潘鈺　榮瑋　李致慧　孫秀麗　王丹娜　孫艷宏

【摘要】 目的：了解小鼠感染華支睪吸蟲后肝臟的病理變化，為研究華支睪吸蟲的致病機制提供參考依據(jù)。方法：胃蛋白酶消化法獲取華支睪吸蟲囊蚴，人工灌胃法感染小鼠，采用病理學(xué)方法取材、固定及染色，觀察小鼠肝臟的病理學(xué)變化。結(jié)果：不同感染時間的炎癥反應(yīng)程度存在差異，出現(xiàn)纖維組織增生、膽管壁增厚、嗜酸性囊腫等病理學(xué)現(xiàn)象。結(jié)論：小鼠感染華支睪吸蟲后肝臟出現(xiàn)了顯著的病理學(xué)改變，這種現(xiàn)象對于研究人體內(nèi)華支睪吸蟲的致病作用具有一定的參考價值。

【關(guān)鍵詞】 華支睪吸蟲； 囊蚴； 病理變化

Pathological Observation of Liver in Mice Infected with Clonorchis Sinensis/PAN Yu，RONG Wei，LI Zhi-hui，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（30）：015-018

【Abstract】 Objective：To investigate the pathological changes of liver in mice infected with clonorchis sinensis，and to provide the scientific basis for the study of pathogenicity of clonorchis sinensis.Method：The pepsin digestion method was used to obtain metacercaria of clonorchis sinensis，the artificial gastric irrigation was used to infect mouse，the liver tissues were taken from the mice after infection for pathological examination，the procedure included the fixed of body，paraffin section and staining，observed the pathologic changes by microscope.Result：There were differences in the degree of inflammatory reaction at different infection times，pathological changes such as fibrous tissue hyperplasia，eosinophilic cyst，the walls of hepatic bile ducts had thickened and so on.Conclusion：After the mice infected with clonorchis sinensis，the liver showed a remarkable pathological change，and this phenomenon have a certain reference value for the study of the pathogenic role of clonorchis sinensis in human body.

【Key words】 Clonorchis sinensis； Metacercaria； Pathological change

First-authors address：Qiqihar Medical University，Qiqihar 161006，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.30.005

華支睪吸蟲?。–lonorchiasis sinensis）俗稱肝吸蟲病，是一種重要的食源性寄生蟲病，可引起多種肝臟及膽管系統(tǒng)并發(fā)癥。WHO國際癌癥研究署明確膽管細胞癌的致癌物包括華支睪吸蟲，成為了全球被忽視的熱帶病之一，給感染者造成明顯的生命質(zhì)量損失，成為影響食品安全和人民健康的重要因素之一[1-3]。中國作為華支睪吸蟲病負(fù)擔(dān)最為嚴(yán)重的國家和感染的高發(fā)國家之一[4-6]，需要加強相關(guān)研究工作。本研究觀察小鼠感染華支睪吸蟲后肝臟的病理變化，為研究華支睪吸蟲的致病機制提供參考依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康清潔級小鼠，由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。

1.1.2 囊蚴來源 胃蛋白酶消化法獲取淡水魚（麥穗魚）體內(nèi)囊蚴，鑒定分離后保存于生理鹽水中備用。

1.1.3 試劑與儀器 胃蛋白酶Pepsin（活性1∶3000）（上海藍季科技發(fā)展有限公司），生理鹽水，5%～10%甲醛溶液，HE染液，雙目顯微鏡（日本，OLYMPUS），60、80、100目標(biāo)準(zhǔn)檢驗篩（上海尚篩機械制造有限公司），12號小鼠灌胃針（北京凱輝盛達科技發(fā)展有限公司），絞肉機（慈溪市寧匯電器有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 囊蚴的獲取 提取麥穗魚脊背部魚肉（將陽性魚用清水洗滌數(shù)次后，去除魚鰭、魚頭、魚皮及內(nèi)臟，分離魚肉），絞肉機粉碎后放入配置好的消化液內(nèi)消化（消化時，須先將消化液預(yù)熱，然后放入37 ℃溫箱中消化，消化過程中需用玻璃棒攪拌消化液數(shù)次），消化后的魚肉經(jīng)過分離篩過濾、生理鹽水洗滌、分離數(shù)次后獲取囊蚴，生理鹽水內(nèi)4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 小鼠分組 按照隨機分配的原則30只小鼠被分成感染組（25只）和對照組（5只）。通過灌喂囊蚴30～40個/只的方式感染小鼠。選擇早晨小鼠空腹時進行灌胃，1 mL的注射器安裝12號灌胃針頭，用生理鹽水沖洗2～3次；室溫放置保存于生理鹽水中的華支睪吸蟲囊蚴幾分鐘后，用吸管將其吸出，放入玻璃平皿中，然后吹打玻璃平皿內(nèi)的囊蚴，用蒸餾水沖洗幾次后進行灌胃[7]。endprint

1.2.3 華支睪吸蟲的鑒別 取肝臟，反復(fù)生理鹽水沖洗后從肝臟近肝門區(qū)剪開肝臟，再用手輕輕擠壓肝臟，一般擠壓方向從肝臟邊緣向中央進行，可反復(fù)擠壓幾次，這時從擠出的膽汁中可發(fā)現(xiàn)蟲體。用毛筆柔軟的細毛輕輕挑起蟲體至生理鹽水中，或直接用吸管吸起蟲體放入生理鹽水中，但需要生理鹽水反復(fù)沖洗幾次蟲體，以去除表面的膽汁，然后蒸餾水清洗，使蟲體表面潔凈，最后平整放在載玻片中央，鏡下觀察，進行華支睪吸蟲的形態(tài)鑒別

1.2.4 肝膽組織病理標(biāo)本的采集 感染后第10、20、30天頸椎脫位處死所有小鼠（包括感染組和對照組），無菌條件下，快速獲取兩組小鼠的肝膽系統(tǒng)標(biāo)本。

1.2.5 病理學(xué)觀察 常規(guī)方法進行病理學(xué)檢測，標(biāo)本均采用5%的甲醛溶液固定；然后進行石蠟切片；最后通過常規(guī)HE染色后，鏡下觀察兩組小鼠肝膽系統(tǒng)的病理學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 小鼠形態(tài)觀察 （1）灌喂前觀察：兩組小鼠的體態(tài)、食欲及活動情況均無差別。（2）感染后觀察：感染組小鼠灌喂囊蚴后，在短暫的適應(yīng)期后，體態(tài)、食欲及活動情況無特別顯著變化，但在1周后，尤其在感染囊蚴10 d左右時變化明顯，出現(xiàn)生長緩慢，精神萎靡，食欲減退，活動減慢等現(xiàn)象；而對照組小鼠灌喂生理鹽水后，體態(tài)、食欲及活動情況均無明顯變化。

2.2 肝臟表面觀察 對照組小鼠肝臟表面光滑，飽滿紅潤，膽管乳白色且粗細均勻，膽汁清亮，見圖1。感染組小鼠肝臟腫大，表面密布白色結(jié)節(jié)，手感粗糙，顏色深淺不一，肝外膽管直徑明顯增粗，剪破膽管發(fā)現(xiàn)管壁明顯增厚，管壁內(nèi)的黏稠物呈現(xiàn)褐色、血色或黃綠色，向破口方向擠壓肝膽管，大量華支睪吸蟲成蟲隨之流出，見圖2。

2.3 病理學(xué)觀察 對照組小鼠肝臟病理標(biāo)本的肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，中央靜脈位于肝小葉的中央位置，其周圍的肝板呈放射狀排列，肝血竇位于肝板之間，門管區(qū)也清晰可見，此外。還可觀察到整齊分布的膽管上皮細胞，見圖3、4。觀察感染第10天的小鼠肝臟病理標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，大量的炎細胞浸潤現(xiàn)象，膽管增生明顯，膽管上皮細胞也出現(xiàn)了部分壞死脫落現(xiàn)象，在其周圍的纖維組織出現(xiàn)了輕度的增生，炎性細胞浸潤中以嗜酸性粒細胞為主，見圖5。觀察感染第20天的小鼠肝臟病理標(biāo)本：肝吸蟲蟲體的切面及葵花籽狀的肝吸蟲蟲卵在膽管內(nèi)清晰可見。由于有大量蟲體及蟲卵在膽管內(nèi)的寄生，導(dǎo)致了膽管向周圍明顯的擴張，加上蟲體及蟲卵對膽管上皮細胞的刺激作用，使其出現(xiàn)了不同程度的增生，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)管腔邊緣參差不齊，突出呈乳頭狀。此外，由于蟲體的寄生導(dǎo)致了部分肝小葉的結(jié)構(gòu)遭到破壞，部分膽管上皮細胞出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的壞死脫落現(xiàn)象，在其周圍的纖維組織出現(xiàn)了中度的增生，炎性細胞浸潤中仍然以嗜酸性粒細胞為主，而且局部形成了嗜酸性膿腫，見圖6。觀察感染第30天的小鼠肝臟病理標(biāo)本：膽管上皮細胞脫落更為嚴(yán)重，膽管呈囊性擴張，嚴(yán)重擴張的膽管附近出現(xiàn)了肝細胞萎縮現(xiàn)象，大量上皮細胞開始變性、壞死、崩解、脫落。鏡下觀察膽管結(jié)構(gòu)，部分區(qū)域不清晰，炎性細胞浸潤更為明顯，部分肝細胞已經(jīng)壞死，見圖7。

3 討論

華支睪吸蟲病是一種重要的食源性寄生蟲病，關(guān)乎國計民生，是我國“十二五”規(guī)劃重點防治的重點寄生蟲病之一[8]，其主要寄生于人和保蟲宿主的肝膽管內(nèi)，引起肝臟損傷、膽道病變、肝硬化、甚至誘發(fā)肝癌，尤其是膽管細胞癌[9-10]。感染華支睪吸蟲后可致宿主腸道菌群失調(diào)，破壞腸道的生理屏障[11]，本實驗中小鼠感染華支睪吸蟲后，出現(xiàn)了食欲逐漸減退，活躍度降低等現(xiàn)象。

華支睪吸蟲引起病變的主要原因是由于大量蟲體的機械性刺激、壓迫及其分泌物和代謝產(chǎn)物引起膽管上皮脫落、增生，導(dǎo)致管壁增厚、管腔狹窄，引起膽汁流通不暢，易合并細菌感染，出現(xiàn)膽道炎癥，嚴(yán)重時可引起癌變。成蟲長時間寄生于肝膽管內(nèi)，刺激膽管內(nèi)膜及膽管周圍組織，引起了不同程度的炎性反應(yīng)及過敏反應(yīng)。而且死亡蟲體碎片、蟲卵、膽管上皮脫落細胞可引起膽管結(jié)石，出現(xiàn)膽石癥[12]。當(dāng)大量蟲體長時間寄生蟲后，感染會更加嚴(yán)重，肝細胞的萎縮和變性現(xiàn)象及其周圍纖維組織的增生均可出現(xiàn)在門脈區(qū)周圍，甚至出現(xiàn)膽汁性肝硬化。

華支睪吸蟲病的主要危害性在于肝臟受損。文獻[13-14]中報道，長爪沙鼠感染華支睪吸蟲后，出血、淤血和間質(zhì)性炎癥反應(yīng)現(xiàn)象在感染的后第2天就在肝臟被發(fā)現(xiàn)；小膽管和成纖維細胞的增生出現(xiàn)在感染的第10天；感染第15天匯管區(qū)出現(xiàn)了大量的膽汁堵塞淤積現(xiàn)象。另據(jù)報道，豚鼠感染華支睪吸蟲后，病理觀察發(fā)現(xiàn)，在感染第19天～2個月后的豚鼠出現(xiàn)了結(jié)構(gòu)混亂的肝小葉，小膽管與結(jié)締組織出現(xiàn)了增生[15]。研究顯示，宿主的肝膽管內(nèi)是華支睪吸蟲成蟲的主要寄生部位，其致病機制主要包括蟲體運動時的機械刺激，蟲體分泌物及代謝產(chǎn)物引起的免疫反應(yīng)，造成了肝組織的免疫損傷，由此引起肝臟組織發(fā)生相應(yīng)的病理變化，導(dǎo)致膽管炎、膽囊炎及其他炎癥性病變。本次實驗結(jié)果顯示，感染華支睪吸蟲后，小鼠肝臟受損嚴(yán)重，病理形態(tài)學(xué)變化明顯。感染后肝臟及肝膽管的病理變化與感染程度及感染時間呈正相關(guān)：感染早期程度相對較輕，大體解剖見病變輕度，但呈廣泛彌漫性改變。盡管膽管增生明顯，出現(xiàn)了部分膽管上皮細胞的壞死脫落現(xiàn)象，但周圍纖維組織的增生程度較輕，以嗜酸性粒細胞浸潤為主。感染20 d左右時，解剖見肝內(nèi)膽管壁增厚，膽管擴張明顯，膽管上皮均有不同程度的增生，主要原因在于成蟲寄生時的粘附以及分泌物和排泄物的刺激導(dǎo)致。膽管內(nèi)可見華支睪吸蟲蟲體及蟲卵，部分膽管上皮細胞壞死脫落，周圍有中度纖維組織增生，肝臟淤血嚴(yán)重，膽管上皮細胞排列不規(guī)則出現(xiàn)水腫、壞死現(xiàn)象，局部形成嗜酸性膿腫。感染30 d后，大體解剖見大量的結(jié)節(jié)狀凸起出現(xiàn)在了肝臟表面，病理組織標(biāo)本觀察發(fā)現(xiàn)，肝內(nèi)出現(xiàn)廣泛病變且明顯，膽管呈現(xiàn)高度擴張，肝細胞萎縮現(xiàn)象出現(xiàn)在膽管周圍，大量蟲體聚集在肝膽管內(nèi)，導(dǎo)致了管道的阻塞和膽汁的滯留，如若合并細菌感染，膽管炎、膽管肝炎等炎癥反應(yīng)將隨之出現(xiàn)。鏡下還可發(fā)現(xiàn)膽管已經(jīng)呈現(xiàn)囊性擴張，大量上皮細胞出現(xiàn)變性、壞死、崩解、脫落現(xiàn)象，甚至部分區(qū)域的膽管結(jié)構(gòu)鏡下不清晰。endprint

綜上所述，小鼠感染華支睪吸蟲囊蚴后，無論是小鼠的體態(tài)、食欲及活動情況等肉眼所見，還是從病理學(xué)角度觀察感染不同時間的小鼠肝臟及肝膽管，均出現(xiàn)了明顯的變化，對于研究在人體感染華支睪吸蟲后肝膽管出現(xiàn)的病理變化具有一定的借鑒意義和參考價值。

參考文獻

[1]錢門寶，陳穎丹，周曉農(nóng).從認(rèn)識到實踐-紀(jì)念華支睪吸蟲發(fā)現(xiàn)140周年[J].中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2014，32（4）：247-252.

[2] WHO.Working to Overcome the Global Impact of Neglected Tropical Diseases：First WHO Report on Neglected Tropical Diseases[M].Geneva：World Health Organization，2010.

[3]錢門寶，陳穎丹，周曉農(nóng).中國華支睪吸蟲防控的差距[J].中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2016，34（4）：373-376.

[4] Fürst T，Keiser J，Utzinger J.Global burden of human food-borne trematodiasis：a systematic review and meta-analysis[J].Lancet Infect Dis，2012，12（3）：210-221.

[5]許隆祺，陳穎丹，孫鳳華，等.全國人體重要寄生蟲病現(xiàn)狀調(diào)查報告[J].中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2005，23（5）：332-340.

[6]方悅怡，陳穎丹，黎學(xué)銘，等.我國華支睪吸蟲病流行區(qū)感染現(xiàn)狀調(diào)查[J].中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2008，26（2）：99-103.

[7]劉繼鑫，孫艷宏，郭家，等.華支睪吸蟲在小鼠體內(nèi)的發(fā)育觀察[J].中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2014，32（5）：406-407.

[8]羅波，趙玉敏，莫剛，等.急性大劑量華支睪吸蟲感染大鼠血清學(xué)指標(biāo)和肝臟病理形態(tài)學(xué)改變的研究[J].中國病原生物學(xué)雜志，2017，12（4）：341-344.

[9]石夢辰，陳庭金，周麗娜，等.華支睪吸蟲severin蛋白對肝癌細胞SMMC-7402增殖、遷移及侵襲作用的初步研究[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2016，16（2）：127-130.

[10]王彩琴，余新炳，李學(xué)榮.華支睪吸蟲感染與膽管癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究進展[J].中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2015，33（2）：142-146.

[11]蔡連順，祝麗玲，宮梓琳，等.腸道微生態(tài)在華支睪吸蟲致宿主肝功能損傷中的作用研究[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2017，29（1）：16-18，21.

[12]馬瑞紅，喬鐵，羅振亮，等.華支睪吸蟲流行區(qū)膽石癥患者膽囊結(jié)石類型及華支睪吸蟲感染情況[J].中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2015，33（3）：167-171.

[13]高廣漢，王運章，武烽，等.華支睪吸蟲病實驗病理學(xué)研究[J].中國寄生蟲病防治雜志，1994，7（3）：197-200.

[14]朱師晦，潘世定，何雅明，等.曲江縣帶頭地區(qū)中華分枝睪吸蟲病暴發(fā)流行調(diào)查報告[J].廣東醫(yī)學(xué)，1963，1（3）：101-104.

[15]張曉麗，李懿宏，王凱慧，等.華支睪吸蟲病大鼠肝細胞凋亡的實驗研究[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2005，39（1）：55-57.

（收稿日期：2017-05-23） （本文編輯：董悅）endprint