李艷華，張洪映，魏躍偉，崔紅

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，煙草學(xué)院，鄭州市文化路95號(hào) 450002

典型烤煙品種腺毛形態(tài)及分泌特性比較分析

李艷華，張洪映，魏躍偉，崔紅

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，煙草學(xué)院，鄭州市文化路95號(hào) 450002

為探討烤煙葉面化學(xué)特征及其形成機(jī)制，本文以K326、紅花大金元、中煙100、翠碧1號(hào)、豫煙11等代表性烤煙品種為試驗(yàn)材料，采用超景深顯微技術(shù)、GC-MS分析檢測(cè)技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)葉面腺毛形態(tài)、葉面化學(xué)成分以及腺毛分泌物合成關(guān)鍵基因表達(dá)進(jìn)行了比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）烤煙腺毛由長(zhǎng)柄分泌型腺毛、短柄分泌型腺毛和非分泌保護(hù)毛等不同類型組成，翠碧1號(hào)和豫煙11中分泌型腺毛含量較高，而中煙100中非分泌型腺毛相對(duì)豐富。（2）西柏烷類化合物是烤煙葉面的主要化學(xué)成分，以K326中的含量為最高；賴百當(dāng)類化合物在烤煙中含量極少，但豫煙11中順冷杉醇和賴百當(dāng)二醇含量較高。（3）西柏烷類合成酶關(guān)鍵基因CYC和CYP71D16在K326中表達(dá)活躍，賴百當(dāng)合成酶關(guān)鍵基因CPS2在豫煙11中的表達(dá)量明顯高于其它品種。不同烤煙品種之間葉面腺毛形態(tài)、基因表達(dá)及分泌物含量所存在的明顯差異，可能與品種特色密切相關(guān)。

烤煙；腺毛；分泌物；二萜化合物；基因表達(dá)

煙草葉面化學(xué)（tobacco surface chemical）的概念由美國(guó)科學(xué)家Severson在1985年首次提出，明確了煙葉表面化學(xué)成分由二萜化合物、糖酯、蠟質(zhì)、微量元素、揮發(fā)性化合物等組成[1]。其中，二萜化合物是葉面化學(xué)的主要組成成分，在葉面腺毛中特異性合成[2]，并與煙株抗性及香氣品質(zhì)密切相關(guān)[3]。

烤煙是支撐“中式卷煙”的核心原料。薛曉明等[4]對(duì)G28、K346、K326等10個(gè)烤煙品種進(jìn)行了葉面顯微觀察，發(fā)現(xiàn)不同品種成熟期葉片葉面腺毛密度具有顯著差異；吳云平等[5]對(duì)云煙85、K326、貴煙201和南江3號(hào)等葉面物質(zhì)的檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，不同品種間葉面提取物總量和組分各不相同。而且，同一烤煙品種K326在不同的水分[6]、光照[7]、施肥[8-9]及生態(tài)環(huán)境[10]等條件下，其腺毛形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及分泌物積累也發(fā)生明顯的改變，腺毛基因表達(dá)譜也因生態(tài)區(qū)的不同而表現(xiàn)出較大的差異[11]。以上研究表明，烤煙腺毛的發(fā)育及物質(zhì)代謝受到遺傳、栽培和環(huán)境條件的綜合影響。目前研究缺乏我國(guó)重要烤煙品種葉面腺毛形態(tài)特征和分泌特性缺乏之間的比較，對(duì)腺毛物質(zhì)代謝分子機(jī)制認(rèn)識(shí)不清，使得針對(duì)葉面化學(xué)特性的遺傳改良仍缺乏理論支撐。

本研究以廣泛適用于我國(guó)主要植煙區(qū)的優(yōu)良引進(jìn)品種K326、適用于云、貴、川等清香型煙區(qū)的紅花大金元、適用于黃、淮等濃香型產(chǎn)區(qū)的中煙100、福建煙區(qū)特色品種翠碧1號(hào)以及特香型品種豫煙11為材料，在相同栽培條件和生態(tài)環(huán)境下，對(duì)各品種葉面腺毛形態(tài)特征、葉面化學(xué)組分及含量、以及二萜化合物生物合成關(guān)鍵基因的表達(dá)水平進(jìn)行了比較分析，旨在解析我國(guó)典型烤煙品種的葉面化學(xué)特性及形成機(jī)制，為烤煙葉面化學(xué)成分的定向和高效改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 材料

K326、紅花大金元、中煙100、翠碧1號(hào)和豫煙11等5個(gè)烤煙品種包衣種子由河南農(nóng)科院許昌研究所育種室提供。2015年3月漂浮育苗，5月6日移栽于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)許昌校區(qū)煙草試驗(yàn)基地，按照優(yōu)質(zhì)烤煙栽培規(guī)程進(jìn)行種植和管理。

1.2 葉面腺毛形態(tài)觀察

在煙株旺長(zhǎng)期選取葉長(zhǎng)約10 cm的頂葉，用0.2%（w/v）羅丹明B 水溶液染色60 min，將染色后的葉片在裝有清水的4個(gè)燒杯中依次浸泡5 s，去除未結(jié)合的羅丹明B， 通風(fēng)條件下自然晾干，在葉片中部沿主脈兩側(cè)1 cm處剪取6×8 mm組織塊，葉面朝上置于VHX-5000超景深顯微鏡下（日本基恩士公司）進(jìn)行葉片上表面腺毛的形態(tài)觀察和腺毛密度統(tǒng)計(jì)。每個(gè)樣本取3個(gè)葉片，每個(gè)葉片觀察3個(gè)視野計(jì)數(shù)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。

1.3 葉面化學(xué)成分分析

在成熟期取中部葉（10～12葉位） 進(jìn)行葉面分泌物的提取和測(cè)定。樣品的制備及前處理參考韓錦峰等[12]的葉圓片法。每個(gè)品種選取5株長(zhǎng)勢(shì)一致的煙株，取成熟的中部葉沿中脈兩側(cè)截取直徑為10 cm的葉圓片，每個(gè)煙株選取4片葉圓片，每個(gè)樣本共計(jì)20個(gè)圓片，分別在二氯甲烷溶液中浸提。每個(gè)葉圓片浸提8次，每次2 s。在浸提液中加入內(nèi)標(biāo)（2.020 mg/mL的蔗糖八乙酸酯和2.542 mg/mL的正十七烷醇的混合溶液）1 mL，混合均勻，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，硅烷化處理后，利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀TRACE GC ULTRA–DSQⅡMS（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）進(jìn)行檢測(cè)，儀器條件與王霄龍[13]所用相同。通過(guò)NIST12譜庫(kù)檢索定性，并結(jié)合Severson[14]的研究結(jié)果對(duì)二萜化合物進(jìn)行鑒定，采用內(nèi)標(biāo)法定量（相對(duì)校正因子為1）。

1.4 RT-PCR分析

在煙株旺長(zhǎng)期，取長(zhǎng)約10 cm左右的頂葉進(jìn)行RT-PCR分析。使用Total RNA puri fi cation kit（美國(guó)聯(lián)川科技公司）進(jìn)行葉片RNA提取，利用PrimerScript RT reagent Kit（日本寶生物公司）進(jìn)行cDNA合成。使用 Premier Prime 5.0 軟件，根據(jù)Genbank 發(fā)布的 CYC、CYP71D16、CPS2、ABS 和L25（作為內(nèi)參基因）序列設(shè)計(jì)各基因擴(kuò)增引物，如表1所示。利用LightCycler? 480 SYBR Green I Master ( 瑞士羅氏公司 )在 LightCycler? 480 Ⅱ型熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司)上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系：2× LightCycler? 480 SYBR Green I Master，5 μl；10 μM Forward primer，0.2 μl；10μM Reverse primer，0.2 μl；cDNA，1 μl ；Nuclease-free H2O，3.6 μl。PCR 程序?yàn)椋?5℃ 10 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后利用熔解曲線檢測(cè)產(chǎn)物特異性：從60℃緩慢升溫至97℃，每℃采集5次熒光信號(hào)。

表1 擴(kuò)增引物序列Tab.1 Primer sequence

1.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPSv7.05版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，由新復(fù)極差法分析均值差異的顯著性, 顯著性水平P ＜0.05，以a、b、c表示其差異性，顯著性水平P ＜0.01，以A、B、C表示其差異性，數(shù)字后不含有相同字母表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；采用Excel 2007軟件繪圖制表。

2 研究結(jié)果

2.1 葉面腺毛形態(tài)分析

采用超景深顯微鏡技術(shù)進(jìn)行各供試烤煙品種葉面腺毛的形態(tài)觀察。由圖1可以看出，烤煙腺毛屬于混合型，各品種葉面腺毛均由長(zhǎng)柄分泌型腺毛、短柄分泌型腺毛及保護(hù)毛三種類型組成：長(zhǎng)柄分泌型腺毛由多細(xì)胞腺柄和1至多個(gè)細(xì)胞的腺頭組成，短柄分泌型腺毛由一個(gè)柄細(xì)胞和四個(gè)頂生的腺頭細(xì)胞組成，保護(hù)毛由多細(xì)胞組成，頂端成矛狀，無(wú)腺頭細(xì)胞。羅丹明與糖酯發(fā)生化學(xué)反應(yīng)后形成玫瑰紅色的復(fù)合物，根據(jù)顏色的深淺可進(jìn)行糖酯含量的快速檢測(cè)。圖1顯示，不同類型腺毛對(duì)羅丹明的染色反應(yīng)各不相同。長(zhǎng)柄分泌型腺毛和短柄分泌型腺毛的腺頭部位皆可被羅丹明染成紅色，翠碧1號(hào)、豫煙11、K326著色較為明顯，中煙100和紅花大金元染色較淺。保護(hù)毛無(wú)顯色反應(yīng)，這可能與其缺乏腺頭細(xì)胞有關(guān)。

圖1 不同烤煙品種葉面腺毛形態(tài)觀察Fig. 1 Observation of foliar trichome of different fl ue-cured tobacco varieties

對(duì)5個(gè)品種腺毛密度及各類型所占比例進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析（表2）。從腺毛總密度來(lái)看，豫煙11和翠碧1號(hào)最高，紅大和K326較低。從不同腺毛類型來(lái)看，長(zhǎng)柄分泌型腺毛在翠碧1號(hào)和豫煙11中含量依然較高，在K326、紅花大金元和中煙100三個(gè)品種中含量相近；短柄分泌型腺毛在翠碧1號(hào)中密度最高，其次是豫煙11和K326；保護(hù)毛在中煙100中的密度明顯高于其它4個(gè)品種。從同一品種來(lái)看，K326、翠碧1號(hào)、紅花大金元3品種中，短柄分泌型腺毛所占比例較高， 豫煙11中長(zhǎng)柄分泌型腺毛所占比例較高，而中煙100中保護(hù)毛占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。

2.2 葉面化學(xué)成分分析

利用二氯甲烷對(duì)成熟中部葉進(jìn)行葉面化學(xué)成分萃取，并進(jìn)行GC/MS檢測(cè)（表3）?？梢钥闯?，烤煙葉面分泌物主要包含二萜化合物、烷烴和糖酯3大類。其中，以二萜化合物含量較高，且品種間變化幅度較大。

對(duì)5個(gè)烤煙品種葉面二萜化合物的分析結(jié)果如圖2?？梢钥闯?，烤煙中二萜化合物包含西柏烷化合物和賴百當(dāng)化合物兩大類。西柏烷類化合物含量較高，其中CBT-diol含量占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，而CBT-ol含量相對(duì)較低。品種間相比較，K326西柏烷類化合物含量最高，其次為豫煙11、紅花大金元，翠碧1號(hào)和中煙100中含量較低。賴百當(dāng)化合物在烤煙中含量較低，主要包括 Cis-abienol和 Labdenediol。Cis-abienol雖在5個(gè)品種中都能被檢測(cè)到，但在豫煙11中含量明顯較高；Labdenediol卻僅在豫煙11中有少量存在，在其它四個(gè)品種中均未被檢測(cè)到。這表明與其它烤煙品種相比，豫煙11的二萜生物合成代謝具有明顯特性。

表2 不同烤煙品種腺毛密度和比例分析Tab.2 Densities and percentages of trichomes of different fl ue-cured tobacco varieties

表3 不同烤煙品種葉面化學(xué)成分分析Tab.3 Leaf surface chemical analysis of different fl ue-cured tobacco varieties

圖2 不同烤煙品種葉面二萜化合物檢測(cè)分析Fig. 2 Diterpenoid analysis of different fl ue-cured tobacco varieties

2.3 二萜生物合成關(guān)鍵基因表達(dá)分析

采用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)5個(gè)烤煙品種幼葉中二萜生物合成關(guān)鍵基因表達(dá)進(jìn)行了比較分析（圖3），可以看出，西柏烷生物合成的兩個(gè)關(guān)鍵基因CYC（西柏三烯一醇合成酶基因）和CYP71D16（西柏三烯二醇合成酶基因）在各檢測(cè)品種都有較高水平的表達(dá)，以K326的表達(dá)量為最高，中煙100和翠碧1號(hào)表達(dá)量較低。賴百當(dāng)生物合成關(guān)鍵基因ABS（順冷杉醇合成酶基因）在各品種中都表達(dá)，但其上游基因CPS2（卡巴基焦磷酸合成酶基因）僅在豫煙11中高表達(dá)，在其余4個(gè)品種中表達(dá)水平極低。這可能是導(dǎo)致賴百當(dāng)化合物含量在大部分烤煙品種較低，而在豫煙11中較高的關(guān)鍵原因。

圖3 不同烤煙品種二萜生物合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)比較分析Fig. 3 Relative expression analysis of key genes related to diterpenoid biosynthesis of different fl ue-cured tobacco varieties

3 討論與結(jié)論

植物腺毛按分泌特性可分為分泌型和非分泌型兩大類。以擬南芥[15]為代表的非分泌型腺毛構(gòu)成了植株與環(huán)境間的物理屏障，參與植物對(duì)逆境防御反應(yīng)；薄荷[16]、青蒿[17]等分泌型腺毛具有次生代謝物質(zhì)合成和分泌能力，具有可觀的商業(yè)價(jià)值。煙草既有分泌型腺毛也有非分泌型腺毛，屬于混合型。長(zhǎng)柄分泌型腺毛是西柏烷二萜化合物合成和分泌的主要場(chǎng)所[18]，短柄分泌型腺毛是合成和分泌煙草葉面抗性蛋白（T-phylloplain）的主要部位[19]，而保護(hù)毛無(wú)腺頭細(xì)胞，不具備分泌能力[15]。在供試的5個(gè)烤煙品種中，不同類型腺毛所占比例各不同。豫煙11中長(zhǎng)柄分泌型腺毛所占比例較高，K326中短柄分泌型腺毛所占比例較高，而中煙100中保護(hù)毛所占比例較高。雖然，目前對(duì)煙草腺毛發(fā)生的分子機(jī)制還知之甚少[20]，但由此可以推測(cè)，不同烤煙品種中控制不同類型腺毛發(fā)生的基因在表達(dá)豐度上具有一定差異。

煙草腺毛密度隨葉片發(fā)育時(shí)期、栽培措施及生態(tài)區(qū)域的不同而不同[3]。因而，在對(duì)不同煙草品種腺毛密度的比較研究中，選擇合適的試驗(yàn)條件及取樣方式尤為重要。楊鐵釗等[21]曾提出，煙草腺毛密度隨著葉片發(fā)育呈現(xiàn)大幅度的變化，在葉片發(fā)育成熟期趨于穩(wěn)定，是進(jìn)行腺毛密度研究的最適時(shí)期。以K326中部成熟葉片上表皮腺毛密度的相關(guān)研究為例：薛曉明等[4]在黑龍江對(duì)10個(gè)烤煙品種腺毛密度的比較研究中，K326腺毛密度為最低，僅2.33根/mm2；付玉蘭等[22]在云南對(duì)四個(gè)品種腺毛密度的比較研究中，K326則較高，達(dá)5.28根/mm2；而同樣是在云南，張亞婕[23]等報(bào)道K326成熟期中部葉上表皮腺毛密度高達(dá)10.07根/mm2。這說(shuō)明葉片的成熟過(guò)程受到光、溫、水、肥等多種因素的影響，以成熟葉片為材料進(jìn)行品種之間腺毛密度的比較研究，將難以避免栽培及環(huán)境因素所帶來(lái)的影響。鑒于此，本文以幼葉為材料進(jìn)行不同品種腺毛密度的比較研究，以求最大限度地反映出品種的遺傳特性。

腺毛密度是腺毛分泌物積累的基礎(chǔ)條件。但在本研究中，翠碧1號(hào)長(zhǎng)柄腺毛密度最高，其類西柏烷化合物含量卻明顯較低；而類西柏烷化合物含量最高的K326，其長(zhǎng)柄腺毛密度也比較低。這表明幼葉期腺毛密度和成熟期葉面分泌物含量之間并無(wú)因果關(guān)系。李鵬飛等[24]曾報(bào)道，成熟葉片腺毛密度和葉面分泌物之間也非簡(jiǎn)單正相關(guān)。由此推測(cè)，腺毛分泌物含量是由腺毛密度和腺毛物質(zhì)代謝強(qiáng)度所共同決定的。為此，我們進(jìn)一步對(duì)不同品種幼葉的二萜代謝相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)分析。在腺毛密度較高的翠碧1號(hào)中，西柏烷化合物合成關(guān)鍵基因CYC和CYP71D16的表達(dá)量明顯偏低；而腺毛密度較低的K326中，這兩個(gè)基因的表達(dá)量保持在較高水平。該結(jié)果在轉(zhuǎn)錄水平證明，K326腺毛西柏烷化合物合成能力強(qiáng)于翠碧1號(hào)。這可能是導(dǎo)致K326葉面分泌物豐富的根本原因。

不同烤煙品種腺毛分泌物含量不同，其組分也存在較大差異。西柏三烯二醇是烤煙葉面化合物的主要成分，在不同品種中含量都較高。類賴百當(dāng)化合物在烤煙品種中含量較低，賴百當(dāng)二醇只在豫煙11中存在，順冷杉醇在幾個(gè)品種中都被檢測(cè)到有微量存在，而豫煙11的含量明顯較高。王冬等[25]對(duì)8306、12451、云煙87、豫煙11、中煙100等品種（系）的葉面化學(xué)成分進(jìn)行了分析，也發(fā)現(xiàn)豫煙11及其親本8306中西柏烷類化合物含量較高，但并未提到賴百當(dāng)類化合物在其中的存在。為進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果，我們對(duì)賴柏當(dāng)生物合成關(guān)鍵基因的表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然ABS基因在五個(gè)烤煙品種中都有不同程度的表達(dá)，但其上游基因CPS2，催化由GGPP向8-OH-CPP的轉(zhuǎn)化，則只在豫煙11中有較高的表達(dá)，在其它幾個(gè)烤煙品種中表達(dá)量極低。該結(jié)果不僅解析了豫煙11葉面化學(xué)特色形成的分子機(jī)制，也表明烤煙中賴百當(dāng)化合物的缺失與CPS2基因表達(dá)受阻密切相關(guān)，這與Sallaud等[26]的觀點(diǎn)相同。CPS2基因在賴百當(dāng)生物合成中所起的關(guān)鍵作用預(yù)示了其在煙草香氣分子改良中具有較大的應(yīng)用潛力。

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：LI Yanhua, ZHANG Hongying, WEI Yuewei, et al. Comparison analysis of trichome morphology and secretion of typical fl uecured tobacco varieties[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2017, 23(2)

*Corresponding author.Email：cuihonger_13@163.com

Comparison analysis of trichome morphology and secretion of typical fl ue-cured tobacco varieties

LI Yanhua, ZHANG Hongying, WEI Yuewei, CUI Hong*
College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China

To characterize the formation mechanism of tobacco trichome exudates, five representative flue-cured tobacco cultivars were studied in trichome morphology, leaf surface chemical components, and expression patterns of genes related to trichome exudates biosynthesis using super depth of fi eld microscopy, GC-MS analysis, and real-time fl uorescent quantitative PCR techniques，respectively.Results indicated that (1) Two leaf trichome types of fl ue-cured tobacco were identi fi ed, including glandular trichomes and non-glandular trichomes. The proportion of each type was different in these tobacco cultivars with glandular trichomes being more abundant and dense in “Cuibi1” and “Yuyan11” compared to other cultivars, while non-glandular trichomes were most abundant in “Zhongyan 100”. (2) Cembranoids were main compounds in tobacco trichome exudates. Among these cultivars, cembranoids were most abundant in “K326”. As the main trichome exudates of oriental tobacco, labdanoids were rarely detected in these fl ue-cured tobacco cultivars except “Yuyan11”. (3) Expression pattern analysis showed that the expression level of cembranoid biosynthetic related genes (CYC and CYP71D16) was high in “K326”. Meanwhile, labdanoids biosynthetic related genes (CPS2 and ABS) expressed strongly in “Yuyan 11”. These results provided new perspectives for tobacco breeding and metabolic engineering of trichome exudates.Keywords： fl ue-cured tobacco; trichome; secretion; diterpenoid ; gene expression

李艷華，張洪映，魏躍偉，等. 典型烤煙品種腺毛形態(tài)及分泌特性比較分析[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2017, 23（2）

中國(guó)煙草總公司基因組重大專項(xiàng)“煙草腺毛功能基因挖掘與分子調(diào)控研究”（110201401003 JY-03）

李艷華（1990—），碩士研究生，主要從事煙草生理生化研究，Tel: 0371-63558586，Email: lyhyhlyh@163.com

崔 紅（1966—），教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事煙草生物技術(shù)研究，Email:cuihonger_13@163.com

2015-09-18；< class="emphasis_bold">網(wǎng)絡(luò)出版日期：

日期：2017-02-13