李志峰　陳勇　童仲馳

摘要：目的 研究CD164在膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞系中的表達(dá)，以及對體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的作用。方法 采用qRT-PCR分析CD164在45例膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中的表達(dá)，利用western blot檢測CD164在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SF295、SHG-44、U87和U251以及人正常星形膠質(zhì)細(xì)胞系NHA中的表達(dá)；構(gòu)建沉默CD164的慢病毒載體，并將其感染至膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251，CCK-8法檢測細(xì)胞增殖；western blot法檢測感染CD164 shRNA后對U251細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果 CD164在膠質(zhì)瘤組織的表達(dá)較正常腦組織顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)（P<0.001）；與NHA細(xì)胞相比較，CD164在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SF295、SHG-44、U87和U251細(xì)胞中的表達(dá)量明顯增加，具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異性（P<0.001）；U251細(xì)胞感染CD164 shRNA后，細(xì)胞存活率較陰性對照組下降，兩組結(jié)果存在明顯的統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.001）；感染CD164 shRNA至U251細(xì)胞后PTEN蛋白表達(dá)水平明顯升高。結(jié)論 CD164可能通過調(diào)控PTEN的表達(dá)從而影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。

關(guān)鍵詞：膠質(zhì)瘤；CD164；PTEN；增殖

中圖分類號：R739.41 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-1959（2017）22-0029-04

Abstract：Objective To investigate the expression of CD164 in glioma tissues and cell lines，and the effects on glioma cell proliferation in vitro. Methods The expression of qRT-PCR of CD164 in 45 cases of glioma tissues and normal brain tissues，using western blot to detect CD164 in the human glioma cell lines SF295，SHG-44，U87 and U251 and the expression of the normal astrocyte cell line NHA；lentiviral vector construction of CD164 silencing，and the infection to U251 glioma cell line，cell proliferation was detected by CCK-8；CD164 shRNA western blot infection detection method of U251 cells PTEN protein expression.Results The expression of CD164 in glioma compared with normal brain tissue the organization was significantly increased，the difference was statistically（P<0.001）；compared with NHA cells，CD164 in human glioma cell lines SF295，SHG-44， expression of U87 and U251 cells increased significantly，a statistically significant difference（P<0.001）；U251 cells infected with CD164 shRNA，the cell survival rate decreased compared with negative control group，there were statistically significant differences between the results of the two groups（P<0.001）；the expression level of PTEN protein was significantly increased CD164 shRNA infection to U251 cells.Conclusion CD164 may affect the proliferation of glioma cells by expression the regulation of PTEN.

Key words：Glioma；CD164；PTEN；Proliferation

膠質(zhì)瘤也被成為膠質(zhì)細(xì)胞瘤，是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率占所有顱內(nèi)腫瘤的30%～40%，2015年美國大約有20000膠質(zhì)瘤新發(fā)病例，同時膠質(zhì)瘤在青少年人群中的發(fā)病率呈逐年上升的態(tài)勢[1]。近年來，隨著對膠質(zhì)瘤基因分析研究的不斷深入，針對膠質(zhì)瘤的諸如免疫治療和基因治療等多種新型治療方式不斷涌現(xiàn)，有望更進(jìn)一步改善膠質(zhì)瘤患者預(yù)后[2]。CD164作為一種定位于6號染色體的唾液酸黏蛋白[3]。研究表明CD164在機(jī)體造血和調(diào)節(jié)正常細(xì)胞生長分化過程中發(fā)揮一定調(diào)控作用；同時CD164在調(diào)節(jié)惡性腫瘤細(xì)胞生長、凋亡和侵襲性行為中也發(fā)揮了一定作用；CD164已經(jīng)被證實在結(jié)腸癌、宮頸癌和成神經(jīng)管細(xì)胞瘤等實體腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[4-5]；最新研究結(jié)果表明CD164可作為急性成淋巴細(xì)胞性白血病中分子生物學(xué)標(biāo)記[6]。目前CD164與人腦膠質(zhì)瘤的相關(guān)性研究尚未見報道，為此，本研究擬探討CD164對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的作用，并探討其可能作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1組織標(biāo)本

收集岳陽市第二人民醫(yī)院神經(jīng)外科在2012年6月～2014年6月收治的45例腦膠質(zhì)瘤患者的臨床標(biāo)本，男22例，女23例，年齡48.9～71.2歲，平均年齡（58.6±6.4）歲，另外設(shè)立5例腦損傷患者正常腦組織標(biāo)本作為對照。所有納入本次隊列的患者均經(jīng)過2位經(jīng)驗豐富的病理科專家分別確診為膠質(zhì)瘤，且所有患者均未接受新輔助治療。其他排除標(biāo)準(zhǔn)包括下咽困難、急慢性感染、充血性心力衰竭、COPD和肝硬化。endprint

1.2 mRNA的提取及檢測

mRNA的提取實驗步驟嚴(yán)格按照miRNA提取試劑盒操作步驟進(jìn)行。CD164上游引物序列為：5′- GCTTCGCCAATTTGGGGTTG -3′，下游引物序列為5′-TATCCATCATTGTCGAATGTGT-3′，內(nèi)參U6上游引物序列為：5′- CCTCTTAGATCACTATGGCAG-3′，下游引物序列為5′- GTTATTGAGCCATGGTTCGG-3′。依照PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒根據(jù)制造商的指示，cDNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄生成。對mRNA進(jìn)行定量分析檢測步驟如下：95 °C溫度下2 min，然后在95 °C溫度下反應(yīng)45 s和60 °C溫度下反應(yīng)60 s，持續(xù)30個循環(huán)，每個樣本檢測3次，通過2-△△Ct的方法計算CD164 mRNA的相對表達(dá)差異倍數(shù)，實驗重復(fù)3次。

1.3試劑

Opti-MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司； Trizol試劑和Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；shRNA NC和CD164 shRNA購自中國GenePharma；miRNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR 試劑盒和細(xì)胞蛋白提取試劑盒購自日本TaKaRa株式會社；CCK-8試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；PTEN和β-actin抗體購自美國Epitomics公司。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)

人胚腎細(xì)胞株HEK-293T、膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SF295、SHG-44、U251和U251及人正常膠質(zhì)細(xì)胞NHA細(xì)胞均由上海細(xì)胞生物研究所提供。細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中補(bǔ)充10%胎牛血清、青霉素（100 U/μl）和鏈霉素（100 μg/ml）。細(xì)胞在37 ℃且CO2 含量約為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至占培養(yǎng)瓶底面積90%以上時用胰蛋白酶消化并用于實驗。

1.5 構(gòu)建慢病毒載體感染U251細(xì)胞及篩選

依照文獻(xiàn)提供的CD164 shRNA有效靶序列設(shè)計并構(gòu)建3條干擾序列及陰性對照序列，并篩選出一條最有效的干擾序列[7]，根據(jù)Lipofectamine2000制造商的指示將最優(yōu)干擾序列的慢病毒表達(dá)載體經(jīng)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞中，收集病毒上清液離心并測定病毒滴度后感染SW480細(xì)胞，將病毒液感染細(xì)胞12 h后更換含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白熒光，流式細(xì)胞儀檢測感染效率。

1.6 將CD164 shRNA及shRNA NC感染至U251細(xì)胞

將對數(shù)生長期的U251細(xì)胞接種于24孔板中，每孔2×105個細(xì)胞，將5 μl濃度為20 μmol/L的CD164 shRNA與5 μl感染試劑lipofeetamine 2000混勻后加入細(xì)胞中，CD164 shRNA的感染終濃度為100 nmol/L，將培養(yǎng)板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48 h后進(jìn)行相關(guān)功能性和western blot等檢測。shRNA NC的感染方法同CD164 shRNA的感染。

1.7 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

將U251細(xì)胞以每孔5×103個播種至96孔板中。在每個培養(yǎng)孔中添加完全培養(yǎng)基至100 μl在37 ℃含5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中至細(xì)胞融合，每孔添加CCK-8溶液（0.01 ml每孔）反應(yīng)1 h，用酶標(biāo)儀測定490 nm波長處吸光度值（A490），實驗重復(fù)5次，取平均值。

1.8 Western blot檢測細(xì)胞中蛋白的表達(dá)

U251細(xì)胞在冰冷的PBS液中洗滌三次后重懸于細(xì)胞裂解液（100 μL/孔）中。當(dāng)細(xì)胞裂片至于冰上反應(yīng)30 min，再在4 °C溫度下12000 g離心20 min，收集上清后使用BCA蛋白檢測試劑盒對蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行定量分析。蛋白質(zhì)樣品（30μg）使用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行后轉(zhuǎn)移到0.45 μm的硝酸纖維素膜上，并使用5%脫脂奶粉于4 ℃下孵育過夜，該膜在4 °C與一抗在室溫下反應(yīng)30 min后，在室溫下與二抗再次孵育1 h。以內(nèi)參β-actin蛋白條帶灰度值的比值來校正母的蛋白的光密度值。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)均以（x±s）來表現(xiàn)，使用t檢驗和方差分析對所得樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，統(tǒng)計學(xué)意義校正值設(shè)定為P<0.05。

2結(jié)果

2.1 CD164在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)

根據(jù)2007年WHO膠質(zhì)瘤分類標(biāo)準(zhǔn)將納入本組隊列的45例病例進(jìn)行分類，這45例膠質(zhì)瘤患者臨床病理學(xué)信息見表1。qRP-PCR檢測結(jié)果表明，與正常腦組織正常組織相比較，CD164在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)顯著上調(diào)（3.15±0.63 vs. 0.53±0.12），有統(tǒng)計學(xué)顯著性（P<0.001）。

2.2 CD164對體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響

western blot實驗檢測結(jié)果表明，CD164在人正常膠質(zhì)細(xì)胞NHA中的表達(dá)量較低，而在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SF295、SHG-44、U87和U251中表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=56.84， P<0.001）；同時與SF295、SHG-44和U87細(xì)胞相比較，U251細(xì)胞中CD164表達(dá)量明顯升高（P<0.001），后續(xù)試驗選擇U251細(xì)胞作為實驗對象，見圖1。

分別將CD164 shRNA或shRNA NC感染進(jìn)入U251細(xì)胞72 h后，利用western blot檢測U251細(xì)胞中的感染情況，結(jié)果表明細(xì)胞感染CD164 shRNA可顯著下調(diào)CD164在U251細(xì)胞中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），而感染shRNA NC對CD164的相對表達(dá)量無明顯影響（圖1B）。而U251細(xì)胞感染CD164 shRNA后經(jīng)CCK-8法檢測細(xì)胞A490值為0.455±0.073，較陰性對照組（0.742±0.084）明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性（t=8.563， P=0.013）。endprint

2.3 CD164對體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PTEN表達(dá)的影響

為研究CD164影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，本研究檢測了下調(diào)CD164后對U251細(xì)胞中PTEN蛋白的影響。western blot結(jié)果表明，與陰性對照組相比較，U251細(xì)胞經(jīng)感染shRNA CD164后可顯著上調(diào)U251細(xì)胞中PTEN蛋白的表達(dá)，而shRNA NC對U251細(xì)胞中PTEN的表達(dá)無明顯影響（圖2）。

3討論

本研究中，我們首先檢測了45例膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中CD164的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，CD164在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于正常腦組織，提示CD164在膠質(zhì)瘤發(fā)生的早期階段可能充當(dāng)著癌基因的作用，同時CD164在體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中的表達(dá)也高于正常膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，這種CD164在良惡性組織及細(xì)胞中的表達(dá)差異表明CD164與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展可能存在一定的關(guān)聯(lián)。為進(jìn)一步研究其在膠質(zhì)瘤惡性生物學(xué)行為中的作用，本研究通過RNA干擾技術(shù)沉默CD164在體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)證實成功構(gòu)建穩(wěn)定沉默CD164表達(dá)的U251細(xì)胞株，同時CCK-8實驗結(jié)果表明沉默CD164后可抑制體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，表明CD164在調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖中發(fā)揮了一定作用。

PTEN作為一個位于染色體10q23.3上的基因，也是在人類腫瘤中繼p53基因之后發(fā)現(xiàn)的最易發(fā)生變異的基因。PTEN基因在人體正常組織細(xì)胞中呈高表達(dá)，其正常表達(dá)參與了蛋白質(zhì)和酯類底物酪氨酸、絲/蘇氨酸磷酸化的調(diào)節(jié)過程，在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、增殖、凋亡和侵襲等生理活動中發(fā)揮廣泛的調(diào)控作用[7-8]。而PTEN基因突變或缺失及蛋白表達(dá)異?？纱龠M(jìn)細(xì)胞增生并抑制細(xì)胞凋亡，PTEN在惡性腫瘤中的表達(dá)與腫瘤TNM分期呈負(fù)相關(guān)，同時PTEN的低表達(dá)與乳腺癌化療耐藥密切相關(guān)[9-11]。同時PTEN的缺失或低表達(dá)可抑制PI3K激酶活性，使PIP3去磷酸化，引起PIP3催化亞基的表達(dá)放大而導(dǎo)致AKT磷酸化，從而在惡性腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、蛋白合成和轉(zhuǎn)移等多種生理活動中發(fā)揮重要作用，這是PTEN調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的重要作用機(jī)制，既往研究表明，抑制PTEN/PI3K/AKT 通路的激活可有效抑制惡性腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[12]。在本研究中，筆者觀察到沉默CD164在體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)后可誘導(dǎo)PTEN在細(xì)胞中的表達(dá)，因此筆者猜想CD164可能通過調(diào)控PTEN的表達(dá)從而影響體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。

綜上所述，本研究表明CD164可負(fù)向調(diào)控PTEN的表達(dá)從而影響體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，但CD164是否對體內(nèi)膠質(zhì)瘤同樣具有調(diào)節(jié)增殖能力尚未可知，同時雖然證實CD164與PTEN在體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞中存在一定聯(lián)系，但CD164與PTEN之間是直接調(diào)控還是間接調(diào)控仍需進(jìn)一步實驗明確。但本次研究為臨床膠質(zhì)瘤基因治療提供一個新的作用靶點，在揭示膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制及治療上具有一定積極意義。

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編輯/李樺endprint