張海霞 王迎迎

(哈爾濱市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測中心 黑龍江 哈爾濱 150070)

固相萃取-超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測水產(chǎn)品中漁藥殘留

張海霞 王迎迎

(哈爾濱市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測中心 黑龍江 哈爾濱 150070)

在水產(chǎn)品養(yǎng)殖過程中,由于使用者對(duì)氯霉素、磺胺類、喹諾酮類漁藥及三苯甲烷類染料的毒性和危害認(rèn)識(shí)不足,存在違規(guī)使用的現(xiàn)象.漁藥殘留常見危害為藥物通過較長時(shí)間的蓄積,對(duì)人體產(chǎn)生的慢性毒性作用.人們長期食用這類含漁藥殘留的水產(chǎn)品后,藥物在人體內(nèi)蓄積,達(dá)到一定濃度后,就會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生各種慢性毒性作用,損害肝臟、腎臟、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等.農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告規(guī)定了其限量標(biāo)準(zhǔn),農(nóng)業(yè)部和黑龍江省農(nóng)監(jiān)局每年要對(duì)水產(chǎn)品中這四類漁藥的殘留進(jìn)行四次例行監(jiān)測,以保證水產(chǎn)品的質(zhì)量安全.目前,水產(chǎn)品中漁藥殘留的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、電化學(xué)分析、毛細(xì)管電泳等,使用的前處理方法主要有液液萃取法、固相萃取法等.這些方法對(duì)漁藥殘留的檢測多是按同族藥物或單一藥物來開發(fā),這些方法的不足之處在于僅可以檢測單一或幾個(gè)目標(biāo)化合物,檢測效率低,成本高,造成檢測儀器設(shè)備、檢測人員的浪費(fèi).本實(shí)驗(yàn)采用Prime HLB固相萃取柱凈化,超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法一次性檢測4類12種漁藥殘留,檢測效率高,成本低,適用于越來越繁重的突發(fā)事件和應(yīng)急監(jiān)測工作.

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

儀器:超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀Waters Acquity UPLC-TQD(美國Waters公司),配有電噴霧離子源;Milli-Q高純水發(fā)生器(美國Millipore公司);高速離心機(jī)(Sigma);高速組織勻質(zhì)儀、渦旋振蕩器(IKA);氮吹儀(美國Organomation);pH計(jì)、電子天平(Mettler Toledo);超聲波清洗器(KUDOS);料理機(jī)(博朗);試劑:優(yōu)級(jí)純的乙腈、甲酸、氯化鈉、鹽酸羥胺、對(duì)甲苯磺酸、無水乙酸鈉、冰乙酸(科密歐);乙腈、甲醇色譜純(美國Fisher公司);甲酸色譜級(jí)(迪馬);Prime HLB固相萃取柱(Waters);標(biāo)準(zhǔn)品均購自Dr.Ehrenstorfer.樣品:供試樣品鯉魚,購自當(dāng)?shù)爻?魚去鱗,取脊背上的魚肉,切成小塊,在料理機(jī)中絞碎.

1.2 樣品的提取

稱取5.0g絞碎的魚肉樣品于50mL具塞離心管內(nèi),加入混合內(nèi)標(biāo)工作溶液,渦旋混勻.加入1.5mL20%的鹽酸羥胺溶液,2.5mL1.0mol/L的對(duì)甲苯磺酸溶液,5.0mL乙酸鹽緩沖溶液,乙腈8mL,渦旋混勻后,超聲5min,再加入8g氯化鈉,渦旋混勻60s,7000r/min離心5min,收集上清液的乙腈層于50mL燒杯中.再向離心管中加入乙腈8mL,渦旋混勻60s,7000r/min離心5min,合并乙腈層的提取液.

1.3 樣品的凈化

Prime HLB固相萃取柱,加入與提取液pH值相近的甲酸乙腈1mL進(jìn)行固相萃取小柱的活化.將50mL燒杯中的提取液轉(zhuǎn)移至固相萃取小柱,收集全部流出液,40℃下氮吹至近干.用200μL乙腈溶解后,800μL水定容至1mL,過0.22μm的濾膜.供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定.

1.4 儀器條件

超高效液相色譜條件:色譜柱: Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(1.7μm,2.1x50 mm );柱溫: 35℃; 進(jìn)樣體積: 5μL;流速: 0.3mL/min;流動(dòng)相1:A為乙腈, 流動(dòng)相B為0.1% 甲酸溶液.具體洗脫程序:0～2.0min10～25%A,2.0～3.0min25～45%A,3.0～4.0min45～90%A, 4.0～5.5min90%A,5.6～7.0min10A.

質(zhì)譜條件:離子源: 電噴霧電離源( ESI),正、負(fù)離子模式;源溫度: 110℃;毛細(xì)管電壓:+0.5kV,-2.0 kV;脫溶劑溫度:400℃;脫溶劑氣流速(N2):800L/h;錐孔氣速: 50L/h.采用MRM多反應(yīng)檢測模式進(jìn)行檢測.

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法

水產(chǎn)品中磺胺類、喹諾酮類和氯霉素的提取試劑主要有乙酸乙酯、甲醇、不同酸度的乙腈等,而孔雀石綠的提取采用了乙腈-鹽溶液或乙腈作為提取試劑[12].本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了乙腈和乙腈-鹽溶液對(duì)魚肉中的12種化合物的提取效率,結(jié)果表明,在使用單一的乙腈提取時(shí),孔雀石綠、隱色孔雀石綠及其內(nèi)標(biāo)物的提取效率為零,沒有任何回收,其余的化合物的回收較好.采用乙腈-鹽溶液為提取試劑,在保證了磺胺類、喹諾酮類和氯霉素的提取效率的前提下,孔雀石綠和隱色孔雀石綠的回收率能滿足要求.水產(chǎn)品中漁藥殘留的提取主要有高速組織勻質(zhì)、超聲波提取、震蕩提取,本實(shí)驗(yàn)對(duì)以上三種提取方法進(jìn)行對(duì)比.高速組織勻質(zhì)機(jī)進(jìn)行勻質(zhì)提取時(shí),由于魚肉較粘,會(huì)大部分樣品粘黏在勻質(zhì)機(jī)的刀頭上,降低提取效率.震蕩和超聲波提取都能達(dá)到較好的提取效果,但震蕩提取時(shí)離心管是橫放在振蕩器上的,提取液容易從離心管蓋溢出,綜合考慮提取效率及可操作性,選取超聲波提取.

2.2 樣品凈化

基質(zhì)效應(yīng)是影響LC-MSMS定量分析準(zhǔn)確性的重要因素.樣品凈化效果不好會(huì)影響化合物的離子化,基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng),導(dǎo)致色譜峰峰型不好,并且對(duì)色譜柱和質(zhì)譜有污染.基質(zhì)效應(yīng)通過對(duì)每個(gè)待測物的基質(zhì)增強(qiáng)或抑制進(jìn)行評(píng)價(jià).具體的計(jì)算公式為ME=Rm/Rsⅹ100%,其中Rm為目標(biāo)化合物在空白基質(zhì)溶液中的響應(yīng)值,Rs為目標(biāo)化合物初始流動(dòng)相溶液中的響應(yīng)值[13].固相萃取柱的基本操作步驟為活化、上樣、淋洗、洗脫.Prime HLB固相萃取柱的工作原理是吸附提取液中的雜質(zhì)已達(dá)到凈化的目的,產(chǎn)品的使用方法是不用活化即可使用.為了驗(yàn)證不活化的固相萃取柱的去除雜質(zhì)的效果,比對(duì)了固相萃取柱不活化、樣品空白提取液活化和pH=1.40的甲酸乙腈(與提取液中的pH值相近)活化三種不同的方式.以基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱來衡量不同活化方式的凈化效果.三種不同活化方式的基質(zhì)效應(yīng)比較見表1.由表可見,除隱色孔雀石綠為基質(zhì)減弱效應(yīng)外,其余參數(shù)的三種活化方式均為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),其中樣品空白提取液活化和pH=1.40的甲酸乙腈活化的基質(zhì)效應(yīng)差異不明顯.使用樣品提取液進(jìn)行活化,需要每次檢測前都找到陰性樣品,增加工作量和工作難度,最終本實(shí)驗(yàn)選取pH=1.40的甲酸乙腈為活化試劑.

表1 三種不同活化方式的基質(zhì)效應(yīng)對(duì)比

2.3 質(zhì)譜方法的優(yōu)化

配制濃度為1mg/kg的12種漁藥及其內(nèi)標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)溶液,以流動(dòng)注射方式連續(xù)進(jìn)樣,進(jìn)行母離子掃描.按照歐盟(2002/657/EC)指令規(guī)定,低分辨率質(zhì)譜聯(lián)用檢測應(yīng)確定在母離子的基礎(chǔ)上選擇兩個(gè)以上子離子.在確定各個(gè)化合物母離子后,對(duì)其母離子進(jìn)行碰撞掃描,每個(gè)化合物再選擇2個(gè)響應(yīng)值高的特征離子對(duì)作為定量及定性離子,同時(shí)對(duì)其進(jìn)行MRM參數(shù)優(yōu)化.12種漁藥及其內(nèi)標(biāo)化合物中只有氯霉素及其內(nèi)標(biāo)物為ESI-模式,其余的參數(shù)均為ESI+模式.優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見表2.各化合物的總離子流圖見圖1.

表2 12種漁藥及內(nèi)標(biāo)標(biāo)品多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式(MRM)的質(zhì)譜參數(shù)

圖1 12種化合物及其內(nèi)標(biāo)物的總離子流圖

2.4 液相方法的優(yōu)化

由于這12種化合物及其內(nèi)標(biāo)物的化學(xué)性質(zhì)差異較大,在質(zhì)譜中采用了正離子和負(fù)離子的采集模式,為了使每個(gè)化合物能夠更好的離子化,需要對(duì)使用的流動(dòng)相體系進(jìn)行優(yōu)化.根據(jù)查閱的文獻(xiàn)及本實(shí)驗(yàn)室的工作經(jīng)驗(yàn),對(duì)這12種化合物儀器分析時(shí)所采用有機(jī)相主要有乙腈、甲醇;水相主要有水、甲酸-水、乙酸銨.本實(shí)驗(yàn)進(jìn)樣適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品,對(duì)乙腈-5mmol/L乙酸銨、乙腈-0.1%甲酸、甲醇-水三種流動(dòng)相進(jìn)行優(yōu)化.各待測物在不同流動(dòng)相體系中的響應(yīng)值區(qū)別見圖2.由圖2可以看出,以乙腈-5mmol/L乙酸銨為流動(dòng)相時(shí)氯霉素的響應(yīng)值高,但喹諾酮化合物的響應(yīng)值低,其中環(huán)丙沙星沒有響應(yīng);以甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)磺胺類化合物沒有響應(yīng)或響應(yīng)值低;以乙腈-0.1%甲酸為流動(dòng)相時(shí),氯霉素的響應(yīng)值較以乙腈-5mmol/L乙酸銨為流動(dòng)相低,但能滿足檢測需求,其他化合物的響應(yīng)值均較高,也在檢測需求范圍內(nèi).最終選擇以乙腈-0.1%甲酸為流動(dòng)相.

圖2 待測物在不同流動(dòng)相體系中的響應(yīng)值

2.5 方法的線性、檢出限和定量限

為了消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量結(jié)果造成的影響,以不含待測物的空白樣品為基質(zhì)液,配制成基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,磺胺類、氯霉素、喹諾酮類化合物濃度分別為10、50、100 、200、300、500、1000μg/mL,孔雀石綠和隱色孔雀石綠的濃度分別為5、10、15 、20、25、50、100μg/mL,進(jìn)行方法線性的測定.以待檢參數(shù)的面積(y)為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度(x)(mg/L)為橫坐標(biāo),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程.線性范圍及相關(guān)系數(shù)見表3.以目標(biāo)化合物在空白基質(zhì)中的信噪比(S/N)來獲得檢出限和定量限,S/N=3時(shí)對(duì)應(yīng)的含量為檢出限(LOD),S/N=10時(shí)對(duì)應(yīng)的含量為定量限(LOQ).

表3 12種漁藥的線性范圍、線性方程及相關(guān)系數(shù)

2.6 方法的回收率、精密度

按照不同化合物的檢出限和國家規(guī)定的限量標(biāo)準(zhǔn),每種化合物在樣品中添加低、中、高三種水平濃度的標(biāo)品,每個(gè)水平重復(fù)6次,按照2.2的試驗(yàn)方法進(jìn)行處理,計(jì)算方法的回收率和精密度.具體的添加濃度、回收率和精密度見表4.回收率在70.3-118.7%之間,精密度為1.5-6.7%,符合國家檢測標(biāo)準(zhǔn)的要求.

表4 方法的添加回收率和精密度(n=6)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用乙腈-鹽溶液提取,Prime HLB固相萃取柱凈化,超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析,建立了能一次性檢測水產(chǎn)品中磺胺類、喹諾酮類、孔雀石綠以及氯霉素四類12種漁藥殘留的方法.通過對(duì)方法的檢出限、回收率、精密度、線性范圍等方法學(xué)進(jìn)行驗(yàn)證,該方法滿足對(duì)這12種漁藥檢測的要求.與傳統(tǒng)的方法相比,本實(shí)驗(yàn)的方法快速、簡單、靈敏、成本低、效率高,適合實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行批量樣品的檢測.

略)

張海霞 性別:女 職稱:高級(jí)農(nóng)藝師 電話:15204666138 Email:zhanghaixianj@163..com