(gè)新病原，但是在我國(guó)尚未發(fā)現(xiàn)蘋果黑腐病病菌B. obtusa侵染蘋果造成蘋果輪紋病的報(bào)道。本試驗(yàn)的蘋果輪紋病選取了具有代表性的B. dothidea，成功地設(shè)計(jì)并且合成了B. dothidea實(shí)時(shí)熒光 PCR 引物和探針，建立了B. dothidea的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)體系。試驗(yàn)結(jié)果表明，利用16S rDNA序列設(shè)計(jì)的特異性探針能夠快速檢測(cè)、鑒定植物病原B. dothidea，靈敏度高、不易污染和漏檢[2-3]，可為快速檢測(cè)B. dothidea奠定基礎(chǔ)。

4 參考文獻(xiàn)

[1] 康玲，郝紅梅，楊振英，等.蘋果輪紋病研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009（9）：188-191.

[2] 孫鑫垚.陜西省蘋果輪紋病病原菌鑒定與多樣性研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2010.

[3] 楊秋夏.入境旅客攜帶蘋果傳帶病原菌的風(fēng)險(xiǎn)分析及部分病原菌檢測(cè)技術(shù)研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[4] 肖洲燁，李保華，國(guó)立耘.葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）的有性階段在我國(guó)蘋果主產(chǎn)區(qū)的發(fā)生[J].果樹(shù)學(xué)報(bào)，2013，30（6）：1005-1010.

[5] 趙增鋒，曹克強(qiáng).蘋果輪紋病害流行研究及防控[J].北方園藝，2012（1）：127-129.

[6] 劉保友，王英姿，欒炳輝，等.蘋果輪紋病病原菌孢子田間釋放監(jiān)測(cè)方法研究[J].中國(guó)果樹(shù)，2011（6）：48-50.endprint