靳彤，史宏志，周駿，白若石，楊惠娟，趙世民，王俊

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草行業(yè)煙草栽培重點實驗室/煙草農(nóng)業(yè)減害研究中心，河南省鄭州市文化路95號，450002；2 上海煙草集團(tuán)北京卷煙廠，北京 100024；3 河南省煙草公司洛陽市公司，洛陽471000

農(nóng)藝與調(diào)制

不同初烤煙葉葉片和煙梗TSNAs 含量及高溫貯藏后的變化研究

靳彤1，史宏志1，周駿2，白若石2，楊惠娟1，趙世民3，王俊1

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草行業(yè)煙草栽培重點實驗室/煙草農(nóng)業(yè)減害研究中心，河南省鄭州市文化路95號，450002；2 上海煙草集團(tuán)北京卷煙廠，北京 100024；3 河南省煙草公司洛陽市公司，洛陽471000

為明確不同地區(qū)、不同品種、不同部位初烤煙葉葉片和煙梗TSNAs含量及其與前體物之間的關(guān)系，探明高溫貯藏對TSNAs形成的影響。收集了我國河南、云貴、粵湘產(chǎn)區(qū)的30個烤煙初烤后煙葉樣品，在河南洛陽設(shè)置品種試驗，另將初烤葉片和煙梗進(jìn)行高溫貯藏，研究煙草特有亞硝胺、生物堿和硝酸鹽含量的變化。結(jié)果表明，初烤煙葉葉片TSNAs含量均顯著高于煙梗，且在葉片中NNN比例較高，在煙梗中則以NNK比例較高；葉片中生物堿總量約為煙梗的4.7倍；硝酸鹽含量則表現(xiàn)為煙梗中含量遠(yuǎn)高于葉片。不同地區(qū)葉片TSNAs含量達(dá)到極顯著差異，以湘粵產(chǎn)區(qū)含量最高；不同品種葉片的TSNAs含量達(dá)到顯著差異，生物堿含量較低的品種TSNAs含量較低；各部位煙葉TSNAs含量均表現(xiàn)為葉片＞支脈＞主脈。相關(guān)分析表明在煙葉烘烤過程中煙葉生物堿含量對TSNAs積累的影響較大。經(jīng)高溫貯藏后葉片和煙梗TSNAs含量增加幅度有較大差異，其中煙梗TSNAs增加比例達(dá)到229.2%，葉片增加30.6%，硝酸鹽含量對高溫貯藏過程中TSNAs形成影響較大。

烤煙；煙草特有亞硝胺（TSNAs）；煙梗；葉片；硝酸；高溫貯藏

煙草特有亞硝胺(TSNAs)是由煙草生物堿亞硝化生成的煙草中特有的有害成分，主要有4種：N-亞硝基降煙堿（NNN）、4-(甲基亞硝氨)-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）、N-亞硝基新煙草堿(NAT)、N-亞硝基假木賊堿(NAB)，其中NNN和NNK已被證明具有動物致癌性[1]。一般而言，在鮮煙葉中檢測不到TSNAs或含量極低，TSNAs的形成和積累主要在調(diào)制和貯藏階段[2-3]。煙葉是由葉片和煙梗組成的，其中烤煙的含梗率約占葉重的25%～30%，煙梗也是卷煙生產(chǎn)中重要的原料之一。目前對煙梗中TSNAs形成的研究報道較少。

TSNAs含量與生物堿和硝酸鹽的含量有密切關(guān)系。史宏志等[4]研究表明 ,煙葉中TSNAs的形成受煙草生物堿和亞硝酸鹽的雙重影響。有關(guān)研究也證明，煙葉中煙草生物堿和TSNAs有直接的相關(guān)關(guān)系[5-9]。Fischer[10]認(rèn)為煙草中NO3-水平可能是TSNAs積累的一個指示物，NO3-到NO2-的還原可能是TSNAs積累的限制階段。貯藏條件也是影響TSNAs含量的一個重要因素[11-14]，王瑞云等[12]研究結(jié)果表明在貯藏階段煙葉TSNAs含量大幅度增加。高溫和高硝態(tài)氮含量可能是造成煙葉貯藏過程中TSNAs含量增加的主要原因[15]。本試驗通過采集我國部分烤煙產(chǎn)區(qū)的初烤后煙葉樣品，并設(shè)置品種試驗，研究了初烤煙葉葉片和煙梗TSNAs含量及其與前體物之間的關(guān)系，另將初烤葉片和煙梗進(jìn)行高溫貯藏，研究了煙草特有亞硝胺、生物堿和硝酸鹽含量的變化，旨在闡明烤煙葉片和煙梗TSNAs含量特點及與前體物的關(guān)系，為通過農(nóng)業(yè)措施有效降低烤煙TSNAs含量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究收集了2015年河南煙區(qū)、粵湘煙區(qū)、云貴煙區(qū)的C3F煙葉共30個樣品各2 kg。河南煙區(qū)品種為中煙100、K326；粵湘煙區(qū)品種為K326；云貴煙區(qū)品種為K326、紅花大金元、云煙87。

1.2 品種對比試驗

在河南洛陽設(shè)置品種試驗，參試品種共6個，分別為豫煙10號、豫煙6號、豫煙12號、NC89、中煙100、LY1306。試驗采取隨機(jī)區(qū)組排列，每個小區(qū)試驗面積200 m2。小區(qū)分3次重復(fù)，移栽規(guī)格100 cm×60 cm，種植密度16500株/hm2施氮量為52.5kg/hm2。均按當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)方法進(jìn)行栽培管理和烘烤。

1.3 高溫處理試驗

將貴州畢納一號、河南中煙100、云南紅大中部葉葉片和煙梗每個樣品取兩份，每份稱取20 g。一份置于恒定的50 ℃環(huán)境內(nèi)處理15 d，一份置于恒定的10℃環(huán)境內(nèi)處理15 d作為對照。

1.4 測定方法

1.4.1 生物堿： 200 mg樣品在堿性條件下，用甲基叔丁基醚（MTBE）提取生物堿，通過氣相色譜-氫火焰離子化檢測器（GC-FID）(Agilent 7890A，Agilent Technologies，USA) 定量分析檢測其中5種生物堿的含量，具體參照J(rèn)ack 和Bush的方法[16]。

1.4.2 硝酸鹽：用1%的醋酸溶液提取煙葉中的NO3-，然后用鋅粉在一定的pH值下將NO3-還原為NO2-，NO2-與對氨基苯磺酸和α-萘胺發(fā)生重氮化-偶聯(lián)反應(yīng)，生成紅色偶氮物質(zhì)，在540 nm下，用721分光光度計予以測定[17]。

1.4.3 TSNA：樣品均由上海煙草集團(tuán)北京卷煙廠進(jìn)行測定。測定方法為在線SPE-液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（SPE-LC-MS/MS） 法（SPE-LC：Spark Holland,Symbiosis (Pico)；MS/MS：AB Sciex triple quad 5500）。稱取1.0 g煙樣，將其放入50 mL錐形瓶中，加入40 μL 4種氘代TSNAs（內(nèi)標(biāo)）溶液（5 000 ng/mL）和30 mL 100 mmol/L乙酸銨水溶液，在室溫下用振蕩器（200 r/min）萃取60 min，萃取液過0. 45 μm水相濾膜后使用LC-MS/MS檢測TSNAs含量[18]。NNN、NNK、NAT和NAB含量之和即為TSNAs總量。

1.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計方法

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22 統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析和相關(guān)分析，由LSD法分析均值差異的顯著性，顯著水平P＜0.05，以a、b、c表示其差異性，數(shù)字后不含有相同字母表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義；采用Excel 2007軟件繪圖制表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同烤煙葉片和煙梗TSNAs及前體物含量分析

2.1.1 烤煙葉片和煙梗TSNAs及其前體物含量分析

將粵湘、河南、云貴產(chǎn)區(qū)的烤煙葉片、煙梗的TSNAs含量進(jìn)行綜合分析(表1)，發(fā)現(xiàn)烘烤結(jié)束后的葉片中TSNAs含量顯著高于煙梗，葉片TSNAs含量平均值為124.90 ng/g，煙梗平均含量為23.05 ng/g。四種特有亞硝胺在葉片和煙梗中所占的比例有所不同，在葉片中NNN所占比例較大，NAB含量較少；煙梗中NNK的含量較高，NAB的含量較低。從表1也可以看出葉片和煙梗不同樣品間TSNAs含量的變化范圍比較大。

對各地烤煙葉片和煙梗的生物堿和硝酸鹽進(jìn)行測定（表2），通過分析葉片和煙梗中硝酸鹽的含量可知，煙梗中硝酸鹽的含量遠(yuǎn)高于葉片。在葉片和煙梗中生物堿和硝酸鹽的變異系數(shù)相比都表現(xiàn)為硝酸鹽的變異系數(shù)較大。生物堿在葉片和煙梗中所占的比例都表現(xiàn)為煙堿＞新煙草堿＞降煙堿＞假木賊堿，其中煙堿在葉片和煙梗中含量較高，假木賊堿含量較低。葉片中生物堿的含量明顯高于煙梗。

表1 烤煙葉片和煙梗TSNAs含量變異性分析Tab.1 Variance analysis of TSNAs content in fl ue-cured tobacco lamina and midrib

表2 烤煙葉片和煙梗TSNAs前體物含量變異性分析Tab.2 Analysis of the variation of TSNAs precursor content in fl ue-cured tobacco lamina and midrib

2.1.2 不同產(chǎn)區(qū)烤煙TSNAs及前體物含量差異性分析

通過對不同產(chǎn)區(qū)烤煙TSNAs及其前體物含量的匯總分析（表3），發(fā)現(xiàn)各產(chǎn)區(qū)中葉片TSNAs含量粵湘＞河南 ＞云貴，且各地區(qū)之間達(dá)到極顯著差異；煙梗中TSNAs含量粵湘＞河南＞云貴。

三個產(chǎn)區(qū)中葉片生物堿的含量粵湘＞河南＞云貴，粵湘煙區(qū)與河南、云貴煙區(qū)達(dá)到顯著差異；三個產(chǎn)區(qū)之間煙梗的硝酸鹽含量都達(dá)到顯著差異。

2.1.3 不同品種間烤煙TSNAs及前體物含量差異分析

不同品種葉片中TSNAs含量達(dá)到顯著差異，參見表4。根據(jù)同一地區(qū)不同品種之間TSNAs含量和前體物含量的差異，降低TSNAs含量可以從烤煙品種入手。

表3 不同產(chǎn)區(qū)烤煙TSNAs及前體物含量分析Tab. 3 Analysis on the content of TSNAs and precursor in fl ue-cured tobacco from different producing areas

表4 河南洛陽不同品種間TSNAs及其前體物含量的差異性分析Tab. 4Analysis on the difference of the content of TSNAs and its precursor in different varieties in the region of Henan

2.1.4 不同部位間烤煙TSNAs及前體物含量差異性分析

表5表明云南紅大各部位葉片、主脈、支脈之間TSNAs、生物堿和硝酸鹽含量存在差異，三個部位煙葉中TSNAs含量都表現(xiàn)為葉片＞支脈＞主脈，其中上部葉和下部葉之間TSNAs含量達(dá)到顯著差異水平，生物堿含量也表現(xiàn)出相同規(guī)律，而硝酸鹽含量則表現(xiàn)為主脈＞支脈＞葉片。不同品種、不同部位間TSNAs含量達(dá)到顯著差異而地區(qū)間則達(dá)到極顯著差異，由此可知地區(qū)間的差異大于品種和部位。

表5 葉片、支脈、主脈TSNAs及前體物含量分析Tab. 5 Analysis of leaf, branch and stem of TSNAs and precursor content

2.2 初烤煙葉TSNAs含量與生物堿、硝酸鹽含量相關(guān)性分析

各地烤煙樣品的相關(guān)分析表明，初烤煙葉葉片和煙梗樣品的TSNAs含量與生物堿含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，而硝酸鹽含量與TSNAs含量為顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（表6）。因此葉片和煙梗TSNAs的差異可能主要與生物堿的差異有關(guān)。TSNAs含量與生物堿的相關(guān)系數(shù)較高，表明初烤煙葉TSNAs含量與其前體物生物堿含量的關(guān)系較大。分別對煙葉和煙梗TSNAs含量與前體物關(guān)系進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)其相關(guān)性小于上述煙葉和煙梗合并進(jìn)行的相關(guān)性，其中葉片總TSNAs與生物堿和硝態(tài)氮的相關(guān)系數(shù)分別為0.27和0.19，煙梗總TSNAs與生物堿和硝態(tài)氮的相關(guān)系數(shù)分別為0.59和0.31。

表6 TSNAs含量與生物堿、硝酸鹽含量的相關(guān)分析Tab. 6 Correlation analysis between TSNAs content and nicotine and nitrate content

2.3 高溫處理對葉片和煙梗TSNAs含量的影響

將貴州畢納一號、河南中煙100、云南紅大葉片、煙梗分別進(jìn)行15 d高溫處理，結(jié)果如圖1、圖2所示，三個地區(qū)葉片、煙梗經(jīng)高溫貯藏后TSNAs含量均有不同程度增加，增加量都達(dá)到顯著水平，其中煙梗增加倍數(shù)明顯多于葉片。

經(jīng)高溫處理后葉片的TSNAs含量與低溫對照相比都達(dá)到顯著差異，煙梗則達(dá)到極顯著差異，其中貴州畢納一號煙梗經(jīng)高溫處理后TSNAs含量高于葉片。三種葉片經(jīng)高溫處理后平均增加30.55%；三種煙梗平均增加229.25%，其中貴州畢納一號煙梗增加量最大為213.44 ng/g，提高384.83%。王瑞云等[19]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)高溫處理后較高的硝酸鹽含量加速了TSNAs的形成。由此看出在高溫貯藏過程中煙梗TSNAs的增加值遠(yuǎn)大于葉片，而煙梗硝酸鹽含量遠(yuǎn)高于葉片，可以推測在貯藏過程中硝酸鹽對TSNAs形成有影響。

圖1 高溫處理對烤煙葉片TSNAs含量的影響Fig.1 Effect of high temperature treatment in the fl ue-cured tobacco leaves on TSNAs formation

圖2 高溫處理對烤煙煙梗TSNAs含量的影響Fig. 2 Effect of high temperature treatment in the fl ue-cured tobacco stems on TSNAs formation

3 討論

本研究表明我國不同煙區(qū)烤煙初烤煙葉葉片和煙梗的TSNAs含量差異極顯著，這與煙區(qū)土壤、施肥等條件不同導(dǎo)致煙葉性狀和化學(xué)成分差異有密切關(guān)系。同一產(chǎn)區(qū)不同品種間TSNAs含量也達(dá)到顯著差異。余義文等[20]研究也表明烤煙不同品種間TSNAs存在較大差異。

初烤煙葉中TSNAs含量測定結(jié)果表明，葉片中TSNAs含量顯著高于煙梗，這與葉片和煙梗中TSNAs前體物含量密切相關(guān)。比較葉片和煙梗中前體物含量可以發(fā)現(xiàn)，葉片中生物堿的含量大于煙梗，而煙梗中硝酸鹽的含量明顯高于葉片；相關(guān)分析表明，烘烤后煙葉樣品的TSNAs含量與生物堿含量正相關(guān)顯著，而與硝態(tài)氮含量呈負(fù)相關(guān)，說明葉片中較高的TSNAs含量可能主要歸因于葉片中較高的生物堿含量，而受硝態(tài)氮影響較小。經(jīng)高溫貯藏后，葉片和煙梗中TSNAs含量顯著增加，但煙梗中TSNAs的增加量明顯高于葉片，這與煙梗中硝態(tài)氮含量較高密切相關(guān)，在貯藏過程中生物堿的含量相對較為穩(wěn)定，而硝態(tài)氮則易在高溫條件下產(chǎn)生氣態(tài)氮氧化物，進(jìn)而與生物堿反應(yīng)生成TSNAs，孫榅淑等[21]研究表明煙葉硝態(tài)氮含量與高溫貯藏過程中TSNAs的形成關(guān)系密切,所以硝態(tài)氮含量較高的煙梗更利于TSNAs的形成。由于煙葉烘烤和貯藏階段都是TSNAs形成的重要階段，且與前體物含量密切相關(guān)，因此，通過生態(tài)、品種、農(nóng)藝措施相結(jié)合控制TSNAs前體物含量及控制貯藏環(huán)境溫濕度可以有效降低煙草特有亞硝胺形成和積累。

4 結(jié)論

1、不同地區(qū)、品種和部位間初烤烤煙葉片TSNAs含量均有顯著差異，其中地區(qū)間的差異達(dá)到極顯著差異；不同部位間煙葉TSNAs含量均表現(xiàn)為葉片＞支脈＞主脈；2、初烤煙葉葉片生物堿含量高于煙梗，煙梗硝酸含量顯著高于葉片，TSNAs含量與生物堿相關(guān)性相對較高；3、經(jīng)高溫處理后煙梗TSNAs增加比例顯著高于葉片，高溫貯藏過程中TSNAs形成可能與硝酸鹽含量更為密切。降低烤煙TSNAs含量必須從降低前體物含量和控制貯藏環(huán)境兩方面入手，特別是煙梗應(yīng)避免在較高溫度下貯藏。

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：JIN Tong，SHI Hongzhi，ZHOU Jun, et al. TSNAs contents in lamina and midrib of fl ue-cured tobacco and their changes after high temperature storage [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2017, 23(2)

*Corresponding author.Email：shihongzhi88@163.com

TSNAs contents in lamina and midrib of fl ue-cured tobacco and their changes after high temperature storage

JIN Tong1，SHI Hongzhi1*，ZHOU Jun2，BAI Ruoshi2，YANG Huijuan1, ZHAO Shimin3，WANG Jun1
1 Tobacco Cultivation Key Laboratory of Tobacco Industry/Tobacco Harm Reduction Research Center, Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002, China;2 Beijing Cigarette Factory, Beijing 100024, China；3 Henan Luoyang Tobacco Company, Luoyang 471000, Henan, China

Thirty fl ue-cured tobacco samples from Henan, Yunnan, Guizhou, Hunan and Guangdong were collected and a variety test was set up in Luoyang, Henan province to investigate the relationship between TSNAs content and their precursors in fl ue-cured tobacco lamina and midrib, and e ff ect of geographic location, variety and leaf position on this relationship. Flue-cured tobacco lamina and midrib were stored at 50℃ to study the e ff ect of high temperature storage on contents of TSNAs, alkaloid and nitrate. Results showed that content of TSNAs in fl ue-cured tobacco lamina was signi fi cantly higher than in midrib, and the highest proportion in lamina was NNN, whereas the highest percentage in midrib was NNK. Total alkaloids in lamina were about 4.7 times higher than in midrib. Nitrate content in midrib was higher than in lamina. TSNAs content in lamina varies signi fi cantly between regions, with the highest content in Hunan and Guangdong.Significant differences were found in TSNAs content of lamina between varieties, and the changes of TSNAs were closely related with alkaloid content. Lamina had the highest TSNAs content, followed by side-vein and mid-vein. Correlation analysis revealed that accumulation of TSNAs in tobacco was mainly a ff ected by amount of alkaloid accumulated during fl ue-curing. TSNAs content of midrib and lamina under 50℃ storage increased 229.2% and 30.6%, respectively, compared with that in low temperature, suggesting that nitrate levels had greater in fl uence on TSNAs formation during high temperature storage.

fl ue-cured tobacco; TSNAs; midrib; lamina; nitrate; high temperature storage

靳彤，史宏志，周駿，等. 不同初烤煙葉葉片和煙梗TSNAs含量及高溫貯藏后的變化研究，2017,23（2）

國家煙草專賣局減害重大專項項目：110201301022（JH-3）

靳 彤(1991—)，碩士研究生，主要從事煙草栽培生理研究，Tel:0371-63555487，Email：wo.jin.tong@163.com

史宏志(1963—)，教授，博士，博士研究生導(dǎo)師，從事煙草栽培生理研究，Tel: 0371-63555487， Email：shihongzhi88@163.com

2016-08-01；< class="emphasis_bold">網(wǎng)絡(luò)出版日期：

日期：2017-02-13