王霖嬌，任學(xué)良，盛茂銀，杜家穎，溫培才

1 貴州師范大學(xué)，喀斯特研究院，貴州貴陽寶山北路180號 550001；2 國家喀斯特石漠化防治工程技術(shù)研究中心，貴州貴陽寶山北路180號 550001；3 貴州省煙草科學(xué)研究院，貴州貴陽云龍灘壩路29號 550081

具翼煙草(Nicotiana alata)核型、C帶與rDNA染色體定位研究

王霖嬌1,2，任學(xué)良3，盛茂銀1,2，杜家穎1，溫培才1

1 貴州師范大學(xué)，喀斯特研究院，貴州貴陽寶山北路180號 550001；2 國家喀斯特石漠化防治工程技術(shù)研究中心，貴州貴陽寶山北路180號 550001；3 貴州省煙草科學(xué)研究院，貴州貴陽云龍灘壩路29號 550081

采用去壁低滲法、BSG法和雙色熒光原位雜交技術(shù)，分別開展了具翼煙草(Nicotiana alata)的核型分析、C顯帶與45S和5S rDNA染色體定位研究。4個(gè)具翼煙草收集系根尖細(xì)胞有絲分裂中期染色體平均核型為2n = 2x = 12m + 6st，染色體臂比的變異幅度為1.14~4.22，平均臂比值為2.17，最長與最短染色體之比為2.16，屬2B型。C帶研究結(jié)果顯示，具翼煙草中期染色體C帶豐富，多態(tài)性良好，共顯帶25條，包括7條著絲粒帶、15條端帶和3條中間帶。45S和5S rDNA染色體定位研究結(jié)果顯示，具翼煙草根尖細(xì)胞有絲分裂中期染色體細(xì)胞相分別顯示了3對45S rDNA和2對5S rDNA基因位點(diǎn)信號，45S rDNA基因位點(diǎn)分別位于I S、III S、V L上，2對5S rDNA基因位點(diǎn)分別位于I L、IV S上(字母L和S分別代表染色體長臂和短臂，羅馬數(shù)字代表同源染色體序號)。在I號同源染色體上同時(shí)存在45S和5S rDNA基因位點(diǎn)。研究結(jié)果對煙草屬系統(tǒng)起源、遺傳進(jìn)化以及遺傳育種等領(lǐng)域的進(jìn)一步研究具有重要的參考價(jià)值。

煙草；核型；染色體；熒光原位雜交；C帶

煙草屬(Nicotiana L.)植物種類眾多，全世界分布約70余種，系茄科植物中第5大家族[1]，Knapp將其分為13個(gè)組[1]。煙草在全世界廣泛分布，各式各樣的生境孕育了多種多樣的野生煙草種質(zhì)資源[2-5]。這些野生種質(zhì)長期在野外生境條件下生存、繁育、進(jìn)化，形成了抗病、抗蟲、抗旱、抗凍等特性，蘊(yùn)含著栽培種質(zhì)中不具備的大量優(yōu)質(zhì)基因、高產(chǎn)基因和抗逆基因[6]，是煙草遺傳育種和種質(zhì)創(chuàng)新的重要資源[4-5]。具翼煙草(N. alata Link and Otto)是重要的煙草野生種，有限的多年生草本，高0.6~1.5m，全體被粘毛，原產(chǎn)墨西哥和烏拉圭，中國很多地方都有栽培。耐旱，抗病，抗逆性突出，花色艷麗，氣味芳香，基因組小，是煙草種質(zhì)創(chuàng)新、拓寬煙草遺傳背景研究的重要野生種質(zhì)資源[2]。

核型、染色體顯帶等細(xì)胞學(xué)研究是開展物種系統(tǒng)進(jìn)化、遺傳育種、種質(zhì)創(chuàng)新等研究的重要基礎(chǔ)[7]。煙草屬植物核型分析方面雖有一些研究報(bào)道[8-10]，由于工作開展得較早，對染色體分類采用類似兩點(diǎn)二區(qū)系統(tǒng)(長臂：短臂等于1:1者為m，>1:1<3:1者為sm，>3:1者為st，該命名系統(tǒng)比較粗放，現(xiàn)已廢除)[11]，加之煙草染色體數(shù)目復(fù)雜(2n=18, 20, 24, 28, 32, 36,38, 40, 42, 44, 46, 48)[11-15]，種子和根尖較小，操作困難，限于當(dāng)時(shí)的技術(shù)水平，大部分結(jié)果欠準(zhǔn)確。而且這些核型分析主要集中在栽培煙草物種[8,11-12]，野生煙草未見報(bào)道。具翼煙草的核型分析、C顯帶以及45S rDNA和5S rDNA的FISH(熒光原位雜交)染色體定位更是空白。開展具翼煙草的核型分析、C顯帶和rDNA染色體物理定位等細(xì)胞學(xué)研究對進(jìn)一步闡明煙草屬植物種間親緣關(guān)系及其系統(tǒng)演化、煙草遺傳育種與種質(zhì)創(chuàng)新具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗(yàn)材料野生煙草種具翼煙草4個(gè)收集系(9001-10，9201-5，9255-6，9262-6)均來自于貴州省煙草科學(xué)研究院種質(zhì)資源保育中心。

1.2 染色體制片

具翼煙草種子在40℃蒸餾水浸泡50 min后，播種在潮濕濾紙上，置于培養(yǎng)皿內(nèi)，27℃下萌發(fā)；待根長至0.5~1 cm時(shí)，切下，放入飽和α-溴奈溶液室溫預(yù)處理4~5 h；蒸餾水清洗3次，經(jīng)卡諾I氏(乙醇:冰醋酸=3:1)固定液固定過夜；蒸餾水清洗3次后，放入蒸餾水前低滲1 h，用3%纖維素-果膠酶混合液37℃下處理2.5 h，清洗3次后，放入蒸餾水后低滲1 h；涂片，晾干，鏡檢備用。

1.3 核型分析

將上述去壁低滲法制成的染色體制片空氣干燥1 d后，3% Giemsa染液染色1 h，沖洗干凈、火焰干燥，Olympus BX51顯微鏡鏡檢、照相，進(jìn)行核型分析，具體方法參照李懋學(xué)和陳瑞陽[16]的分析方法。染色體命名依據(jù)臂比(臂比=長臂長度/短臂長度)，按照Levan等[17]的命名規(guī)則進(jìn)行命名。按Stebbin[18]的核型分類標(biāo)準(zhǔn)對染色體核型進(jìn)行分類。染色體相對長度(%)=染色體實(shí)際測量長度÷染色體組實(shí)際測量總長度×100。

1.4 C帶顯帶與分析

將上述染色體制片進(jìn)行Giemsa C帶顯帶。顯帶方法如下：常溫下飽和Ba(OH)2溶液處理20 min，蒸餾水水洗后，2×SSC 60℃處理3 h，水洗、氣干，3% Giemsa染色50 min。蒸餾水沖洗，氣干，選取染色體分散較好、顯帶清晰的細(xì)胞相照相。參照李國珍[19]的方法對染色體Giemsa C帶顯帶的類型、數(shù)目以及組成進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 45S和5S rDNA染色體定位

1.5.1 探針標(biāo)記

含有45S和5S rDNA序列的pBluescripty來源于日本京都大學(xué)植物資源與分子遺傳實(shí)驗(yàn)中心。45S rDNA片段長為9.1 kb，包括18S、5.8S、25S編碼區(qū)和非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列，5S rDNA片段長450 bp。依據(jù)生工生物工程(上海)有限公司缺刻平移方法進(jìn)行探針標(biāo)記，45S rDNA用地高辛(Digoxigenin-dUTP)標(biāo)記，5S rDNA用生物素(Biotin-dUTP)標(biāo)記。

1.5.2 原位雜交及檢測

參照盛茂銀[20]的方法稍加改進(jìn)。雜交液的配制及探針變性：每張片子大約需要30 μL雜交液，含50%的去離子甲酰胺(美國Sigma公司)，10%的硫酸葡聚糖(美國Sigma 公司)，2 × SSC，50 mg/L ssDNA，2 mg/L 的探針DNA，75℃變性5 min，待用。

染色體變性及雜交：將染色體制片置于80℃變性液中變性3 min，在-20℃下依次用75%、95%、和100%的酒精脫水5 min，氣干后，滴加雜交液，加22 mm × 22 mm蓋玻片，于保濕皿中37℃雜交12~48 h。

原位雜交信號的熒光檢測：2 × SSC在室溫及37℃各洗10 min，1 × PBS室溫洗1次，5 min。加入抗體，37℃下雜交50 min，去掉蓋破片，再用1 ×PBS溫室洗3次，每次5min。

1.5.3 圖像檢測及分析

染色體制片用加入抗淬滅劑Vectorshield(vector lab)的 5 mg/L DAPI(4’, 6-diamidino-2-phenylindole)復(fù)染，熒光原位雜交信號觀察由Olympus BX53顯微鏡完成，利用DP70 CCD照相裝置俘獲圖像，運(yùn)用Photoshop CS 10.0軟件進(jìn)行測量和圖像處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 具翼煙草的根尖有絲分裂細(xì)胞染色體的核型分析

4個(gè)具翼煙草收集系根尖細(xì)胞有絲分裂染色體觀察結(jié)果表明，具翼煙草系二倍體，染色體組共18條染色體，2n=2x=18。從圖1和表1可以看出：具翼煙草染色體較小，絕對長度為1.68 ～ 4.76 μm，相對長度為3.80 ~ 10.76。不同收集系的核型具有一定的差異：9001-10的核型公式為2n = 2x = 12m + 6st，第5、6、7號同源染色體為近端部著絲粒染色體，其余為中部著絲粒染色體，染色體臂比的變異幅度為1.05~5.25，平均臂比值為2.19，最長與最短染色體之比為2.17，屬2B型。9201-5的核型公式為2n = 2x =12m + 2sm + 4st，第6號同源染色體為近中部著絲粒染色體，第5、7號同源染色體為近端部著絲粒染色體，其余為中部著絲粒染色體，染色體臂比的變異幅度為1.15~3.02，平均臂比值為1.84，最長與最短染色體之比為2.83，屬2B型。9255-6的核型公式為2n= 2x = 6m + 6sm + 6st，第2、3、4號同源染色體為近中部著絲粒染色體，第5、6、7號染色體為近端部著絲粒染色體，其余為中部著絲粒染色體，染色體臂比的變異幅度為1.25~4.75，平均臂比值為2.37，最長與最短染色體之比為1.93，屬2A型。9262-6的核型公式為2n = 2x = 8m + 4sm +6st，第3、4號同源染色體為近中部著絲粒染色體，第5、6、7號同源染色體為近端部著絲粒染色體，其余為中部著絲粒染色體，染色體臂比的變異幅度為1.05~4.95，平均臂比值為2.27，最長與最短染色體之比為1.76，屬2A型。

4個(gè)具翼煙草收集系根尖細(xì)胞有絲分裂中期染色體平均核型為2n = 2x = 12m + 6st，第5、6、7號同源染色體為近端部著絲粒染色體，其余為中部著絲粒染色體，染色體臂比的變異幅度為1.14~4.22，平均臂比值為2.17，最長與最短染色體之比為2.16，屬2B型。

圖1 4個(gè)具翼煙草收集系根尖有絲分裂中期染色體及其配對1標(biāo)尺=3 μmFig.1 Karyotype and pairing of metaphase chromosomes of four N.alata population plants 1 bar=3 μm

2.2 具翼煙草根尖細(xì)胞有絲分裂中期染色體的C帶分析

具翼煙草根尖細(xì)胞有絲分裂中期染色體經(jīng)BSG法處理后，獲得的C分帶譜帶清晰。圖2的A、B和C分別為具翼煙草根尖細(xì)胞C顯帶染色體中期細(xì)胞相、C顯帶中期核型、C顯帶核型模式圖，C顯帶的類型和數(shù)目統(tǒng)計(jì)見表2。具翼煙草根尖細(xì)胞中期染色體C帶有著絲粒帶、端帶和中間帶3種類型，無隨體帶。著絲粒帶、端帶和中間帶分別顯示了7條、15條和3條，共25條。9對同源染色體均有條帶顯示，其中第1號同源染色體顯帶最豐富，顯示4條帶，第2、3、4、5和8號同源染色體顯帶數(shù)目次之，顯帶3條，第6、7和9號同源染色體顯帶最少，僅顯示2條帶。結(jié)果表明，具翼煙草根尖細(xì)胞有絲分裂中期染色體C帶豐富，多態(tài)性良好，同源染色體間C帶有一定的差異，為單染色體鑒定提供一定的依據(jù)。

圖2 具翼煙草根尖中期染色體C帶及其模式圖Fig. 2 C-banding and its idiogram of mitotic metaphase chromosomes of root tip cells in N. alata

表1 4個(gè)具翼煙草收集系根尖細(xì)胞有絲分裂中期染色體核型參數(shù)Tab. 1 Karyotype parameters of metaphase chromosomes of root tip cells of four N. alata population plants

表2 具翼煙草有絲分裂中期染色體C帶與45S和5S rDNA染色體定位Tab. 2 C-banding and chromosomal location of 45S and 5S rDNA of mitotic metaphase chromosomes in N. alata

2.3 具翼煙草的根尖細(xì)胞中期染色體的45S和5S rDNA物理定位

圖3-A為分別用生物素標(biāo)記的5S rDNA和地高辛標(biāo)記的45S rDNA探針與具翼煙草根尖細(xì)胞中期染色體的熒光原位雜交結(jié)果，紅色信號顯示為5S rDNA位點(diǎn)的位置，綠色信號顯示為45S rDNA位點(diǎn)的位置。圖3-B是依據(jù)熒光原位雜交信號的位置和數(shù)目建立的具翼煙草45S和5S rDNA基因位點(diǎn)FISH核型模式圖。結(jié)果顯示具翼煙草中期染色體細(xì)胞相顯示有2對紅色信號(5S rDNA基因位點(diǎn))和3對綠色信號(45S rDNA基因位點(diǎn))。3對45S rDNA基因位點(diǎn)分別位于IS、IIIS、VL上，2對5S rDNA基因位點(diǎn)分別位于IL、IVS上(L和S分別代表染色體長臂和短臂，羅馬數(shù)字代表同源染色體序號，下同)。雜交結(jié)果還顯示，在3對45S rDNA基因位點(diǎn)的雜交信號中，IS處的信號最強(qiáng)，而在2對5S rDNA基因位點(diǎn)的雜交信號中，IL處的信號最強(qiáng)(圖3-A)。在第1對同源染色體上同時(shí)存在45S rDNA和5SrDNA基因位點(diǎn)。

圖3 具翼煙草根尖中期染色體45S和5S rDNA染色體定位及其模式圖Fig. 3 Chromosomal location of 45S and 5S rDNA and its diogram of mitotic metaphase chromosomes of root tip cells in N. alata

3 討論

3.1 具翼煙草的核型

關(guān)于煙草的核型分析，一直以來盡管有不少學(xué)者進(jìn)行了這方面的研究[21-23]，但由于煙草染色體微小和當(dāng)時(shí)技術(shù)水平的限制，一直未能獲得準(zhǔn)確可靠的結(jié)果[12]。至今為止，普通煙草仍未見標(biāo)準(zhǔn)核型報(bào)道[12]，野生煙草種類更是缺乏核型分析方面的研究，這給煙草細(xì)胞遺傳學(xué)的進(jìn)一步深入開展造成了困難。本研究首次報(bào)道了運(yùn)用去壁低滲法開展了具翼煙草4個(gè)不同收集系的核型分析，結(jié)果顯示具翼煙草4個(gè)不同收集系間的核型存在明顯的差異，平均核型為2n = 2x = 12m +6st，染色體臂比的變異幅度為1.14~4.22，平均臂比值為2.17，最長與最短染色體之比為2.16，屬2B型。研究結(jié)果為該野生種質(zhì)資源開發(fā)利用和煙草屬的遺傳進(jìn)化等研究提供了基礎(chǔ)資料。

植物核型演化的大致趨勢是由對稱至不對稱，具有較對稱核型的物種在系統(tǒng)演化上大多屬于比較古老或原始的物種，而進(jìn)化上較高級的物種常常為不對稱核型[18]。本研究結(jié)果顯示具翼煙草核型屬于2B對稱性核型，暗示其在系統(tǒng)演化上是相對原始的種類，這與前人在煙草其他種類上研究結(jié)果一致[11-15,21-23]。煙草在系統(tǒng)演化上是一個(gè)極其復(fù)雜的一個(gè)類群，染色體數(shù)目異常復(fù)雜[11-15,21-23]。Goodspeed等和Smith基于煙草60余種中有27個(gè)種X=12，12個(gè)種X=24，二者之和占總種數(shù)的60%，推斷該屬的染色體基數(shù)或形式上的染色體基數(shù)為X=12，24對染色體的種可能都是雙二倍體起源的，2n=24或2n=48的整倍體種可能是由于發(fā)生了個(gè)別或一些染色體丟失，從而形成了2n = 18，20 或 2n = 28，32，36，38，40，42，44 和46 的非整倍體種[11]。本文報(bào)道的具翼煙草(2n=18)核型為該屬植物的染色體組進(jìn)化提供了重要的資料，但要闡明該屬植物染色體的系統(tǒng)進(jìn)化還需要大量的深入研究，尤其是針對關(guān)鍵種的研究。

3.2 具翼煙草rDNA染色體物理定位與單染色體鑒定

真核生物的核糖體基因(rDNA)是一個(gè)串聯(lián)的多基因家族，在進(jìn)化過程中相當(dāng)保守，可以分布在染色體組中一對或幾對同源染色體上[24]。大量研究結(jié)果顯示，5S rDNA位點(diǎn)在染色體上的位置以及拷貝數(shù)在進(jìn)化過程中相當(dāng)保守[25-27]，而45S rDNA位點(diǎn)不管是在染色體上的分布還是拷貝數(shù)在進(jìn)化過程中都是較易發(fā)生變化[25]。雜交、染色體不等交換、重排、隱蔽rDNA拷貝數(shù)等都可能導(dǎo)致染色體組rDNA位點(diǎn)和數(shù)目發(fā)生變化[20,26-27]。本研究首次報(bào)道了具翼煙草45S和5S rDNA的雙色熒光原位雜交染色體物理定位研究。結(jié)果顯示具翼煙草根尖細(xì)胞有絲分裂中期染色體組具有較豐富的rDNA基因位點(diǎn)，有3對45S rDNA基因位點(diǎn)和2對5S rDNA基因位點(diǎn)分布。煙草在其悠久的栽培歷史和廣泛的傳播過程中大量的雜交和對不同自然生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)變異，可能導(dǎo)致了其染色體組rDNA位點(diǎn)多態(tài)性增加。因此廣泛的煙草屬植物rDNA物理定位研究將是開展普通煙草起源進(jìn)化、染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)分析、遺傳育種等領(lǐng)域研究的十分重要途徑。

單染色體鑒定是植物細(xì)胞遺傳、染色體輔助育種等領(lǐng)域研究的重要前提。運(yùn)用三代基因測序技術(shù)，開展單染色體基因測序和作圖，將對物種的基因工程、分子輔助育種、遺傳與進(jìn)化等研究具有極其重要意義[23]。由于煙草染色體微小、同源染色體間差異不明顯，傳統(tǒng)核型分析難以區(qū)分單染色體嚴(yán)重阻礙了其在煙草種質(zhì)創(chuàng)新和分子輔助育種等領(lǐng)域的應(yīng)用[23]。近年來，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，染色體的精細(xì)研究得到了長足發(fā)展，特別是熒光原位雜交技術(shù)的出現(xiàn)。熒光原位雜交技術(shù)已在許多染色體微小、難以區(qū)分的物種中得到應(yīng)用，取得了良好的效果[20,24-27]。本研究基于熒光原位雜交技術(shù)首次成功將具翼煙草45S和5S rDNA進(jìn)行染色體物理定位，并結(jié)合傳統(tǒng)核型分析和Giemsa C帶特征，將具翼煙草9對同源染色體進(jìn)行區(qū)分，為煙草單染色體測序作圖以及進(jìn)一步的細(xì)胞遺傳學(xué)、遺傳育種等研究開辟了一條重要的途徑。

4 結(jié)論

1）研究首次報(bào)道了具翼煙草4個(gè)收集系的核型分析和45S、5S rDNA的雙色熒光原位雜交染色體物理定位研究。

2）具翼煙草4個(gè)收集系的平均核型為2n = 2x =12m + 6st，染色體組rDNA基因位點(diǎn)較豐富，有3對45S rDNA基因位點(diǎn)和2對5S rDNA基因位點(diǎn)分布。

3）研究結(jié)果對煙草屬系統(tǒng)起源、遺傳進(jìn)化以及遺傳育種等領(lǐng)域的進(jìn)一步研究具有重要的參考價(jià)值，但要闡明該屬植物染色體的系統(tǒng)進(jìn)化還需要大量的深入研究，尤其是針對不同染色體基數(shù)關(guān)鍵種的研究。

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：WANG Linjiao, REN Xueliang，SHENG Maoyin, et al. Study on karyotype, C-banding and rDNA chromosome locus in Nicotiana alata [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2017, 23(1)

*Corresponding author. Email：shmoy@163.com

Study on karyotype, C-banding and rDNA chromosome locus in Nicotiana alata

WANG Linjiao1,2，REN Xueliang3，SHENG Maoyin1,2*，DU Jiaying1，WEN Peicai1
1 Karst Research Institute, Guizhou Normal University, Guiyang 550001, China;2 National Engineering Research Center for Karst Rocky Desertification Control, Guiyang 550001, China;3 Institute of Guizhou Tobacco Science, Guiyang 550081, China

The karyotype, C-banding, and chromosome locus of 45S and 5S rDNA of Nicotiana alata were studied by methods of wall digestion and hypotonic treatment, BSG, and double color fl uorescent in situ hybridization, respectively. Karyotype analysis of root tip cells of four N. alata accessions showed that the average karyotype formula was 2n = 2x = 12m + 6st, the variation and average value of arm ratio was 1.14～4.22 and 2.17, respectively. The rate of the longest and minimum chromosome was 2.16, and the karyotype classi fi cation was 2B of Stebbins system (1971). Results of C-banding study showed that chromosome C-banding of N. alata was abundant with 25 bands being displayed, including 7 centromeric bands, 15 terminal bands, and 3 intercalary bands. Results of FISH study showed, in metaphase chromosomes of root tip cell of N. alata, there were three pairs of 45S rDNA loci, locating on IS, IIIS, and VL, respectively (L and S represented chromosome long and short arm respectively, and the Roman number indicated chromosomes serial number; the same hereinafter), and two pairs of 5S rDNA loci, locating on IL and IVS, respectively. Pair I of homologous chromosome had loci of both 45S and 5S rDNA. These results could provide reference for studies on phylogenesis of genus Nicotiana, and were of great signi fi cance to genetic breeding and germplasm innovation in tobacco.

Nicotiana; karyotype; chromosome; FISH; C-banding

王霖嬌，任學(xué)良，盛茂銀，等. 具翼煙草(Nicotiana alata)核型、C帶與rDNA染色體定位研究[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2017,23（1）

煙草行業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目(中煙辦[2014]5號)，國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目課題(2016YFC0502603)，貴州省社會發(fā)展攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(黔科合SZ字[2014]3036號)

王霖嬌（1982—），碩士，講師，研究方向：植物資源開發(fā)利用，Tel：0851-86690478，Email: wlj111717@163.com

盛茂銀（1980—），博士，教授，研究方向：喀斯特植物資源開發(fā)利用，Tel：0851-86690478， Email: shmoy@163.com

2016-08-01；< class="emphasis_bold">網(wǎng)絡(luò)出版日期：

日期：2017-01-25